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方法文章

Staphylococcus aureus中水平基因转移研究的方法学

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DOI：

10.3791/55087

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2017年3月10日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Biomedical Science, Faculty of Medicine, University of Tsukuba, 2Department of Basic Biomedical Science, Universidad Europea de Madrid, 3Human Biology Program, School of Integrative and Global Majors, University of Tsukuba, 4Laboratory of Nosocomial Infections, Department of Bacteriology, Centro Nacional de MicrobiologÍa, Instituto de Salud Carlos III, 5Division of Microbiology, Department of Medicine, School of Medicine, Universidad Complutense, 6Biology of Gram-Positive Pathogens, Department of Microbiology, Institut Pasteur, Paris, France, 7ERL3526, CNRS, Paris, France

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们在此描述三种不同的方案 体外 接合、转导和自然转化的研究 金黄色葡萄球菌

摘要

一种重要机会性人类病原体的关键特征 金黄色葡萄球菌 其非凡的能力是迅速获得对抗生素的耐药性。基因组学研究显示 S. aureus 携带许多位于可移动遗传元件上的毒力基因和耐药基因，表明水平基因转移（HGT）在其中发挥关键作用 S. aureus 进化。然而，目前尚缺乏对用于研究水平基因转移（HGT）的方法学的完整而详细的描述。 S. aureus 仍然缺乏，尤其是在自然转化方面，最近才在该细菌中报道了这一现象。本研究描述了三种适用于该细菌的实验方案 体外 HGT 研究 S. aureus：接合、噬菌体转导和自然转化。为此目的，该 cfr 基因（氯霉素/氟苯尼考抗性），该基因赋予分型酚类、林可酰胺类、噁唑烷酮类、截短侧耳素类和链阳性菌素A（PhLOPSA）抗性表型，被用于研究其作用机制。 S. aureus 将遗传物质转移至其他菌株的能力对于理解耐药性的快速获得至关重要，有助于阐明监测项目中报告的传播模式，或进一步预测未来的扩散方式。

引言

Staphylococcus aureus 是一种共生的革兰氏阳性细菌，天然定植于人类和动物的皮肤及鼻腔。该菌种是医院和医疗机构中院内感染的主要致病原因。此外，其对多种抗菌化合物产生耐药性的能力，已使由该细菌引发的感染的防控成为全球性关注的问题。

目前已知有两种主要途径参与耐药表型的传播：耐药基因型的克隆扩散以及遗传决定因子在细菌群体中的传播。对于S. aureus而言，已发现多种抗生素耐药基因（以及毒力决定因子）与可移动遗传元件（MGEs）相关1。这些元件存在于S. aureus基因组中，表明遗传物质在细菌群体内的获得与转移可能在S. aureus的适应与进化过程中发挥重要作用。

遗传物质可以通过革兰氏阳性菌中三种已知的水平基因转移（HGT）机制进行交换：转化、接合和噬菌体转导。转化涉及游离DNA的摄取。为了获得外源DNA，细菌细胞需要发育至一种特殊的生理阶段：感受态阶段。当达到这一阶段时，感受态细胞能够将DNA转运至细胞质中，从而获得新的遗传决定因子。对于S. aureus而言，其天然转化能力的存在最近已被证实2。与此一致的是，我们课题组揭示了SigH因子（一种隐匿性的二级转录σ因子）在感受态发育阶段中的表达重要性，并阐明了其组成型表达可使S. aureus进入感受态阶段，从而通过天然转化获得耐药表型2。

接合是一种将DNA从一个活细胞（供体）转移到另一个细胞（受体）的过程。两个细胞必须直接接触，使DNA在特殊结构（如管状或孔状结构）的保护下进行交换。通过此方法转移DNA需要接合装置的参与。在S. aureus中，典型的接合质粒是PGO1，其含有接合操纵子TraA3。

噬菌体转导是指通过噬菌体感染将DNA从一个细胞转移到另一个细胞的过程，其中细菌DNA被包装进入噬菌体衣壳，而非病毒DNA。大多数S. aureus分离株都被噬菌体溶原化1。在应激条件下，前噬菌体可从细菌基因组中切除并转入裂解周期。

这些是 S. aureus 中三种广为人知的 DNA 转移机制。此外还存在一些其他转移机制，例如"拟转化"2 以及在毒力岛转移中的噬菌体样系统4。最近，有研究团队报道了"纳米管"参与邻近细胞间细胞物质（包括质粒 DNA）的转移5,6，但截至目前，其他研究团队尚未发表后续验证研究。

本研究提供了用于探讨金黄色葡萄球菌（S. aureus）中水平基因转移（HGT）的必要方法，涵盖了三种主要的转移途径：接合、转导和自然转化。这些方法所得结果已被用于研究cfr基因（氯霉素/氟苯尼考耐药基因）在S. aureus菌株间的传播7。这三种技术是研究S. aureus中可移动遗传元件（MGE）传播的多功能工具。

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方案

注意：本研究所使用的菌株和材料分别列于表1和材料表中。在传播实验中，使用N315和COL的cfr阳性衍生株作为cfr基因的供体菌株（N315-45和COL-45）。这些菌株此前通过接合实验获得，供体菌为一株临床分离的携带cfr基因的Staphylococcus epidermidis菌株（ST2），接合操作按照标准接合实验方案进行（见下文）。该菌株携带的cfr基因位于一种pSCFS7样质粒上7。

1. 使用滤膜交配法进行接合

注意：以携带cfr基因的S. aureus N315菌株（N315-45）7（CmR）作为供体，COL8或Mu509菌株（TetR，CmS）作为受体。能够在含32 mg/L氯霉素加8 mg/L四环素的培养基中生长的双抗性菌落（TetR，CmR）被视为疑似接合子，通过菌落PCR检测cfr基因的存在，并测定其受体菌的药物敏感性谱型。

  1. 按照先前描述的方案进行接合实验10，并进行若干修改：
    1. 分别在胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基中制备5 mL供体和受体菌的过夜培养物（供体加32 mg/L氯霉素，受体不加），于37 °C振荡培养。
    2. 用新鲜TSB培养基将过夜培养物的光密度（OD600）调整至1（OD600 = 1.0）。取0.5 mL供体菌培养物（N315-45）与0.5 mL受体菌培养物（COL或Mu50）混合，再向混合液中加入1 mL PBS。
    3. 使用真空泵系统将细菌混合液转移至0.45 µm滤膜上。
    4. 将滤膜置于羊血琼脂平板上，于37 °C孵育1天。
      注意：此步骤需使用富集培养基，以支持双重抗性菌的生长。
    5. 从平板上取出滤膜，悬浮于10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，充分涡旋振荡，以回收滤膜上附着的所有细菌。
    6. 用新鲜TSB对细菌悬液进行10倍系列稀释。取0-10-4稀释度的样品各100 µL，接种于添加了32 mg/L氯霉素和8 mg/L四环素的TSB琼脂（TSA）平板上，用于筛选转接合子；取10-5-10-6稀释度的悬液各100 µL，接种于仅含8 mg/L四环素的TSA平板上，用于计数受体菌总数。将平板于37 °C孵育18–24小时。
    7. 通过菌落PCR7检测双重抗性菌落（疑似转接合子）中cfr基因的存在，并分析其药敏谱（抗菌图谱）。
    8. 根据标准微量稀释法或纸片扩散法11测定最小抑菌浓度（MICs），确定抗菌图谱。转接合子的药敏谱应与受体菌一致，仅氯霉素（以及cfr基因影响的其他化合物）除外。此步骤至关重要，用以排除供体菌株自身产生的四环素抗性。

2. 噬菌体转导

注意：转导实验中使用了属于长尾噬菌体科（Siphoviridae）的噬菌体 MR83a（实验室保存菌株）。以 N315-45 作为 cfr 基因的供体用于噬菌体感染，受体菌则为 N315、COL 或 Mu50 菌株。通过受体菌株在含 32 mg/L 氯霉素的培养基中生长的能力来确定其是否获得 cfr 基因。在此条件下生长的菌落进一步通过菌落 PCR 检测 cfr 基因的存在，并分析其药敏谱型以排除潜在污染。

  1. 在供体菌上扩增噬菌体
    1. 在37 °C、180 rpm振荡条件下，用5 ml添加了3.6 mM Ca2+的营养肉汤（NBCaCl2）培养N315-45过夜。
      注意：噬菌体感染需要钙离子。参见材料表。其他公司的营养肉汤可能存在诸如钙沉淀等问题。
    2. 将过夜培养物按1:1,000稀释至终体积为10 mL的NBCaCl2中，分装于50 ml玻璃烧瓶或玻璃小瓶中。在37 °C、180 rpm振荡条件下培养细菌1小时。
    3. 用NBCaCl2培养基对噬菌体MR83a进行系列稀释（10-2、10-3、10-4、10-5和10-6）。向细菌培养物中加入20 µl稀释后的噬菌体。同时设置一个未加噬菌体的对照培养物，作为细菌生长的阳性对照，并可用于次日测定噬菌体滴度。
    4. 在37 °C、轻度振荡（100 rpm）条件下培养过夜。
      注意：当感染的噬菌体未过量时，细胞会一定程度生长，随后因噬菌体通过裂解循环扩增而进入裂解阶段。未加噬菌体的培养物将完全生长，而加有噬菌体的培养物则表现出不同程度的透明化。
    5. 选择一至两个噬菌体稀释度最高且培养液澄清的小瓶。
    6. 将培养物转移至15 ml离心管中，加入250 µl氯仿，通过反复倒置充分混匀。
    7. 在4 °C下以5,000 x g离心20分钟。
    8. 将上清液转移至新管中，4 °C保存备用。
      注意：噬菌体至少可稳定数月，但长期储存会导致滴度和转导效率下降。
  2. 测定噬菌体滴度（噬菌斑测定法）
    1. 制备营养肉汤琼脂（1.5%琼脂）培养基，置于55 °C水浴中保温。向培养基中加入经高压灭菌的0.5 M CaCl2溶液，使其终浓度为3.6 mM。倾注至90 mm培养皿中（NBCaCl2平板）。
    2. 在37 °C、振荡条件下，用5 ml NBCaCl2培养N315过夜；也可使用上述步骤2.1.3中所述的对照培养物替代。
    3. 将10 µl过夜培养物加入200 µl NBCaCl2中，均匀涂布于NBCaCl2平板表面。当液体覆盖整个平板表面时停止涂布，静置晾干。
    4. 使用NBCaCl2培养基对先前制备的噬菌体（步骤2.1.8）进行10倍系列稀释（从10-5至10-10）。
    5. 将每种噬菌体稀释液各3 µl点样于已涂布细菌的平板上。
    6. 在30 °C下培养过夜。
    7. 计数噬菌斑数量，并按以下公式计算噬菌体滴度：噬菌斑形成单位（pfu）/ml = 噬菌斑数 × 稀释倍数 / 点样体积（3 × 10-3 ml）
  3. 噬菌体转导
    注意：使用前一步骤（2.1.8）制备的噬菌体混合液，检测cfr基因向S. aureus菌株的转导情况。本实验中，使用N315、COL或Mu50菌株作为受体菌。
    1. 在37 °C、180 rpm振荡条件下，用5 ml NBCaCl2培养N315、COL或Mu50过夜。
    2. 将噬菌体用NBCaCl2稀释至约109 pfu/mL。
    3. 在50 ml玻璃小瓶中混合500 µl过夜培养物、500 µl新鲜NBCaCl2和1 ml噬菌体（~109 pfu/ml）；预期感染复数（MOI）不得超过1。在37 °C、轻度振荡（100 rpm）条件下孵育30分钟。
      注意：在加入噬菌体前对受体细胞进行热处理（52 °C处理2分钟以灭活内源性限制性酶）可提高转导效率12。
    4. 加入50 µl 20% Na3-Citrate。继续在37 °C下轻度振荡30分钟。
      注意：Na3-Citrate作为中等强度的钙离子螯合剂。
    5. 制备熔化的脑心浸出液（BHI）琼脂（1.5%琼脂）培养基，并置于55 °C水浴中保温。
    6. 将细菌-噬菌体混合物转移至100 ml烧瓶中，加入50 ml含32 mg/L氯霉素的温热BHI琼脂，充分混匀后倾注至90 mm培养皿中。
      注意：该方法可检测少量生长的菌落（潜在转导子）。
    7. 在37 °C下培养24–48小时。
    8. 通过将菌落转移至含32 mg/L氯霉素的BHI琼脂平板上，进一步检测所获得菌落（转导子）的抗性。通过菌落PCR7确认cfr基因的存在。

3. 自然转化

注意：自然转化实验 S. aureus 按照我们之前研究中所述的方法进行2N315 衍生株 N2-2.12,7，用作受体。在此菌株中，该 sigH 基因座被重复，以实现SigH的组成型表达2有关分离表达 SigH 的感受态变异株的详细步骤，请参见之前的描述2如果要转移的抗性标记不是氯霉素，则使用 pRIT-sigH（CmR) 可用于表达SigH，如先前所述2纯化的质粒或全DNA提取物 cfr-获得的 S. aureus COL-457 用作转化的供体DNA。

  1. 供体DNA的制备
    1. 在含有50 mL添加32 mg/L氯霉素的TSB培养基的300 mL三角瓶中，于37 °C振荡培养COL-45过夜。同时培养携带pHY300 质粒(TetR)的E. coli HST04，用于提取质粒作为对照实验。
      注意：HST04 (dam-/dcm-)缺失DNA甲基化酶基因13。其他常规含有DNA甲基化酶的菌株也可用于制备供体DNA，因为DNA甲基化状态不影响转化效率。此外，从S. aureus COL菌株中纯化的pT181质粒也可作为转化实验的阳性对照2。
    2. 通过离心收集细胞（4 °C，8,000 x g，10分钟）。
    3. 使用质粒DNA提取试剂盒或常规DNA纯化方法提取并纯化质粒DNA或总DNA。
    4. 使用分光光度计定量纯化的DNA，并于4 °C保存备用。
      注意：转化实验应使用新鲜制备的DNA，通常不超过一周。陈旧的DNA样品会降低转化效率。
  2. 转化实验
    1. 将受体菌株（N2-2.1）在5 mL TSB培养基中，于37 °C振荡培养过夜。
    2. 取0.5 mL过夜培养物转移至1.5 mL离心管中，离心沉淀细胞（4 °C，10,000 x g，1分钟）。
    3. 用10 mL CS2培养基重悬细胞，置于50 mL离心管中。
      注意：CS2培养基是一种完全合成培养基，可诱导S. aureus产生自然感受态2（参见材料表中的培养基成分）。其他标准实验室培养基，如TSB或BHI，不适合用于转化2,13。
    4. 将细菌在37 °C振荡（180 rpm）培养至对数生长后期（约8小时）。
    5. 离心收集细胞（4 °C，5,000 x g，5分钟）。
    6. 用10 mL新鲜CS2培养基重悬细胞。
    7. 向细胞悬液中加入10 µg纯化的质粒或基因组DNA（步骤3.1.4）。在37 °C、180 rpm条件下振荡孵育2.5小时。
      注意：与DNA共孵育时间较短（<2.5小时）会导致转化频率降低。
    8. 离心收集细胞（4 °C，5,000 x g，5分钟）。
    9. 将细胞重悬于10 mL BHI培养基中，然后将细胞悬液与90 mL已融化并预热至55 °C的BHI琼脂（添加32 mg/L氯霉素，或在对照实验中添加5 mg/L四环素）混合均匀，倒入90 mm培养皿中。迅速冷却并使琼脂凝固。
    10. 将平板在37 °C培养2天。
    11. 使用牙签将产生的菌落（转化子）转移至含相应抗生素的新BHI琼脂平板上进行划线传代，以确认其抗性特征。通过菌落PCR确认获得的抗性基因（cfr或tetM）7。

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结果

此处展示的结果此前已发表（经出版方许可改编自参考文献7）。我们通过研究三种水平基因转移（HGT）机制，探讨了导致低水平利奈唑胺耐药并表达PhLOPSA耐药表型14,15的cfr基因在S. aureus菌株中的潜在传播途径。

图1 展示了接合实验中获得的结果。该接合实验方案适用于种间传递（A）以及种内传递（B），在不同接合供体中使用相同的接合载体可获得相似的结果。接合效率以 N 表示º 接合子数量（菌落形成单位，或CFU/ml）/Nº 受体细胞的菌落形成单位（CFU/ml）。所获得的频率范围为 1 x 10-6 至 1 × 10-5，使用相似数值时 S...

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讨论

本研究描述了三种用于研究金黄色葡萄球菌（S. aureus）中遗传决定因子水平基因转移（HGT）的主要方法。尽管转导和接合转移已研究数十年，但自然转化的存在直到最近才被确认2。因此，S. aureus 具备所有三种主要的HGT方式，需对这三种方式均进行检测，以明确遗传决定因子可能的传播途径。本研究的目的是汇编完整的实验方案，并提供先前已发表研究中所用方法的实用信息7。尽管接合转移和转导的实验方案已有报道，但本文是首次详细描述转化实验方案的论文.

采用滤膜接合方法进行接合是一种简单且可应用于研究不同细菌物种间接合转移的技术7,10。通过使用标准化的接种物，受体菌在18–24小时后的数量可达约109 CFU/mL。转化子数量具有变异性，且数值表现出明显的菌株依赖性，但通常在接合结果为阳性时，转化子数量...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作部分得到了武田科学基金会、辉瑞学术贡献以及日本学术振兴会外国研究人员博士后奖学金（FC）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
胰蛋白胨大豆肉汤（TSB） Becton Dickinson 211825
脑心浸出液（BHI）Becton Dickinson 211059
营养肉汤 No. 2OxoidCM0067
绵羊血琼脂Eiken Chemical Co.,Ltd.E-MR96根据生产商说明，在胰蛋白胨大豆琼脂中添加5%（v/v）绵羊血制成。 
琼脂粉和光纯药工业010-08725
柠檬酸钠（二水合三钠柠檬酸盐）和光纯药工业191-01785
纤维素酯网格0.45 μm HAWG 滤膜Merck MiliporeHAWG 02500
QIAfilter 质粒中量提取试剂盒QIAGEN12243

参考文献

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