可调谐的肺部细胞外基质水凝胶用于三维细胞培养

摘要

这是一种利用肺部细胞外基质制备三维细胞培养支架的方法。将完整的肺组织加工成水凝胶，该水凝胶可支持细胞在三维环境中生长。

摘要

在此，我们介绍一种用于建立多组分细胞培养水凝胶的方法 体外 肺细胞培养。从健康的 整块 猪、大鼠或小鼠的肺组织经灌注后浸入一系列化学去垢剂中以去除细胞碎片。组织处理前后的组织学比较显示，双链DNA去除率超过95%，α-半乳糖苷酶染色表明大部分细胞碎片已被清除。脱细胞后，组织经冷冻干燥并 cryomilled 研磨成粉末。基质粉末在酸性胃蛋白酶消化液中消化48小时，随后中和形成预凝胶溶液。预凝胶溶液在37 °C孵育可诱导凝胶化，中和后可立即使用，或于4 °C保存最多两周。可将预凝胶溶液涂布于未经处理的培养板表面，用于细胞贴附。细胞可在自组装前悬浮于预凝胶中以实现三维培养，或接种于已形成的凝胶表面使其迁移穿过支架，亦可接种于涂层表面。对上述策略的任何调整均可能影响凝胶化温度、凝胶强度或蛋白片段大小。除水凝胶形成外，还可使用genipin提高水凝胶的刚度。

引言

翻译 体外 将研究成果应用于临床是生物医学研究人员面临的最具挑战性的问题之一。 体外 关于组织培养塑料的研究更简便、更便捷，且能保持较高的细胞活性。¹ 这种方法是一个合理的起点，但其结果在临床转化方面存在局限性。目前，越来越多的实验室正在采用三维结构来替代传统的二维方法。针对多种三维环境（从生物支架到聚合物支架）的综述文献已有广泛报道。^2,3

生物框架可以模拟特征 体内 环境，因为它们含有大量天然基质中的蛋白质和糖胺聚糖成分，可为细胞提供熟悉的附着与识别结合位点。来源于细胞外基质（ECM）的材料已被证实可作为支持细胞附着和增殖的有效支架。⁴ 限制细胞外基质（ECM）水凝胶平台应用的一个挑战源于其凝胶化后固有的较弱力学性能。天然组织的力学性能通常远高于水凝胶。使用无毒交联剂可提高水凝胶的力学性能，从而更有效地模拟天然组织的微环境。京尼平（genipin）是一种源自栀子植物的无毒天然交联剂，可通过调节其浓度精确调控ECM水凝胶的力学性能。^5,6.

体内几乎所有细胞都存在于由其自身产生或维持的细胞外基质（ECM）中，并在该基质上进行组织。近年来，人们对ECM在各个器官或系统中的结构、状态和功能所具有的普遍重要性日益关注，这推动了基于基质的实验平台的开发与应用。 体外 研究。猪小肠黏膜下层是研究最为广泛的天然来源支架材料，已被用于肌腱、韧带和骨骼肌的再生⁴，甚至骨骼⁷其他器官和供体物种的基质也显示出良好的组织再生潜力。使用异源ECM成分在免疫调节方面引起的问题极少。在清除宿主细胞物质后，残留的ECM在氨基酸组成和结构上将与其他所有哺乳动物物种相似。⁸. 越来越多的研究观点认为，研究细胞-细胞外基质相互作用的最佳方法 体外 是利用器官特异性的细胞外基质（ECM）支架。每个器官提供独特组成的蛋白质和蛋白聚糖，以形成细胞微环境。这些微环境不仅提供结构和功能支持，还参与细胞外基质的酶解过程，从而影响生物物理信号传导。为了获得一种 体外 最类似于微环境的 体内 微环境，使用组织特异性细胞外基质（ECM）将优化用于研究的细胞生态位。

本实验方案的目的是提供一种用于构建具有肺ECM特异性的水凝胶支架的方法。该方法提供了一个平台，可用于 体外 肺细胞与细胞外基质相互作用的研究

方案

溶液	无菌过滤	操作说明
DiH2O	是	DiH2O；经无菌过滤
0.1% Triton X-100 溶液	是	在通风橱中，将 100 µl Triton-X 100 溶液加入 100 ml DiH2O 中，搅拌至溶解； 经无菌过滤
2% 脱氧胆酸钠溶液	是	在通风橱中，每 100 ml DiH2O 中加入 2 g 脱氧胆酸钠溶液， 搅拌至溶解；经无菌过滤
1 M NaCl	是	将 58.44 g NaCl 加入 1 L DiH2O 中；搅拌至溶解； 经无菌过滤
DNase 溶液	是	将 12,000 单位 DNase 加入 1 L DiH2O 中；加入 0.156 g MgSO4 (无水)，以及 0.222 g CaCl2；搅拌至溶解；经无菌过滤
PBS	是	将 27.2 g Na2HPO4 · 7H2O（七水合二碱）， 80 g NaCl 和 2 g KCl 加入 10 L DiH2O 中；搅拌至溶解；调节 pH 至 7.4；经无菌过滤

表1：组织脱细胞所需溶液。配制上述溶液用于脱细胞过程，4 °C保存。每只猪肺大约需要2.5 L溶液。

1. 水凝胶的形成

1. 猪肺脱细胞化（改编自参考文献）^9,10)
   1. 获取，一个 整块 来自屠宰场的正常猪肺，带有完整的心脏和血管系统。
   2. 使用组织剪刀或解剖刀分离心脏，尽可能靠近心脏处切断血管，保留的血管将在后续步骤中用于灌注。
   3. 使用手术刀或剪刀仔细剥离气管、支气管及血管周围结缔组织。
      注意：选择胸膜无大面积切口或穿孔、且无显著肺不张或血管阻塞的肺脏，以确保脱细胞过程的有效性。
   4. 切除不理想的肺组织，尽可能保留与气管相连的支气管（心脏、结缔组织及被切除的肺叶可丢弃）。应保留一个肺仍连接在气管和血管系统上。
      注意：如需要，可保留组织学相关部分。⁹
   5. 用止血钳或缝线闭合已断开的支气管，以防止过多的反流。
   6. 配制脱细胞溶液，并于4 °C冷藏保存，待用时取出表1).
   7. 使用与肺动脉匹配的带套管手动泵，通过肺动脉和气管对肺组织用去离子水灌注3次。每次均先灌注血管系统。首次灌注时，血管系统约灌入1升，气管约灌入1.5升；随着细胞碎片被清除，可逐渐增加灌注液体量。
   8. 用 Triton X-100 溶液灌注血管和气管。
   9. 将肺组织浸入Triton X-100溶液中，4 °C条件下孵育24小时。
   10. 用去离子水冲洗血管和气管3次。
   11. 用脱氧胆酸盐溶液灌注血管系统和气管。
   12. 将组织切片浸入脱氧胆酸盐中，在 4°C 下孵育 24 小时。
   13. 用去离子水冲洗血管和气管3次。
   14. 用氯化钠溶液灌注血管和气管。
   15. 将组织浸入过滤的 NaCl 溶液中，在 4 °C 下孵育 1 小时。
   16. 用去离子水冲洗血管和气管3次。
   17. 用DNase溶液灌注血管系统和气管。
   18. 将组织浸入过滤的DNase溶液中，在4 °C下孵育1小时。
   19. 用 PBS 对血管和气管分别灌注 5 次。
   20. 剥离明显的软骨组织、气管以及直径为2 mm或更大的所有导管（主要位于肺门和肺内侧部分），从传导性气道中分离，仅保留呼吸区（主要为肺外周区域）。
   21. 将组织切成1英寸或更小的片段。此步骤中组织的方向无关紧要。
   22. 倒掉多余液体，将组织放入50 ml锥形管中。在-80 °C下冷冻组织。
       注意：如需确保去除细胞及细胞碎片，应保留组织学相关步骤。我们使用 H&α-半乳糖苷酶、PicoGreen、羟脯氨酸、茚三酮、阿利新蓝、SDS-PAGE 和质谱分析⁹
2. 肺组织处理
   1. 移除含有脱细胞肺组织的冷冻管管盖。
   2. 将滤纸置于管口，用橡皮筋固定。
      注意：试管及内容物应保持冷冻状态，否则需置于 -80 °C 直至完全冻结。
   3. 将组织进行冻干，直至所有多余液体完全去除，操作按照冻干机制造商的说明进行。冻干后于 -80 °C 保存，直至准备研磨。
   4. 开始前，向冷冻研磨机中加入液氮，以将隔热层和内部组件冷却至工作条件。
   5. 从研磨管中取出磁力搅拌棒，并加入组织以覆盖管底。
   6. 更换研磨棒并加入疏松填充的组织，研磨棒应仍能自由移动。
   7. 关闭研磨管并放入冷冻研磨机中。
   8. 加液氮至最大填充线。
   9. 使用冷冻研磨机将所有组织研磨成细粉（约5分钟，撞击频率约600次/分钟）^-1），在冷冻研磨机中使用聚碳酸酯研磨管配合不锈钢撞击子和不锈钢端塞，按照制造商说明进行研磨。研磨后样品于-80 °C保存，直至使用。
3. 微孔凝胶形成（8 mg/ml）（改编自参考文献）^9,11)
   1. 将1%（w/v）脱细胞粉末和0.1%（w/v）胃蛋白酶加入0.01 M HCl中，在室温下持续搅拌（应能观察到液体表面有流动），反应48小时。
      注意：粉末带有静电，因此在加入粉末后再加入盐酸，可将多余的粉末从管壁上冲洗下来。
   2. 消化48小时后，将溶液和试剂置于冰上5分钟。
   3. 使用预冷的10% (v/v) 0.1 M NaOH 和 11.11% (v/v) 10x PBS（使终浓度为1x），将消化后的蛋白质溶液调节至生理pH值7.4。
      注意：该溶液现可在 4 °C 下保存长达一周。使用流变仪进行凝胶动力学分析⁹ 如需要。

2. 交联水凝胶以提高机械强度

1. 通过将适量京尼平粉末溶解于10% DMSO中，配制1%、0.1%和0.01%（w/v）的京尼平交联溶液。
2. 每15分钟涡旋振荡溶液一次，持续1小时。
3. 将京尼平溶液加入已按第1.3.4节步骤组装好的ECM水凝胶中，使其完全覆盖（96孔板每孔100 µL）。
4. 将每块ECM水凝胶在37 °C下交联24小时。
5. 用PBS冲洗ECM水凝胶3次，直至洗液不再呈蓝色。交联后的水凝胶即可用于后续表征及细胞培养研究。

3. 具有微孔凝胶的细胞培养

1. 二维涂层
   1. 使用1.3.3步骤中的溶液，向96孔未经处理的组织培养板的每个孔中加入20 µl预凝胶溶液。
   2. 在4 °C下冷藏过夜，使蛋白质吸附到板上。
   3. 吸除预凝胶溶液，并用PBS洗涤。
   4. 传代细胞⁹。
   5. 将10,000个细胞/cm²接种至各孔中。
   6. 将培养基体积增加至每孔100 µl，并在37 °C下培养。
2. 三维细胞培养⁹
   1. 使用1.3.3步骤中的溶液，将沉淀的细胞重悬于预凝胶溶液中，使细胞浓度达到1,000,000个细胞/ml。
   2. 迅速将16 µl预凝胶-细胞悬液分配至96孔板的每个孔中，形成厚度约为500 µm的水凝胶，用于三维细胞培养。
   3. 在37 °C下孵育30分钟，使凝胶形成。
   4. 在形成的水凝胶上方加入100 µl培养基，并在37 °C下继续培养。
3. 在不同刚度凝胶上的三维细胞培养
   1. 使用1.3.3步骤中的溶液，向96孔板的每个孔中加入100 µl预凝胶溶液。
   2. 在37 °C下孵育30分钟，使凝胶形成。
      注意：此处可采用第2部分中的交联步骤。
   3. 传代细胞⁹。
   4. 将10,000个细胞/cm²接种至各孔中。
   5. 将培养基体积增加至每孔100 µl，并在37 °C下培养。

结果

利用该方法，我们已从正常的猪、大鼠和小鼠肺组织中制备出水凝胶（图1）。经处理的肺组织分别可提供约5 mg、40 mg和10 g的细胞外基质（ECM）粉末。该流程的总体概述见图2。流程中的关键可视化特征包括：用脱氧胆酸盐冲洗后肺组织呈白色；预凝胶形成后，溶液应呈不透明状，并在4 °C保存时数月内保持均匀。我们提供了一个基本的故障排查表，以帮助识别整个流程中可能出现的错误来源（表2）。水凝胶形成后可立即使用，也可储存以备后续使用。流变学检测证实，在达到37 °C后的最初几分钟内，超过90%的凝胶化过程已完成（图3）。形成的水凝胶在磷酸盐缓冲液（PBS）中可长期保持稳定，但细胞黏附和增殖能力可能发生改变（图4）。

尽管本方案是针对猪肺编写的，但由于空间限制，我们在脱细胞处理猪肺时只能使用一个...

讨论

生物学的一个核心特征是分子自组织形成具有特定功能的层级结构。¹³ 在实验室中，自组装过程依赖于多种因素，如盐浓度、pH值和消化时间。如图所示，当溶解的蛋白质恢复至生理温度时，会形成一种自组织水凝胶。该水凝胶能够促进细胞黏附与增殖 体外.

使用聚合物无法研究细胞对细胞外基质（ECM）生物物理信号的响应。利用其他组织无法研究组织特异性细胞对生物物理信号的响应。器官再生研究者和临床医生认为，使用脱细胞支架可促进组织再生和伤口愈合。慢性肺病患者需要改进治疗方法，以增加器官可获得性并降低免疫原性。必须研究器官特异性的细胞-细胞外基质相互作用，以进一步推动器官生物学的发展。

使用细胞外基质（ECM）作为肺细胞的细胞支架已显示出稳定的结果。^14,15 利用来自疾病模型的肺组织切片可促进疾病再生¹⁶，远端肺中发现的干细胞或祖细胞^17,18 需要特殊的微环境以防止畸胎瘤的形成。使用组织特异性ECM作为递送载体，可增强祖细胞的再生效应。ECM...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
曲拉通 X-100	费舍尔科技	BP151-100	在通风橱中使用，并佩戴护目镜和手套。
脱氧胆酸钠	西格玛-奥德里奇	D6750-100g	在通风橱中使用，并佩戴护目镜和手套。
硫酸镁	西格玛-奥德里奇	M7506-500g	无
氯化钙	西格玛-奥德里奇	C1016-500g	无
脱氧核糖核酸酶（DNase）	西格玛-奥德里奇	D5025-150KU	无
盐酸（HCl）	西格玛-奥德里奇	258148-500ML	使用时需佩戴护目镜和手套。
胃蛋白酶	西格玛-奥德里奇	P6887-5G	在通风橱中使用，并佩戴护目镜和手套。
氢氧化钠	费舍尔科技	BP359-500	使用时需佩戴护目镜和手套。
京尼平	和光化学品	078-03021	在通风橱中使用，并佩戴护目镜和手套。
10倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS 10x）	Quality Biological	119-069-151	无
磷酸盐缓冲液（PBS）	VWR	45000-448	无
滤纸	沃特曼	8519	不适用
手动泵	费舍尔科技	10-239-1	不适用
量筒烧杯	VitLab	445941	不适用
冷冻研磨仪	SPEX	6700	使用冷冻手套和护目镜。
冷冻干燥机	FTS FlexiDry		使用手套。
流变仪	Discovery	HR-2	使用手套和护目镜。