使用中性毛细管进行单克隆抗体亚型的毛细管电泳分离

摘要

本文介绍了一种全面的毛细管区带电泳方案，用于评估单克隆抗体作为质量属性的内在理化异质性。

摘要

生物治疗用蛋白质，例如单克隆抗体（mAbs），是治疗慢性退行性疾病可行的替代方案。这些蛋白质的生物活性取决于其理化性质。已有文献报道采用色谱和毛细管电泳等高效技术来分析单克隆抗体的理化异质性。目前，毛细管区带电泳（CZE）技术已成为分析生物大分子最具分辨力和灵敏度的方法之一。此外，CZE中的电驱动分离基于物质的广延性质，其优势在于能够接近蛋白质天然状态进行分析。然而，该技术在常规分析中的成功应用，依赖于分析人员在样品和系统制备关键步骤中的操作技能。本教程旨在详细说明成功实施单克隆抗体CZE分析的各个步骤。此外，本方案也可用于提升蛋白质分析化学实验室相关人员的技术能力与操作水平。

引言

单克隆抗体（mAbs）是一类生物治疗性蛋白质，因其能够作用于多种慢性及退行性疾病而日益受到关注¹。与其他生物分子类似，mAbs 在其生命周期的各个阶段（即从生物合成到最终产品）都容易发生多种理化修饰。这些修饰包括但不限于：脱酰胺、糖基化、氧化、环化、异构化、聚集以及蛋白水解切割²。因此，需要具备分辨内在异构体能力的分析技术，以监测 mAbs 的异质性和稳定性，从而建立质量标准。

毛细管电泳（CE）是一种在窄径熔融石英管内进行的高性能分离技术（µm范围）内填充背景电解质（BGE）。在施加电场（最高30,000 V）后，带电分子向带相反电荷的电极迁移即，电驱动分离）。毛细管电泳（CE）中高电压的使用可实现快速分析并提高效率，优于传统的凝胶电泳。毛细管区带电泳（CZE）是一种基于CE的技术，已在生物制药行业 routinely 用于产品质量评估^3-9. 与其他模式的毛细管电泳（CE）不同例如毛细管凝胶电泳、毛细管等电聚焦）或基于色谱的方法相比，CZE 可在不使用变性剂或固相界面的情况下进行，从而实现对单克隆抗体固有异质性的分析，且更接近其天然状态¹⁰. mAb 异构体的 CZE 分离在涂覆有亲水性聚合物的熔融石英毛细管（中性毛细管）内进行，基于各组分不同的电泳迁移率，后者由电荷、质量、大小和形状（或流体动力学体积）决定^11....

方案

1. 溶液的配制

1. 制备BGE溶液。
   1. 配制100 ml溶液，其中含0.05% (m/v) 羟丙基甲基纤维素（HPMC）、200 mM ε-氨基正己酸（EACA）和30 mM醋酸锂。
      注意：由于HPMC是一种黏弹性聚合物，应先将粉末倒入玻璃烧杯中，加入80 mL水，最后放入搅拌子。随后按常规方法加入其余试剂。操作醋酸锂时需佩戴护目镜，因其可能引起眼部刺激。
   2. 用50% (v/v) 乙酸将pH值调节至4.8 ± 0.1。静置溶液5分钟，必要时再次调节pH。
   3. 加水定容至100 ml容量瓶中的最终体积。
   4. 使用孔径为0.2 µm的亲水性膜过滤。
   5. 2–8 °C下保存，最多可保存7天。
2. 制备内标溶液。
   1. 配制1 mL含1% (m/v) 组胺的溶液。
   2. 使用孔径为0.2 µm的亲水性膜过滤。
   3. 2–8 °C下保存，最多可保存1天。

2. 样品制备

1. 用Tris缓冲液（50 mM 三（羟甲基）氨基甲烷，pH 8.0）将单克隆抗体样品稀释至终浓度为1 mg/ml，制备180 µl的稀释样品。
2. 加入....

结果

图2 显示了200 mM EACA、30 mM 醋酸锂、pH 4.8的BGE中抗TNFα单克隆抗体样本（用Tris缓冲液（50 mM，pH 8.0）稀释）的典型电流曲线。如图所示，在整个分析过程中电流保持稳定，可在30至 35 µA. 图3 显示了空白样品的CZE电泳图，其中检测到的峰对应于组胺内标物。组胺的迁移时间预期为3.7至4.1 min。 图4 显示了抗TNFα单克隆抗体的CZE电泳图。可以看出，主峰前后均伴有强度较小的峰。由于分离是在正常极性条件下进行的即从正极到负极，分析结果显示碱性亚型（带正电荷的单克隆抗体变体）比主亚型迁移更快，而酸性亚型（带负电荷的单克隆抗体变体）迁移更慢。

讨论

在本教程中，我们强调了在进行单克隆抗体（mAbs）毛细管区带电泳（CZE）分析时遵循正确操作规范的重要性，以提高实验成功的可能性。然而，当CZE被常规使用时，问题不可避免地会出现¹²。

为获得最佳结果，必须遵循实验方案中各处包含的注意事项，这些提示有助于分析人员克服困难步骤并进行故障排除。在特定条件下获得最佳分离效果的关键因素之一是背景电解质（BGE）溶液的正确配制。该过程需要严格控制缓冲剂的离子强度、非缓冲添加剂的浓度以及pH值。总体而言，毛细管电泳（CE）系统需要精心操作和注重细节。如果忽略与系统清洗或组装相关的任何步骤，系统可能很容易受损。

本方法采用中性毛细管。与未处理的熔融石英毛细管不同，中性毛细管可减少蛋白质在毛细管内壁上的吸附，从而提高分离效率、准确性和重复性⁹。然而，其使用受限于可进行的进样次数。根据我们的经验，可在不影响分离分辨率的情况下完成120至150次进样，此后因内壁涂层逐渐降解而达到使用寿命。一旦毛细管达到此限值，即需更换新的毛细管。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
冰醋酸	Tecsiquim	AT0035-7
ACS级盐酸	J.T. Baker	9535-05
组胺二盐酸盐	Fluka	53300
(羟丙基)甲基纤维素	Fluka	09963
醋酸锂	Sigma-Aldrich	517992
6-氨基己酸	Sigma-Aldrich	A2504
eCAP Tris缓冲液，50.0 mM，  pH 8	Beckman Coulter	477427
PA 800 Plus 药物分析系统	Beckman Coulter	A66528
eCAP 中性毛细管	Beckman Coulter	477441
微量小瓶，200 µl	Beckman Coulter	144709
通用瓶盖	Beckman Coulter	A62250
通用小瓶	Beckman Coulter	A62251
光学电缆，紫外/可见光	Beckman Coulter	144093
紫外/可见光检测模块	Beckman Coulter	144733
空白盒装配工具包	Beckman Coulter	144738