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方法文章

通过有氧运动在小鼠中激活自噬

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DOI：

10.3791/55099

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2017年2月3日

 , 
1Department of Cell and Molecular Biology, Northwestern University

本文内容

摘要

自噬激活在预防多种疾病方面具有积极作用。诱导自噬的生理方法之一 在体内 是体育锻炼。本文展示了如何通过有氧运动激活自噬，并在小鼠中检测自噬水平。

摘要

自噬是一种溶酶体降解途径，在细胞稳态、功能和分化中起关键作用。在应激条件下，自噬被诱导并靶向多种底物，如大量细胞质成分、受损细胞器及错误折叠蛋白，将其运送至溶酶体进行降解。降解产生的营养分子被重新释放到细胞质中，用于新的蛋白质合成和ATP生成。自噬的上调对多种疾病的发病机制具有保护作用，已有报道采用药理学和生理学策略激活自噬。近期研究发现，有氧运动可有效诱导小鼠多种器官（包括肌肉、肝脏、心脏和脑）中的自噬。本文展示了诱导自噬的操作步骤 体内 通过强制性跑步机运动或自主跑轮运动实现。我们还展示了利用标志蛋白LC3和p62对小鼠组织中自噬水平进行定量分析的显微镜和生化方法，这些蛋白随自噬体被转运至溶酶体并降解。

引言

自噬是一种在进化上保守的降解途径，可在多种应激条件下（如饥饿和缺氧）被诱导1,2。在自噬过程中，双层膜囊泡（称为自噬体）包裹不需要或受损的细胞内组分，并将其运送到溶酶体中进行降解3。基础自噬对细胞功能和生物体发育至关重要，基础自噬功能受损与多种疾病相关，包括神经退行性疾病、肿瘤发生和2型糖尿病4,5,6。

最著名的生理性自噬诱导剂是饥饿。然而，它存在两个主要局限性。首先，饥饿需要较长时间才能在动物体内有效诱导自噬， 例如在大多数器官中，小鼠禁食48小时可诱导自噬。然而，由于大脑中的营养供应相对稳定，饥饿几乎不会诱导脑组织自噬。事实上，小分子诱导剂也难以检测到自噬的诱导作用，因为许多药物无法穿过血脑屏障。因此，为了更好地分析自噬活化在疾病发病机制中的功能，我们近期发现，运动是一种更为有效的生理手段，可在较短时间内诱导自噬。7,8,9与饥饿相比，跑步机运动可在短短30分钟内有效诱导自噬。因此，运动是一种便捷且强大的生理性手段，可用于研究自噬在介导健康益处和预防疾病中的机制。

有多种蛋白标志物可用于检测自噬活性，包括 LC3 和 p62。LC3（微管相关蛋白 1A/1B 轻链 3）是一种胞质蛋白（LC3-I 形式），在自噬诱导时与磷脂酰乙醇胺（PE）共价结合。脂化后的 LC3（LC3-II 形式）被招募至自噬小体膜上，当用 GFP 标记时可用于可视化自噬小体。在显微镜下，其从胞质向自噬小体点状结构的转位是自噬被诱导的标志。p62 是一种自噬底物（如泛素化蛋白）的接头蛋白，也会被整合进自噬小体中。由于该蛋白会随自噬小体在溶酶体中降解，因此其蛋白水平可用于衡量自噬流。本文将展示如何利用这些标志物定量检测由有氧运动（包括强制运动（跑台）和自主运动（转轮））诱导的小鼠不同组织中的自噬活性。相同的方法也可应用于 体内 其他诱导剂处理后自噬的检测

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方案

所有涉及动物的实验操作均按照西北大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的指南进行。

1. 小鼠模型

  1. 使用8至12周龄的小鼠进行运动训练。为检测运动诱导的自噬作用体内情况，成像研究可采用GFP-LC3转基因小鼠（C57BL/6背景），生化分析则使用C57BL/6小鼠。

2. 运动诱导的自噬

  1. 跑步机设置——强制运动
    1. 在10°坡度的开放式跑步机上对小鼠进行为期2天的适应性训练。第1天，以8 m/min的速度让小鼠运动5分钟；第2天，先以8 m/min的速度运动5分钟，随后以10 m/min的速度继续运动5分钟。10通过轻柔的手动轻推促使小鼠奔跑。
    2. 3rd 当天，让小鼠在10°坡度的跑步机上进行一次90分钟的跑台运动，起始速度为10 m/min。40分钟后，以每10分钟增加1 m/min的速度递增，持续30分钟；随后以每5分钟增加1 m/min的速度继续递增，直至速度达到17 m/min，总运动时间为90分钟，总跑动距离为1,070米。
    3. 将电刺激设定在低强度范围（1.2 Hz），并鼓励小鼠奔跑以避免重复的足部电击。
    4. 通过吸入异氟烷对小鼠实施安乐死，运动结束后立即进行颈椎脱位，以采集组织。 其他经批准的安乐死方法也可使用，例如二氧化碳（CO2）或腹腔注射其他麻醉剂。安乐死方法似乎不影响自噬水平。
  2. 跑轮装置——自主运动
    1. 将一个跑轮（直径11.4 cm）放入单独饲养小鼠的笼子中。
    2. 使用自行车里程表验证运行能力。将车轮参数（车轮每完整旋转一圈所行进的距离，单位为 mm）设置为 358（11.4×π）。在 24 小时后测量运行距离。
    3. 让小鼠在跑轮上自由奔跑2周。在跑步期结束后，于早晨处死小鼠以采集组织。

3. 自噬流评估

  1. 为测量静息和运动条件下的自噬流，用自噬抑制剂氯喹处理小鼠三天，并与用 PBS 处理的小鼠进行比较。
    1. 将氯喹溶解于 PBS 中（5 mg/ml），以 50 mg/kg/天的剂量连续三天每天一次腹腔注射给予小鼠。末次注射后 3 小时处死小鼠并采集组织。
    2. 对于运动小鼠，先以 50 mg/kg/天的剂量连续两天预先给予氯喹处理。第三天，给予相同浓度的氯喹注射，90 分钟后让小鼠在跑步机上跑步 90 分钟。
    3. 通过吸入异氟烷麻醉小鼠，随后进行颈椎脱位处死。跑步结束后立即采集组织，使氯喹的总孵育时间与对照组（静息）小鼠相同（3 小时）。
      注：也可使用单次注射氯喹来测定小鼠组织中的自噬流。

4. 组织采集与固定

  1. 在组织取材前，配制磷酸盐缓冲液（PBS）以及用 PBS 新鲜配制的 4% 多聚甲醛（PFA，注意：需佩戴个人防护装备），调节终末 pH 至 7.4。将两种溶液均储存于 4 °C。
  2. 用 15–20 ml 的 4% PFA 装满 30 ml 注射器（适用于 GFP-LC3 小鼠）。将注射器连接至 20 G 导管针。
  3. 运动结束后，通过吸入异氟烷麻醉小鼠，随后行颈椎脱位处死。
  4. 将动物仰卧置于洁净的操作台面上。剪开膈肌以切开并暴露胸腔，显露心脏。
  5. 在肝脏上做一小切口以排出血液，并通过导管将总共 15 ml 的 4% PFA 缓慢注入右心室，直至肺和肝脏完全变苍白。运动结束后立即进行灌注，使用注射泵以 90 ml/hr 的恒定流速进行。
  6. 灌注完成后，拔出针头，采集目标组织（例如 脑11 和骨骼肌）。对于骨骼肌，分离股外侧肌。简要步骤：向后牵拉腿部皮肤以暴露肌肉，定位股四头肌12，然后分离出附着于股骨上段外侧的股外侧肌。
  7. 为进一步固定和脱水，将 GFP-LC3 小鼠的组织置于 4% PFA 中，在 4 °C 固定 24 小时，随后转移至 15% 蔗糖-PBS 溶液中，4 °C 过夜或直至组织沉底；再转移至 30% 蔗糖-PBS 溶液中，4 °C 过夜或更长时间储存。样本应尽可能避光保存，因其可能对强光敏感。
  8. 用于 Western 印迹分析时，将 C57BL/6 小鼠的组织直接在液氮中速冻，并储存在 -80 °C。

5. GFP-LC3 点状结构的成像分析

  1. 组织处理
    1. 预先处理组织（此前已用PFA固定并保存在30%蔗糖中）于包埋介质中，例如 "最佳切割温度化合物" 在已标记的小培养皿中用 OCT 包埋剂处理数分钟。
    2. 将组织转移至已标记的冷冻模具中，加入足量新鲜OCT包埋剂以完全覆盖组织。使切面朝向冷冻模具底部（股外侧肌取横切面，半脑取矢状面），避免产生气泡。
    3. 将包埋盒放入装有干冰并加盖的泡沫盒中数分钟，直至OCT变白，以此冷冻样本。用带标签的铝箔单独包裹各样本，密封于塑料袋中，于-80 °C保存过夜或更长时间。
    4. 使用冷冻切片机将样品切成10 µm厚的切片，并将切片贴附于载玻片上。将载玻片置于-20 °C保存，并尽可能避免光照。
  2. 载玻片制备
    1. 从冰箱中取出载玻片，在室温下解冻。在组织切片上滴加含DAPI的封片剂，盖上合适尺寸的盖玻片，避免产生气泡。
    2. 用指甲油密封盖玻片边缘，在室温避光条件下使指甲油干燥，然后将载玻片置于避光容器中于4 °C保存，或直接进行GFP-LC3点状结构的成像采集。
  3. 通过荧光显微镜定量GFP-LC3点状结构
    1. 进行落射荧光显微镜观察，对所有样品在相同条件（曝光时间和设置）下采集图像。对于GFP，使用525 nm发射波长；对于DAPI，使用490 nm发射波长。使用60倍物镜，对股外侧肌和脑额叶皮层区域的每个样品至少采集十张图像。
    2. 在2,500 µm²的组织区域内定量GFP-LC3点状结构的数量2 对每张图像进行统计分析时，对实验分组设盲。使用软件的自动测量功能，计算每个样本10张图像的平均值。 "物体计数"股外侧肌的设置参数为：阈值 L = 10，H = 200；2次平滑；1次去杂；脑额叶皮层的设置参数为：阈值 L = 11，H = 200；2次平滑；1次去杂。

6. 自噬标志物的蛋白质印迹分析

  1. 组织处理
    1. 配制裂解缓冲液：50 mM Tris-HCl；150 mM NaCl；1 mM EDTA；1% Triton X-100；蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂（现用现加）。
    2. 从 -80 °C 取出 C57BL/6 小鼠组织。用刀片将肌肉组织切成小块，再进行后续操作。向样品中加入 800 µl（半脑组织）或 500 µl（股外侧肌）预冷的裂解缓冲液。在 4 °C 下使用匀浆器以中等速度匀浆样品。
    3. 将匀浆后的混合物在 4 °C 下旋转孵育 30 分钟至 1 小时，使其充分裂解。
    4. 在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 10 分钟，弃去沉淀，收集上清液至新离心管中。
  2. 自噬分析
    1. 根据 BCA 蛋白检测试剂盒说明书测定组织裂解液的蛋白浓度，并将各样品调整至相同浓度。
    2. 按 1:1 比例将样品与 2x Laemmli 上样缓冲液混合，在 95 °C 下煮沸 5–10 分钟，随后进行 Western 印迹分析，检测自噬标志物13,14，如 p62（抗-p62 抗体，1:500 稀释）和 LC3（抗-LC3 抗体，1:500 稀释）。加入上样缓冲液后应立即煮沸样品，因为在冰上孵育时间过长可能导致 LC3 出现多条降解条带。
    3. 使用 ImageJ 软件对 p62 和 LC3 条带进行密度分析，并将结果归一化至相应的肌动蛋白（actin）条带。

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结果

本方案描述了通过有氧运动在小鼠组织中诱导自噬的两种不同方法：在多通道跑台上进行为期两天适应性训练后，再进行总计90分钟的强制性运动；或单只小鼠在跑轮上进行为期两周的自主运动。在每种运动方案中，我们均可通过荧光显微镜和蛋白质印迹分析检测多种器官中的自噬流。

我们采用了一种表达GFP标记的LC3的转基因小鼠品系作为报告系统，以监测运动诱导的自噬1。在自噬被诱导后，LC3会从细胞质转移到自噬体上，形成点状结构。切片后，可通过荧光显微镜直接观察GFP-LC3点状结构的形成（图1A）。此外，也可使用LC3抗体对自噬体结构进行免疫染色以进行成像。与静息状态相比，无论是90分钟的跑台运动还是为期2周的自主跑轮运动，均可增加骨骼肌（股外侧肌）和大脑皮层中GFP-LC3点状结构的数量（图1B）。需要注意的是，迄今为止，大脑的额叶皮层区域是两种运动方式均能明...

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讨论

自噬是一种分解代谢过程，通过溶酶体降解细胞质成分或受损细胞器，从而提供能量并降低细胞毒性。研究自噬对于理解细胞稳态的调控机制以及应激反应的机理具有重要意义。目前，该研究领域正不断涌现出新的模型和方法，用于探讨自噬功能障碍如何参与多种病理过程15，16,17。

营养剥夺（饥饿）和药物诱导是常用于诱导自噬的两种方法 体外 和 体内这些方法，尤其是用于动物模型时，可能会产生不良影响，从而干扰整体实验结果。例如，由于需要至少48小时的饥饿才能诱导出可检测水平的自噬，动物可能缺乏维持正常运动活动所需的能量，进而影响后续多项行为学研究的结果。而药理学诱导剂也可能因其对自噬通路缺乏特异性而引发副作用。主要的自噬诱导剂雷帕霉素及其衍生物通过抑制mTOR活性，可导致代谢功能障碍和免疫抑制18,19...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

感谢西北大学小鼠组织学与表型分析实验室提供的技术支持与帮助，以及东京大学的 Noboru Mizushima 提供 GFP-LC3 转基因小鼠。A. R. 和 C. H. 的研究得到了西北大学启动资金以及美国国立卫生研究院基金（DK094980）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
跑步机Columbus Instruments150-RM Exer 3/6
小鼠跑轮Super Pet100079365直径 11.4 cm
计程器BellDASHBOARD 100
注射泵KD ScientificKDS100
荧光显微镜Nikon型号：倒置显微镜 ECLIPSE
冷冻切片机LeicaCM 1850UV
匀浆器IKA003737001 / 型号：T10 Basic S1
氯喹CAYMAN CHEMICAL COMPANY14194
多聚甲醛SIGMA-ALDRICHP6148需佩戴个人防护装备。该产品可能释放甲醛气体，该化学物质被确认可导致癌症。
封片介质Vector LaboratoriesH-1200
p62 抗体BD Biosciences610833
LC3 抗体Novus BiologicalsNB100-2220
2x Laemmli 样品缓冲液Bio-Rad Laboratories161-0737
ImageJNIH

参考文献

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