自噬激活在预防多种疾病方面具有积极作用。诱导自噬的生理方法之一 在体内 是体育锻炼。本文展示了如何通过有氧运动激活自噬，并在小鼠中检测自噬水平。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
自噬是一种溶酶体降解途径，在细胞稳态、功能和分化中起关键作用。在应激条件下，自噬被诱导并靶向多种底物，如大量细胞质成分、受损细胞器及错误折叠蛋白，将其运送至溶酶体进行降解。降解产生的营养分子被重新释放到细胞质中，用于新的蛋白质合成和ATP生成。自噬的上调对多种疾病的发病机制具有保护作用，已有报道采用药理学和生理学策略激活自噬。近期研究发现，有氧运动可有效诱导小鼠多种器官（包括肌肉、肝脏、心脏和脑）中的自噬。本文展示了诱导自噬的操作步骤 体内 通过强制性跑步机运动或自主跑轮运动实现。我们还展示了利用标志蛋白LC3和p62对小鼠组织中自噬水平进行定量分析的显微镜和生化方法，这些蛋白随自噬体被转运至溶酶体并降解。
引言
自噬是一种在进化上保守的降解途径，可在多种应激条件下（如饥饿和缺氧）被诱导1,2。在自噬过程中，双层膜囊泡（称为自噬体）包裹不需要或受损的细胞内组分，并将其运送到溶酶体中进行降解3。基础自噬对细胞功能和生物体发育至关重要，基础自噬功能受损与多种疾病相关，包括神经退行性疾病、肿瘤发生和2型糖尿病4,5,6。
最著名的生理性自噬诱导剂是饥饿。然而，它存在两个主要局限性。首先，饥饿需要较长时间才能在动物体内有效诱导自噬， 例如在大多数器官中，小鼠禁食48小时可诱导自噬。然而，由于大脑中的营养供应相对稳定，饥饿几乎不会诱导脑组织自噬。事实上，小分子诱导剂也难以检测到自噬的诱导作用，因为许多药物无法穿过血脑屏障。因此，为了更好地分析自噬活化在疾病发病机制中的功能，我们近期发现，运动是一种更为有效的生理手段，可在较短时间内诱导自噬。7,8,9
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有涉及动物的实验操作均按照西北大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的指南进行。
1. 小鼠模型
- 使用8至12周龄的小鼠进行运动训练。为检测运动诱导的自噬作用体内情况，成像研究可采用GFP-LC3转基因小鼠（C57BL/6背景），生化分析则使用C57BL/6小鼠。
2. 运动诱导的自噬
- 跑步机设置——强制运动
- 在10°坡度的开放式跑步机上对小鼠进行为期2天的适应性训练。第1天，以8 m/min的速度让小鼠运动5分钟；第2天，先以8 m/min的速度运动5分钟，随后以10 m/min的速度继续运动5分钟。10通过轻柔的手动轻推促使小鼠奔跑。
- 3rd 当天，让小鼠在10°坡度的跑步机上进行一次90分钟的跑台运动，起始速度为10 m/min。40分钟后，以每10分钟增加1 m/min的速度递增，持续30分钟；随后以每5分钟增加1 m/min的速度继续递增，直至速度达到17 m/min，总运动时间为90分钟，总跑动距离为1,070米。
- 将电刺激设定在低强度范围（1.2 Hz），并鼓励小鼠奔跑以避免重复的足部电击。
- 通过吸入异氟烷对小鼠实施安乐死，运动结束后立即进行颈椎脱位，以采集组织。 其他经批准的安乐死方....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
本方案描述了通过有氧运动在小鼠组织中诱导自噬的两种不同方法：在多通道跑台上进行为期两天适应性训练后，再进行总计90分钟的强制性运动；或单只小鼠在跑轮上进行为期两周的自主运动。在每种运动方案中，我们均可通过荧光显微镜和蛋白质印迹分析检测多种器官中的自噬流。
我们采用了一种表达GFP标记的LC3的转基因小鼠品系作为报告系统，以监测运动诱导的自噬1。在自噬被诱导后，LC3会从细胞质转移到自噬体，形成点状结构。切片后，可通过荧光显微镜直接观察GFP-LC3点状结构的形成（图1A）。此外，也可使用LC3抗体对自噬体结构进行免疫染色以进行成像。与静息状态相比，90分钟的跑台运动或为期2周的自主跑轮运动均增加了骨骼肌（股外侧肌）和大脑皮层中GFP-LC3点状结构的数量（图1B）。需要注意的是，迄今为止，大脑的额叶皮层区域是两种运动方式均能明显诱导自噬发.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
自噬是一种分解代谢过程，通过溶酶体降解细胞质成分或受损细胞器，从而提供能量并降低细胞毒性。研究自噬对于理解细胞稳态的调控机制以及应激反应的机理具有重要意义。目前，该研究领域正不断涌现出新的模型和方法，用于探讨自噬功能障碍如何参与多种病理过程15，16,17。
营养剥夺（饥饿）和药物诱导是常用于诱导自噬的两种方法 体外 和 体内这些方法，尤其是用于动物模型时，可能会产生不良影响，从而干扰整体实验结果。例如，由于需要至少48小时的饥饿才能诱导出可检测水平的自噬，动物可能缺乏维持正常运动活动所需的能量，进而影响后续多项行为学研究的结果。而药理学诱导剂也可能因其对自噬通路缺乏特异性而引发副作用。主要的自噬诱导剂雷帕霉素及其衍生物通过抑制mTOR活性，可导致代谢功能障碍和免疫抑制18,19.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
感谢西北大学小鼠组织学与表型分析实验室提供的技术支持与帮助，以及东京大学的 Noboru Mizushima 提供 GFP-LC3 转基因小鼠。A. R. 和 C. H. 的研究得到了西北大学启动资金以及美国国立卫生研究院基金（DK094980）的资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 跑步机 | Columbus Instruments | 150-RM Exer 3/6 | |
| 小鼠跑轮 | Super Pet | 100079365 | 直径 11.4 cm |
| 计程器 | Bell | DASHBOARD 100 | |
| 注射泵 | KD Scientific | KDS100 | |
| 荧光显微镜 | Nikon | 型号：倒置显微镜 ECLIPSE | |
| 冷冻切片机 | Leica | CM 1850UV | |
| 匀浆器 | IKA | 003737001 / 型号：T10 Basic S1 | |
| 氯喹 | CAYMAN CHEMICAL COMPANY | 14194 | |
| 多聚甲醛 | SIGMA-ALDRICH | P6148 | 需佩戴个人防护装备。该产品可能释放甲醛气体，该化学物质被确认可导致癌症。 |
| 封片介质 | Vector Laboratories | H-1200 | |
| p62 抗体 | BD Biosciences | 610833 | |
| LC3 抗体 | Novus Biologicals | NB100-2220 | |
| 2x Laemmli 样品缓冲液 | Bio-Rad Laboratories | 161-0737 | |
| ImageJ | NIH |
参考文献
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Mol Biol Cell. 15, 1101-1111 (2004).
- Tracy, K., et al.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
