杀虫剂的评估通常针对成虫，而非幼期阶段。本文介绍了一种评估杀虫剂对床虫卵作用效果的实验方案，并与床虫第一龄若虫阶段进行比较。这些方案可经调整后用于其他昆虫，以评估杀虫剂在非成虫生活阶段的防治效果。
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摘要
摘要
针对害虫的杀虫剂标准毒性评估主要在成虫阶段进行。评估依据剂量-反应或浓度-反应曲线，即随着杀虫剂剂量或浓度的增加，死亡率也随之上升。标准致死浓度（LC50）和致死剂量（LD50）测试旨在使测试种群达到50%的死亡率，但在评估杀虫剂对非成虫昆虫阶段（如卵、低龄若虫或若虫期）的毒性时可能面临挑战。然而，这些信息对于全面了解杀虫剂在所有床虫生活史阶段中的效果至关重要，直接影响防治与处理措施的有效性。本实验方案采用经改良的标准浸渍法测定床虫卵的毒性，并结合接触杀虫剂生物测定法处理一龄若虫。这些测定方法可生成浓度-反应曲线，从而进一步量化杀虫剂评估中的LC50值。
引言
臭虫是一种重要的城市害虫，可导致人类宿主失血、皮肤刺激、失眠、抑郁和焦虑1,2,3,4,5,6。消灭和控制臭虫的费用高昂，通常需要害虫防治公司多次上门处理7。通常需要多次处理，原因是臭虫具有隐蔽行为，且杀灭难度较大。特别是臭虫卵难以控制，因其体积微小，且卵壳对胚胎具有保护作用。
目前，美国许多害虫防治公司普遍采用化学杀虫剂对住宅中的床虱进行处理。众所周知，床虱卵难以控制，因此许多公司采取间隔两周再次处理的方案8。这种做法可使床虱卵有足够时间孵化，从而让一龄若虫孵出，据称此时更易被杀虫剂杀死。然而，目前尚缺乏评估液态杀虫剂对床虱卵和一龄若虫杀灭效果的研究。
昆虫卵已被证实是除床虱外，城市害虫以及许多农业害虫中最难防治的发育阶段。这些防治困难大多归因于卵壳结构，但也有少数研究报道了昆虫卵对杀虫剂存在抗性。卵期抗性已在以下物种中得到证实： Triatoma infestans9, Pediculus humanus capitis10, Plutella xylostella11, Rhyzopertha dominica12, Cimex lectularius13，以及多种储藏物甲虫（即 Oryzaephilus surinamensis, Tribolium castaneum, Cryptolestes ferrugineus 和 Rhyzopertha dominica).14卵期及未成熟阶段抗药性的产生，以及杀虫剂穿透卵壳过程中存在的复杂因素， necessitates 针对这些生活史阶段开展杀虫剂 efficacy 生物测定。
本方案提供了测定杀虫剂对常见床 bugs（Cimex lectularius）卵期和一龄若虫期 efficacy 的逐步操作流程。这两种方案均为浓度-反应测定法，可用于量化 LC50 值。浓度-反应测定法常用于毒理学研究，但本方案已针对床 bug 卵群和一龄若虫的简便处理进行了优化。这些测定方法可适用于多种昆虫物种的卵及未成熟发育阶段。
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方案
注意：本实验方案包含两种分别用于处理臭虫卵和一龄若虫的杀虫剂检测方法。两种方案均使用相同的杀虫剂，但需对方案进行调整，以确保杀虫剂的有效暴露，并便于样本的操作。
1. 蚊卵浸渍杀虫剂测定法
- 从种群中取出已交配且充分摄食的成年雌性臭虫，将雌虫（5-10只）放入带有滤纸的培养皿中。至少设置十个重复，以确保获得足够数量的卵用于杀虫剂测定。每天检查雌虫是否已产卵。
- 一旦雌虫产卵，将其从培养皿（6 cm × 5 cm）中取出，并每日转移至新的带有新滤纸的培养皿中，同时在新旧培养皿上记录日期。
- 在开始测定前，让卵发育4至5天。由于胚胎发育期间对杀虫剂的敏感性会发生变化，因此控制卵的发育时间至关重要。所有虫态均应维持在12:12光暗周期、60%相对湿度和27 °C条件下。
- 当卵发育至合适阶段后，使用尖端柔软的镊子小心地将臭虫卵从滤纸上取下。用镊子轻轻刮除附着在滤纸上的卵底部，然后轻柔夹取卵，避免施加过大压力，以防卵弹出。
- 将取出的臭虫卵按组分别放入塑料培养皿中。为减少静电导致卵飞溅，可用织物柔顺纸擦拭每个培养皿外底面。每组臭虫卵（每组5-10粒卵）应同时处理。将每组视为一个重复，本实验至少使用五个（或更多）重复。
- 配制杀虫剂的系列稀释液，获得5种不同浓度（对于吡虫啉（0.1%）/β-氟氯氰菊酯（0.5%），浓度范围为0.21-21 µL/mL），并设置仅含溶剂（自来水）的对照组。每种浓度配制20 mL，以确保浸渍测定有足够的体积。
- 使用装有切割片附件的旋转工具，在50 mL离心管的35 mL刻度线处从中部横向切割，然后使用同一旋转工具配合氧化铝研磨石附件，在离心管盖上钻一个孔（直径 = 2.54 cm）。切割时在盖边缘保留5 cm，以确保盖子能牢固旋紧于管体上（图1）。
- 将细网剪成足够大的正方形（约5 cm2），能嵌入管盖内。将细网放入离心管盖中，并旋紧，确保网面平整无皱褶。
- 使用画笔将一组臭虫卵（一个重复）放置于离心管内的网片上。将装有卵的离心管浸入杀虫剂溶液中，持续5秒。
- 将离心管从杀虫剂溶液中取出，直接将其倒置放在实验室纸巾上，使带有卵的网片自然干燥。
- 使用小型细毛画笔将该组卵从离心管中取出，并转移至一个洁净的培养皿中，培养皿内放置洁净滤纸。
- 连续记录14天内的卵死亡率（未孵化率），以确保所有卵均有充足时间孵化。
- 使用Abbott公式校正对照组死亡率（校正死亡率 = （处理组死亡率 - 对照组死亡率）/（100 - 对照组死亡率）× 100）。
- 将记录的死亡率数据及其对应的浓度输入分析软件15，以计算LC50值。
2. 一龄幼虫杀虫剂测定实验
- 选取一组健康且已充分喂食的臭虫（5只成年雄虫和5只成年雌虫），最好在实验前1天进行喂食，然后将其放入一个培养皿（6 cm × 5 cm）中，并在皿内放置滤纸，供其交配和产卵。让成虫在培养皿中交配并产卵约7–9天。喂食时采用人工喂食系统，该系统通过玻璃管周围循环热水来维持血液温度16。本研究使用去纤维蛋白兔血。
- 将成虫从培养皿（6 cm × 5 cm）中移除，使虫卵在原培养皿中孵化为一龄若虫。在室温条件下，臭虫卵大约需要7–9天孵化。
- 使用毛笔收集同龄且未进食的一龄若虫。可通过每日取出一龄若虫并记录其孵化日期来确定虫龄。将收集到的若虫转移至新的洁净培养皿中，直至进行杀虫剂生物测定。一龄若虫对干燥环境耐受性较差，因此杀虫剂测定应尽快完成。
- 进行测定时，配制吡虫啉/β-氟氯氰菊酯的系列稀释液，获得5种不同浓度，并设置仅含溶剂的对照组溶液。本研究使用在美国注册用于臭虫防治的制剂产品，因此溶剂为水（依据产品标签说明）。
- 用移液器将每种杀虫剂浓度溶液及对照组的水溶液各150 µL滴加到单独的滤纸上（#1号滤纸；直径4.2 cm）。通过在滤纸边缘和中心周围逐滴施加药液，使杀虫剂均匀分布于整张滤纸表面。
- 将处理过的滤纸分别放置在独立的硬质纤维板（7 cm2）上。
- 在滤纸仍湿润时，将一龄若虫分组（每组5–10只）释放到各张滤纸上，并用倒置的培养皿底部覆盖若虫。
- 在培养皿上方放置一定重量，防止一龄若虫逃离处理表面。
- 暴露24小时后，记录各杀虫剂浓度处理组中一龄若虫的死亡率。
- 使用Abbott公式校正对照组死亡率（校正死亡率 = （试验组死亡率 - 对照组死亡率）/（100 - 对照组死亡率）× 100）。
- 将记录的死亡率数据和对应浓度输入分析软件15，计算LC50值。
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结果
将卵浸入5种不同浓度的吡虫啉/β-氯氟氰菊酯（µL/mL）中。将一龄幼虫置于含有5种不同浓度吡虫啉/β-氯氟氰菊酯的处理表面上（图2）。
我们使用了三种不同的C. lectularius种群：Harlan、Richmond和Epic Center（表1）。Harlan品系对拟除虫菊酯类杀虫剂敏感，于2005年从Harold Harlan博士处获得。Richmond和Epic Center品系均对溴氰菊酯具有抗性。Richmond品系于2008年采集自美国弗吉尼亚州里士满的一所老年集体住所。Epic Center品系于2008年采集自美国俄亥俄州辛辛那提市。
较高的LC50值表明，杀死里士满（Richm...
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讨论
该检测中的一个关键步骤是确保从表面移取的卵在检测前未受到损伤。许多昆虫会将卵通过胶状物粘附于基质上，因此可能需要进行初步测试，以确认移取过程不会导致卵死亡。该测试可通过设置多个处理组（从滤纸上取下的臭虫卵）与对照组（未从滤纸上取下的臭虫卵）的重复实验进行比较。若处理组与对照组的死亡率均较低（或无死亡），则可确认移取操作本身未引起卵的死亡。因此，在杀虫剂检测中记录到的任何死亡率应归因于杀虫剂处理。同样，也可利用一龄若虫开展相同的预实验，以确保采集方法不会导致实验昆虫死亡。后续开展的所有实验均应包含未施加杀虫剂但施加溶剂的对照重复组（在本实验中，溶剂为自来水）。
应首先使用推荐的制剂产品标记浓度进行初步实验，然后进行系列稀释，以确定产生20%至80%死亡率浓度反应曲线的正确浓度。在确定合适浓度时，以往针对相同昆虫或化合物的杀虫剂研究也可能提供有益参考。浓度需根据所用昆虫种类、发育阶段和化合物的不同进行相应调整。每次开展实验时均应配制新的溶液。
必须让一龄若虫接触湿润的残留物才能获得较高的死亡率。尽管该虫态被认为比较老的若虫和成虫对...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Molly Stedfast在稀释和农药配制方面的协助。同时感谢Troy Anderson在概率分析方面的指导，以及Zachary Adelman在实验设计方面的帮助。本研究部分得到了昆虫学基金会奖项和弗吉尼亚害虫管理奖学金基金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 培养皿 | Fisher Scientific Inc. | 08-757-105 | 塑料 |
| 滤纸 | Whatman | 1001-042 | |
| 轻质镊子 | Fisher Scientific Inc. | 4750 | |
| Temprid SC（吡虫啉/联苯菊酯） | Bayer CropScience | ||
| Transport GHP（啶虫脒/联苯菊酯） | FMC Corp. | ||
| 离心管 | 06-443-18 | 50 mL；平顶螺口 | |
| 细网筛 | 7250C | ||
| 吸水纸（KimWipe） | 06-666A | 11 cm × 21 cm | |
| 小型画笔 | 任意小型画笔 | ||
| 硬质纤维板 | 从家居装修商店购买的复合木材或瓷砖即可满足要求 | ||
| 金属重物 | 任何类型的金属螺丝，能够将培养皿固定在表面并保持其重量 |
参考文献
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