基于影像引导的激光制造血管衍生微流体网络

摘要

本方案概述了采用图像引导的激光降解技术，在聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）水凝胶中构建源自血管、具有仿生特性的微流体网络的方法。此类仿生微流体系统可应用于组织工程、生成 体外 疾病模型，以及先进的“芯片上”设备的制备。

摘要

本详细方案概述了采用图像引导的激光降解法，在聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）水凝胶中构建血管衍生的微流控网络的制备方法。本文描述了虚拟掩模的创建，以实现图像引导下的激光控制；微模具成型的PEGDA水凝胶的光聚合过程，适用于微流控网络的构建及压力驱动流体流动；利用商用激光扫描共聚焦显微镜与飞秒脉冲钛宝石（Ti:S）激光器组合系统诱导水凝胶降解的装置搭建与操作步骤；以及通过荧光标记物和共聚焦显微镜对所制备微流控网络进行成像的方法。本方案的大部分内容聚焦于显微镜软件及显微镜宏程序的正确设置与实施，这些步骤在将商用显微镜用于微流控结构制造时至关重要，且涉及诸多技术细节。该技术的图像引导组件支持三维图像堆栈或用户自定义三维模型的导入，从而实现灵活多样的微流控设计，并可制备几乎任意构型的复杂微流控系统。该方法在组织工程领域具有重要应用前景，有望推动类器官和类人芯片装置中高级仿生微组织结构的构建。通过模拟复杂结构、迂曲度、尺寸和密度等特征 体内 血管系统，这些结构中可复制重要的生物转运过程，从而实现更精确的模拟 体外 药物药代动力学与疾病建模

引言

血管系统由淋巴管和心血管系统组成，形成高度密集的网络，对营养物质和氧气的输送以及代谢废物的清除至关重要。因此，血管化组织中的细胞与血管的距离从不超过50–100 µm。¹. 可重复性能力 体内 血管结构 体外 准确建模至关重要 体内 利用工程化构建体研究转运过程。随着近年来推动器官芯片设备的开发² 用于高通量药物筛选^3,4 和疾病建模^5,6，用于构建可重现微流控网络的方法 体内类组织运输在合成或天然水凝胶中正受到广泛关注。为增强这些装置中所用微组织的仿生性，我们开发了一种基于图像引导的激光水凝胶降解方法，该方法利用天然血管系统的三维（3D）图像序列作为模板，在聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）水凝胶中构建出源自血管的微流体网络⁷本方案概述了使用市售的配备飞秒脉冲激光器的激光扫描共聚焦显微镜，通过图像引导的激光降解方法，在聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）水凝胶中制备血管来源的仿生微流控网络。

目前使水凝胶液化的方法包括诱导血管生成^8-10 或促血管生成的^10-12 内皮细胞自组装与微加工技术用于构建预设的内皮化通道^13-16. 尽管自组装网络能够重现微血管系统的密度和复杂结构，但其通透性通常高于 体内 网络^11,17,18这在药物筛选应用的运输建模中可能存在问题。自组装网络包含生理学相关的、毛细血管尺寸的管道，但由于难以生成更大尺寸的小动脉级管道，其与整体流体流动的整合可能较为困难。由于无法直接控制这些网络的组装过程，最终结构可能在不同样本间存在差异，导致难以重复制备出具有相同流体流动和传输特性的网络。

为了构建具有可重复几何形状和明确结构的三维水凝胶包埋微流控网络，已开发出多种微加工技术，包括模块化组装¹³、牺牲材料的3D打印¹⁶、直接书写组装¹⁴以及全向打印¹⁵。利用这些方法，可在多个结构中重复制造微流控结构，从而实现对流体流动和传输特性的精确控制。然而，这些方法的一个主要局限在于无法构建具有毛细管尺寸特征（4至10 µm¹⁹）的微流控网络。大多数微加工技术通常仅能实现直径在150至650 µm范围内的结构^13,16。部分现有技术能够生成具有宽直径范围通道的分级网络，例如直接书写组装可实现10至300 µm的通道¹⁴，全向打印可实现18至600 µm的通道¹⁵，但它们在构建密集网络或在同一结构内近距离生成多个微流控网络方面仍存在局限⁷。

为克服其中一些局限性，我们开发了一种基于激光的图像引导水凝胶降解技术，可重复地构建出仿生的、具有层级结构的微流控网络，以重现目标组织的架构 体内 微血管结构。为此，使用波长为790 nm、脉冲宽度为140飞秒（fs）、重复频率为80 MHz的脉冲激光，在水凝胶内按照预设的三维位置进行光栅扫描，扫描位置由图像定义 体内 血管系统。我们推测，该降解过程通过激光诱导的水光学击穿、随之产生的等离子体形成、水的快速热弹性膨胀，以及水膨胀过程中水凝胶的局部降解而实现²⁰该机制与基于激光的蛋白质水凝胶降解机制略有不同^21-24与PEGDA不同，蛋白质通常具有较大的双光子截面，因此会通过双光子吸收诱导的化学断裂而发生降解。²³通过图像衍生的虚拟掩模控制激光快门，以生成图像引导的微流控网络，该虚拟掩模由多个感兴趣区域拼接而成⁹ 定义微流控结构。利用该方法，我们已成功制备出三维血管来源的仿生微流控网络，可重现密集且迂曲的血管结构。 体内 血管系统，以通过调节降解过程中传递的能量来局部控制水凝胶的孔隙率。我们还成功构建了两个相互交织且紧密相邻（15 µm）但从未直接连通的独立微流控网络。⁷我们还证明了通过在激光降解后对微通道进行功能化修饰，引入整合素配体肽序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸（RGDS），可实现降解微通道的内皮化，促进内皮细胞黏附和管腔形成。⁷.

通过本方案，可利用商业显微镜（在多数高校校园内均可获得）结合图像引导的激光降解技术，在聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）水凝胶中构建复杂的微流控网络。由于降解过程由数字化的虚拟掩模引导，该制造技术适用于创造性设计微流控网络，因而可广泛应用于多种场景。我们预计，本文所述方法在设计仿生类器官和类人芯片装置方面将具有显著优势，能够模拟药物转运过程中关键的生物传输过程。²该制备技术也可能对生成 体外 疾病模型，包括癌症转移^5,6 以及血脑屏障模型²⁵由于基于激光的水凝胶降解技术此前已被用于为神经突起的生长导向创建路径^21-23该技术的图像引导延伸在高级组织工程策略中可能具有重要应用价值，可用于将细胞定位在用户自定义的三维空间结构中。

方案

1. 生成虚拟掩码

注意：选择小鼠脑微血管系统的 3D 图像堆栈作为本协议的微流体模型，它是从包含整个小鼠大脑微血管系统图像的更大数据集中挑选出来的。通过刀刃扫描显微镜 （KESM） 获取微血管图像^26,2;类似的微血管数据可通过 KESM 小鼠脑图谱²⁸ 公开获得。

1. 打开图像处理软件²⁹，打开并裁剪天然脉管系统的3D TIF图像堆栈，以便要在水凝胶内生成的所需微流体网络适合450μm×450μm×1.5mm（x×y×z）窗口。为此，请在所需区域周围画一个正方形，然后单击"图像"→"裁剪"。通过单击"图像"→"复制"来删除 z 方向的切片，然后键入所需的切片范围。
   注：这可确保所需的特征适合视场 （x x y）（使用框架尺寸为 2,884 x 2,884 像素，变焦为 0.8 的 20X （NA1.0） 水浸物镜时为 531.2 x 531.2 μm，使用激光扫描共聚焦显微镜时）和 20X （NA1.0） 水浸物镜的工作距离 （z）。如果未知，则可以通过获取具有所需物镜和设置的图像来确定其他系统的视场。
2. 通过单击"图像"→"变换"→"旋转"，旋转图像堆栈，使特征主要与光栅扫描的方向或 x 方向对齐。这减少了制造所需的时间。
3. 缩放裁剪后的图像堆栈，使像素大小匹配或超过共聚焦显微镜上用于降解的设置（使用20X（NA1.0）水浸物镜时，像素大小为2,884 x 2,884像素，缩放比例为0.8时，为0.184μm/像素）。为此，请单击"图像"→"调整"→"大小"，然后输入"宽度"的"2446"（即 450 μm，或图像大小除以 0.184 μm/像素）。
4. 通过键入 "Ctrl + Shift + T" 对图像堆栈进行阈值/二值化。取消选择 "Dark Background"，然后单击 "apply" → "ok"。通过单击"Image"→"Lookup Tables"→"Invert LUT"来完成该过程。
5. 在编程软件⁹ 中使用自定义算法（源代码可在参考手稿的补充材料中找到），用平行于光栅扫描方向（x 方向）的单个像素高四边形的马赛克拟合二值化（白色）特征，以生成引导激光位置和快门的感兴趣区域 （ROI）^9， 7,30,31,32.
   注意：自定义算法⁹ 将 TIF 图像堆栈中的每个单独平面转换为 RLS 文件。
6. 将 RLS 文件的文件扩展名更改为 。在降解过程中使用的 OVL。

2. 配置激光扫描共聚焦显微镜

注意：虽然可以使用其他配备脉冲激光器的激光扫描显微镜，但此处的设置和协议描述了激光扫描显微镜 （LSM） 与其软件的结合使用。

1. 打开激光扫描共聚焦显微镜后，打开显微镜软件，然后单击"启动系统"。在"维护"选项卡中选择物镜"W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC VIS-IR M27 75mm"。
2. 设置 "Hydrogel Visualization" 配置
   1. 在 "Acquisition" 选项卡中，确保选择 Laser line（514 nm 氩激光）并在 "Laser" 窗口中打开。注：该通道用于通过曙红 Y 荧光对水凝胶进行成像，用于定向目的⁷。
   2. 在"Imaging Setup"窗口中，将"Mode"设置为"Channel Mode"，将"Switch track every"设置为"Frame"，然后选择"Track1"。
   3. 在"光路"窗口中，仅选择范围为 516 至 735 nm 的 Ch1 荧光检测器;可见光线上的主分束器 （MBS） 458/514 滤光片;以及不可见光线上的板。取消选择明场光电倍增管检测器"T-PMT"。
   4. 在"采集模式"窗口中，检查是否选择了正确的物镜，并将"扫描模式"设置为"帧"，将"帧大小"设置为"2884"（X 和 Y），将"线步长"设置为"1"，将"数字平均"设置为"1"， "平均模式"为"线"，"平均方法"为"平均值"，"位深度"为"16 位"，"方向"为"<->"，用于双向扫描。
   5. 在"采集模式"窗口中，根据需要设置"速度"，并将"校正 X"和"Y"设置为"0.05"或根据需要调整所使用的特定显微镜。取消选择 "HDR"。
   6. 在"采集模式"窗口中，确保"扫描区域"显示"图像大小"为"531.2 μm x 531.2 μm"，"像素大小"为"0.18"，"缩放"设置为"0.8";将所有其他"扫描区域"值设置为零。
   7. 在 "Channels" 窗口中，选择 "Track1" 作为 Ch1 荧光检测器。选择激光线"514"，百分比功率为"10.0"，"针孔"为"1AU"，初始"增益（主）"为"800"，"数字偏移"为"0"，"数字增益"为"1".
      注意：根据所使用的特定显微镜的需要调整这些设置。
   8. 将此配置另存为 "Hydrogel Visualization"。
3. 设置 "Channel Formation" 配置
   1. 在 "Acquisition" 选项卡中，确保激光线（790 nm 140 fs 脉冲 Ti：S 激光器）已选中，并在 "Laser" 窗口中打开。将"GDD Correction"设置为"4000"，以获得 790 nm 处的最大功率输出。
   2. 按照步骤 2.2.2 中的说明设置"Imaging Setup"（成像设置）窗口。
   3. 在"光路"窗口中，确保未选择荧光检测器，可见光线上使用 MBS 458/514/561/633 滤光片，不可见光线上使用 MBS 760+ 滤光片。取消选择明场光电倍增管检测器"T-PMT"。
   4. 在 "Acquisition Mode" 窗口中，检查是否列出了正确的物镜。将 "Speed" 设置为 "3" 和步骤 2.2.4 中概述的所有其他设置。
   5. 在"Channels"窗口中，选择"Track1"作为 T-PMT 检测器。选择激光线"790"，百分比功率为"100.0"，初始"增益（主）"为"800"，"数字偏移"为"0"，"数字增益"为"1"。
   6. 在 "Stage" 窗口中，单击 "set zero" 将舞台归零。通过单击"标记"来标记位置。这对于在步骤 3 中将虚拟掩模上传到显微镜宏观至关重要。
   7. 在 "Time Series" 窗口中，将 "Cycles" 设置为 "1" ，将 "Interval" 设置为 "0"。
   8. 在"漂白"窗口中，选中"# 次扫描后开始漂白"框，并将其设置为"0 of 1"的值。选择"Different scan speed"，值为"3"（对应于 8.96 μs/像素的像素停留时间）。选择 "Safe bleach for GaAsP"。
   9. 在"漂白剂"窗口的激光线部分，选择 790 激光线并将百分比功率设置为"100.0"。保持漂白窗口中的所有其他框未选中。将漂白剂设置保存在 "Bleach" 窗口中。
   10. 将此配置另存为 "Channel Formation".
       注意："Z-Stack"、"Regions"、"Focus"和"Stage"窗口对于此协议也很重要，但不需要在初始配置期间设置或调整。

3. 创建配方并将虚拟遮罩上传到显微镜软件和宏

1. 在激光扫描共聚焦显微镜仍在运行且显微镜软件仍处于开启状态的情况下，在"通道形成"配置中仅选择"区域"窗口（"开始实验"按钮旁边）。
2. 为确保掩模正确加载到显微镜宏观上，请将"通道"窗口中的功率百分比设置为"0.2"，将"采集模式"窗口中的"速度"设置为"8"，然后单击屏幕左上角的"捕捉"。
3. 在图像的"信息"选项卡中，检查图像大小是否仍为"531.2 μm x 531.2 μm"，像素大小为"0.18"。如果这些值不正确，请再次检查"Frame Size（帧大小）"和"Zoom（缩放）"值。
4. 关键：在打开显微镜微距之前，请检查"载物台"窗口中的 X 和 Y 位置是否已归零，并且位置是否已标记。请参阅步骤 2.3.6。
5. 要打开显微镜宏，请键入"Alt+F8"，单击"加载"，然后选择正确的版本。有关详细信息，请参阅特定材料/设备清单。在 "Macro Control" 窗口中将打开一长串子宏。
6. 在"宏控制"窗口中，单击"运行"打开显微镜宏，然后关闭"宏控制"窗口><。 注意：显微镜宏观的替代版本可能与使用此方案的基于激光的水凝胶降解不兼容。
7. 在显微镜微距的"保存"选项卡中，提供任意的"基本文件名"，选择"单个文件输出"，然后选择"临时文件"文件夹。将"打开临时文件夹"设置为位置"1"，选择"单个临时图像文件夹"，然后在"存储/应用配方"中为配方命名，并选中"调用位置列表"。单击"Store（存储）"以初始创建配方。
8. 在显微镜宏观的"采集"选项卡中，确保"扫描配置"与步骤 2.3 中设置的显微镜软件配置的名称相匹配。将 "Number of Time Points within Block" 设置为 "1"，将 "Interval" 设置为 "0"。确保"Marked Z - Top of the Z Stack"（标记的 Z - Z 堆栈顶部）以绿色突出显示。所有其他默认设置都很好。
9. 在显微镜宏的"Timing"选项卡中，确保"Wait Delay"以绿色突出显示，将"Experiment Repetitions"和"Group Repetitions"设置为"1"，将"Wait Interval Before Block at First Location Only"设置为"0"。所有其他默认设置都正常。
   注意："组重复"（而不是"实验重复"）框是可以设置激光扫描一个区域（即配方的重复次数）的地方。
10. 在显微镜宏观的"Z 列表"选项卡中，指定了 z 方向的降解平面。将 z 间距 "dZ" 设置为 "1 μm"，并将 "Number of Positions" 设置为与要使用的虚拟蒙版数量相匹配。
11. 单击"Create Z Stack"按钮，使"Z List"出现在窗口底部的"List of Locations"下拉列表中。检查位置数和 z 间距是否正确，以及 X 和 Y 位置是否归零。
    注意：如果不是，请不要存储配方;关闭显微镜微距并重复步骤 2.3.6，然后重新打开显微镜微距并再次设置配方。
    注意：例如，与其使用 100 个掩码，每个掩码间隔 1 μm，不如使用 50 个掩码，每个掩码使用两次，间隔 1 μm，以获得等效的微流体结构，因为将单个掩码加载到显微镜宏观上可能很耗时。
12. 在显微镜宏观的"漂白剂"选项卡中，必须加载所有掩模，并与"位置列表"中的特定编号位置匹配。首先，选择 "漂白剂" 框并确保 "配置" 与显微镜软件主屏幕中 "漂白剂" 窗口中的漂白剂设置名称匹配（请参阅步骤 2.3.8）。将"漂白后等待延迟"设置为"0"，取消选择"spot"，并将"ROI"留空。
13. 请勿更改 "Location"（位置）、"Tile（平铺）"、"Grid"（网格）、"Autofocus"（自动对焦）、"Blocks"（块）和 "Options"（选项）选项卡中的任何内容。
14. 要将掩模加载到显微镜宏观上，只需在显微镜软件中选择"区域"窗口，然后打开显微镜宏观的"漂白"选项卡。在"区域"窗口中，单击"加载"并选择 .正在降级的 z 堆栈底部的掩码的 OVL 文件。
    注："Z 列表"中的第一个位置是 z 堆栈的底部，显微镜宏观装置会一直工作到 z 堆栈或水凝胶的顶部。
15. 一旦 ROI 列表出现在"区域"窗口中，单击箭头按钮以查看视野内蒙版的 ROI（在步骤 3.2 中拍摄的图像上）。验证 ROI 是否适合视域。
16. 要将加载的掩模保存在显微镜宏观中，请在"漂白"选项卡上的"将当前区域添加到 ROI 列表"框中为掩模命名和编号，然后单击"将当前区域添加到 ROI 列表"按钮。名称和编号将与任何其他掩码（包括来自其他先前创建的配方的掩码）一起出现在 "ROI" 下拉列表中。在显微镜软件的"区域"窗口中删除掩码。
17. 重复步骤 3.14 和 3.16 将所有蒙版上传并保存到显微镜宏。
18. 要将上传的蒙版分配给每个 Z 位置，请突出显示下拉列表"List of Locations"中的位置 1。从 "ROI" 下拉列表中选择适当的 ROI。确保在显微镜宏的 "Bleach" 选项卡顶部选择 "Bleach" 框。
19. 对下拉列表 "List of Locations" 中的所有位置重复步骤 3.18，然后单击 "Saving" 选项卡上的 "Store" 以将配方保存为最终形式。

4. 光聚合 PEGDA 水凝胶

1. 用三乙醇胺 （TEOA） 制备无菌 HEPES 缓冲盐水 （HBS）
   1. 在 1 L 烧杯中，加入 500 mL DI H₂O。使用搅拌棒，在通风橱中加入 2.922 g 氯化钠、1.196 g HEPES 和 7.5 mL TEOA。
   2. 用巴斯德移液管滴加，用 1 N 氢氧化钠溶液调节至 pH 8.3。
   3. 通过 0.2 μm 真空过滤杯将溶液无菌过滤到 500 mL 高压灭菌玻璃培养基瓶中。分装并储存在 4 °C。
2. 将一圈带背衬的双面胶粘剂连接到专用的 60 mm 培养皿上，并在底部切出一个 20 mm 的孔。将背衬留在粘合环上，压出培养皿和粘合剂之间的任何气泡。
3. 准备材料。将合成的³³ 3.4 kDa PEGDA 从 -80 °C 冰箱中取出，使其达到室温。在光聚合水凝胶之前至少 15 分钟打开白光源。
4. 在通风橱中，将 1 mL 含 TEOA 的 HBS 添加到铝箔覆盖的 2 mL 琥珀色离心管中（用于防止光引发剂伊红 Y）曝光。在 DI H₂O 中加入 10 μL 1 mM 伊红 Y 二钠盐。
5. 在通风橱中，用巴斯德移液管将少量 1-乙烯基-2-吡咯烷酮 （NVP） 提取到玻璃烧杯中。从该体积中，将 3.5 μL NVP 移液到装有 HBS、TEOA 和伊红 Y 的琥珀色离心管中。
6. 在第二个铝箔覆盖的 2 mL 琥珀色离心管（用于防止预聚物溶液的错误光活化）中，加入 10 mg 3.4kDa PEGDA。加入 0.2 mL 的 HBS、TEOA、伊红 Y、NVP 溶液，得到 5% w/v PEGDA 预聚物溶液。涡旋直至 PEGDA 完全溶解。使用功率计和探测器棒，将白光源的强度调整为 95 mW。
7. 构建聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 模具
   为了
   1. 便于处理，在较大的表面（玻璃、聚苯乙烯组织培养皿）上构建 PDMS 模具⁷，并组装模具，使模制水凝胶适合直径为 20 mm 的圆圈。
   2. 为了生成厚度为 500 μm 的矩形水凝胶，将两个 500 μm 厚的 PDMS 垫片放在 PDMS 表面上，以创建两个定义的水凝胶边缘。
   3. 包括一个 300 μm PDMS 垫片，以在水凝胶表面施加 300 μm 深的孔，这有助于引入液体。
8. 将 60 μL 的 5% w/v PEGDA 预聚物溶液移液到 PDMS 模具上。小心不要在移液过程中引入任何气泡。
9. 将 [3-（甲基丙烯酰氧基）丙基] 三甲氧基硅烷 （TMPSA） 官能化的⁷、直径为 40 毫米、#1.5 玻璃盖玻片居中并放置在溶液顶部。确保盖玻片放在 500 μm PDMS 垫片上。水凝胶将与甲基丙烯酸酯盖玻片结合，并防止水凝胶漂浮在溶液中。
10. 将 PDMS、PEGDA 预聚物溶液并在白色光源下盖玻片组件 3 分钟。
11. 在模具和盖玻片之间流动 DI H₂O 以将水凝胶与 PDMS 分离。用 DI H₂O 冲洗水凝胶。用实验室纸巾擦干盖玻片的边缘。小心不要触摸或吸走水凝胶中的水。
12. 从粘合剂上去除背衬后，将盖玻片粘附在准备好的培养皿上，并轻轻去除粘合剂和玻璃之间的气泡。将水凝胶浸入培养皿中，用 DI H₂O.
    注意：如果用 DI H₂O 冲洗，用氮气干燥并保持无尘，PDMS 模具可以重复使用以制造额外的水凝胶。

5. 通过基于激光的降解制造血管衍生的微流体网络

1. 在激光扫描共聚焦显微镜和显微镜软件开启的情况下，在"维护"选项卡中选择物镜"W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC VIS-IR M27 75mm"。在 "Acquisition" 选项卡中，确保必要的激光线（514 nm 氩激光和 790 nm 140 fs 脉冲 Ti：S 激光）已打开并预热。
2. 设置水凝胶以形成入口通道
   1. 将水凝胶和培养皿安装在载物台插件上，然后将载物台插件放在显微镜载物台上。用至少 5 mL 的 DI H₂O 填充培养皿。在将水浸物镜降低到 DI H₂O.
      之前，用眼睛将水凝胶和孔特征居中 注意：不要用物镜压碎水凝胶——两者绝对不能接触！
   2. 要找到水凝胶，请从步骤 2.2 切换到"水凝胶可视化"配置。单击"实时"打开激光线并使物镜更靠近水凝胶，直到可以看到水凝胶顶部的伊红 Y 信号（由 Ch1 荧光检测器检测到><）。 注意：为了轻松找到水凝胶，可以增加百分比功率或打开针孔。然而，一旦物镜聚焦在水凝胶上，就降低百分比功率以保护荧光检测器，并将针孔减少到 1AU，以避免检测器过度饱和并准确找到水凝胶表面。
   3. 在"阶段"窗口中，标记水凝胶的顶部和底部以及孔底部的位置。
      注意：此处的 z 值将有助于确定水凝胶的厚度和孔的深度。
   4. 使用纵杆在 X 和 Y 方向上移动以找到井的边缘。将水凝胶放在屏幕的右侧，孔放在左侧，反之亦然。 让水凝胶填充不超过三分之二的视野。
   5. 通过在"聚焦"窗口中将"步长"设置为"150"，然后单击"Z 位置"框旁边的向下箭头，将聚焦平面向下放入水凝胶中 150 μm。如有必要，重复步骤 5.2.4。
      注意：入口的 x、y 和 z 位置完全取决于虚拟掩码的设计。
   6. 严重：将"舞台"窗口中的 X 和 Y 位置归零，删除所有其他标记的位置，并仅标记此位置。
      注意：如果不执行此步骤，显微镜微距将无法正确恢复先前保存的配方中的位置，并且水凝胶不会在所需位置降解。
3. 形成入口通道
   1. 使用"区域"窗口中的矩形按钮"捕捉"图像并绘制一个矩形区域，该区域将成为血管网络的入口。
      注意：确保部分区域延伸到孔中，以确保入口将孔连接到血管网络。
   2. 在"区域"窗口中生成的 ROI 旁边，选择"Acquisition"并取消选择"Bleach"和"Analysis"。
   3. 保存 "Hydrogel Visualization" 配置，取消选择 "Regions"，然后更改为 "Channel Formation" 配置，在步骤 2.3 中设置。在 "Channel Formation" 配置中，再次选择 "Regions"。
      注：在 "Hydrogel Visualization" 和 "Channel Formation" 配置之间切换时，请务必取消选择屏幕左上角的区域。有时，如果不这样做，区域扩展可能会在配置之间意外更改。
   4. 在 "Channel Formation" 配置中，确保仅选择 "Regions" 和 "Z-Stack" 。在"Z-Stack"窗口中，单击顶部的"Center"按钮，然后单击"Offset"上方的"Center"按钮，将 z 堆栈的中心设置为当前 Z 位置。根据入口需要多大，将 "Slices" 的数量设置为 "Interval" 为 "1"。Z 堆栈的大小将显示在 "Range" 下方。
   5. 检查 "Acquisition Mode" 窗口中的 "Speed" 是否设置为 "3"，以及 "Channels" 窗口中的 "Percent Power" 是否设置为 "100"。保存配置并单击 "Start Experiment" 按钮。
      注：在多个平面上降解相同的简单形状不需要显微镜宏观，如此处执行以生成入口通道。仅当降级每个单独平面上的不同区域时，才需要该宏，并且它用于将虚拟蒙版存储在配方中。
   6. 为了在降解过程中可视化水凝胶，如果视野中的区域为黑色，则增加"通道"窗口中的"增益（主）"，如果该区域为白色，则减小"增益（主）"。
      注：此处气泡的形成表明激光诱导的水凝胶降解。
   7. 要多次降低进样口性能，而不是仅降低一次，请调整"Time Series"窗口中的"Cycles"（周期）。
   8. 在 "Hydrogel Visualization" 配置中，单击 "live" 以确保形成入口。
4. 设置水凝胶以生成微流体网络
   1. 在 "Regions" 窗口中，加载任何 .OVL 文件，然后单击箭头按钮以查看视野中的 ROI。
   2. 单击"实时"实时扫描"水凝胶可视化"配置，并使用纵杆或"阶段"窗口将水凝胶定位在 X 和 Y 方向，以便入口连接到血管网络内的正确位置><。 注意： 确保虚拟掩模的 ROI 与之前形成的入口略有重叠。
   3. 使用"聚焦"窗口中的"步长"并单击"Z 位置"框旁边的向下箭头，将聚焦平面从先前的中心 Z 位置下降 50 μm，或从水凝胶表面下降 200 μm。这将是显微镜 macro 中的第一个位置。
      注意： 沿 z 方向移动的实际距离取决于网络设计。确保所需的网络在 z 方向上不会超出水凝胶的顶面或底面。
   4. 关键：将"舞台"窗口中的 X 和 Y 位置归零，删除所有其他标记的位置，只标记此位置。
      注意：这将是显微镜宏观的起点。配方将回到水凝胶的表面。
   5. 在 "Hydrogel Visualization" 配置中 "捕捉" 图像，删除并取消选择 "Regions"，然后保存配置。
5. 生成微流体网络
   1. 更改为 "Channel Formation" 配置，只选择 "Time Series" 和 "Bleaching" 窗口。验证"Time Series（时间序列）"和"Bleaching"（漂白）窗口的设置是否与步骤 2.3.7 和 2.3.8 中最初设置的设置相同。
   2. 将"采集模式"窗口中的"速度"设置为"8"，将"通道"窗口中激光线的功率百分比设置为"0.2"。保存配置。
   3. 按照步骤 3.5 打开显微镜宏。在宏的"保存"选项卡上，从步骤 3 中选择之前制作的配方，然后单击"应用"。
      注意：请勿点击"商店"，否则配方将被覆盖！
   4. 检查所有选项卡上的设置，并验证虚拟掩码 （.OVL 文件）仍与下拉列表中的 Z 位置正确关联。还要检查第一个 Z 位置是否与显微镜软件的"载物台"窗口中的标记位置相匹配。
      注意：与直觉相反，下拉列表中的第二个位置将在物理上位于第一个位置的上方，因为显微镜微距将从水凝胶底部（离物镜最远）到水凝胶顶部（离物镜最近）。
   5. 再次保存 "Channel Formation" 配置，然后单击显微镜宏中的 "Update"。单击"否"到"覆盖当前位置列表"，然后单击显微镜宏中的"开始"以开始配方。

6. 可视化微流体网络

1. 要查看降解后的水凝胶和形成的微流体网络，请关闭显微镜微距。切换到 "Hydrogel Visualization" 配置以查看水凝胶的 eosin Y 信号;降级的网络将显示为暗
   注：显微镜宏观运行时无法看到水凝胶降解。
2. 要具体查看微流体网络，请在较低的激光功率下使用"水凝胶可视化"配置，以实现引入的荧光素 （FITC） 标记的葡聚糖的成像，其信号比水凝胶的天然曙红 Y 信号更亮。
3. 在引入荧光标记的葡聚糖之前，使用实验室纸巾从水凝胶中的孔中吸水。在 DI H₂O 中移液 10 μL 5 mg/mL 2,000 kDa FITC 标记的葡聚糖（通过 0.2 μm 注射器过滤器预过滤><）。 注：使用任何尺寸为 2,000 kDa 或更大的葡聚糖，以防止扩散到凝胶中。如果成像时间超过 30 分钟，请使用湿度为 60%（或更高）的孵育台，以防止水凝胶干燥和水分从 FITC 标记的葡聚糖溶液中蒸发。
4. 从载物台上取下水凝胶和培养皿并标记培养皿，以便在以后的实验中轻松定位形成的血管网络。

结果

为了演示基于图像引导的激光降解水凝胶技术以构建三维血管来源的微流控网络，我们采用了一组通过刀锋扫描显微镜（KESM）获取的小鼠脑血管三维图像序列^26,27。从该较大规模的微血管数据集中选取一个三维区域，并如上所述将其转换为一系列虚拟掩模，用于图像引导下的微流控网络构建。制造完成后，将所得微流控网络用含有FITC标记的2,000 kDa葡聚糖溶液灌注，并通过共聚焦显微镜成像。用于定义网络结构的体内血管图像序列（图1A和C）与所制备的微流控网络（图1B和D）分别生成Z轴投影图像（图1A和B）和三维重建图像（图1C和D）。图像对比表明，基于图像引导的激光降解水凝胶技术能够制造出在尺寸、迂曲度和复杂结构方面均模拟体内血管系统的三维仿生微流控网络。该技术适用于构建包含多种直径范围的网络；在图1中，所生成的通道直径范围为3.3至28.8 µm。请注意，图1B左上方以及图1D左侧角落中较大的矩形结构是用于向网络引入流体的进样通道。

图1：血管来源的微流控网络 一系列源自小鼠脑血管图像堆栈的虚拟掩膜（A 和 C)，用于在 PEGDA 水凝胶中构建嵌入式的三维仿生微流控网络（B 和 D) 通过图像引导的激光降解技术实现。微流控网络灌注了2,000 kDa FITC标记的葡聚糖，并通过共聚焦显微镜成像。Z-投影（A 和 B）和三维渲染图（C 和 D两个网络的密度、组织结构和整体构型展示了生成微流控网络的能力，这些微流控网络可重现目标结构的密度、组织和整体架构 体内 血管系统。箭头（D) 标记为用于引入葡聚糖的矩形入口。比例尺为 50 µm。 请点击此处以查看此图的放大版本。

我们采用了两种方法——压力头和注射泵，以在这些嵌入式微流控网络中启动流体流动。例如，制备了一个横截面为30 × 30 µm的矩形通道，用于连接微模压PEGDA水凝胶中的两个孔洞。图2A），通过压力差驱动流体流动⁷左侧小孔中产生的压力头驱动液体流经微通道并进入右侧小孔。在 图2A，通过延时显微镜观察到四甲基罗丹明（TRITC）标记的70 kDa葡聚糖最初前沿穿过通道。随后，在 图2B一个直径为10 µm的荧光聚苯乙烯微球从左侧小孔经通道流向右侧小孔。通过控制入口微模压小孔中的液体体积来调节流动持续时间，并通过入口与出口小孔之间产生的流体静压梯度来控制流速。这种由压力差驱动的微流体流动在微模压水凝胶中提供了一种简单的流动诱导方法，无需外部容器或注射泵。

图 2：微模压 PEGDA 水凝胶中的压差驱动流动。通过微模压技术制备 PEGDA 水凝胶，形成包含两个储液井并通过嵌入式微通道相连的结构。在左侧储液井中建立压差，以驱动 TRITC 标记的 70 kDa 葡聚糖（A1-A3）和 10 µm 聚苯乙烯微球（B1-B3）通过横截面为 30 × 30 µm 的矩形通道从一个储液井流向另一个储液井。比例尺为 50 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

或者，为了在微流控网络中产生稳定的液体流动，可通过在具有进样口和出样口的二级微流控装置内对水凝胶进行光聚合，从而启动由注射泵驱动的流动。在图3A中，展示了一种市售的预制微流控装置，其中一条1 mm宽的水凝胶带在装置宽度方向上通过光聚合形成⁷。采用基于激光的降解方法，按照本文所述用于独立水凝胶的相同方案，在封装于装置内的水凝胶中构建微流控通道和网络。在图3B中可观察到由注射泵产生的流动，其中在装置内的水凝胶中构建了一条直径为20 µm的圆柱形通道。在此直径为20 µm的通道中，当无流体流动时，单个直径为2 µm的荧光聚苯乙烯微球可被清晰分辨（图3B1）；而当施加5 µL/s的流速时，微球穿过视野，表现为拖尾现象（图3B2）。该方法同样被用于诱导流体通过一个二维的、源自血管结构的网络，以监测TRITC标记的65 kDa葡聚糖在该网络中的流动及其向周围水凝胶的扩散情况（图3C）。

图3：在微流控装置中光聚合的PEGDA水凝胶内由注射泵驱动的流动。 一种商用的预制微流控装置（A），其微通道尺寸为17 × 3.8 × 0.53 mm（x,y,z），内部包含一个光聚合形成的1 × 3.8 × 0.53 mm（x,y,z）的PEGDA水凝胶，黑色箭头所示。在水凝胶中降解出一条直径为20 µm的圆柱形通道，并将直径为2 µm的聚苯乙烯微球泵入装置中（B）。在无流体流动时，微球清晰可分辨（B1），但在流速为5 µL/s时呈现为条纹状（B2）。在另一块封装的水凝胶中，构建了一个二维血管衍生网络，并将TRITC标记的65 kDa葡聚糖泵入该网络（C）。采用延时显微镜监测荧光葡聚糖填充通道并扩散至周围水凝胶的过程。图（B）和（C）中的白色箭头表示流体流动方向。（C）中的标定条表示荧光葡聚糖的强度。比例尺在（B1）和（B2）中代表20 µm，在（C）中代表50 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

关键在于覆盖显微镜软件的标准功能，以实现使用虚拟掩模进行图像引导的激光降解，显微镜宏的设置与操作必须谨慎进行。显微镜软件与显微镜宏之间的接口有时可能违反直觉，因此在确定两个程序中的最佳设置以开发本方法时投入了大量努力。建议操作者对激光扫描共聚焦显微镜的基本使用具备一般性理解，尤其是在尝试激光降解前，应熟练掌握通过"Stage"和"Focus"窗口在x、y和z维度上定位水凝胶并正确放置的操作。此外，入口通道的制备对本实验方案至关重要；悬浮的荧光物质必须能够进入微流控系统，才能成功实现成像和网络表征。需要注意的是，本实验方案适用于配备特定飞秒脉冲激光器、运行特定版本显微镜软件和显微镜宏的特定激光扫描共聚焦显微镜（详见“特定材料/设备清单”中的说明）。我们发现，较新版本的显微镜宏缺乏图像引导激光控制所必需的控制功能。尽管可使用其他显微镜平台和脉冲激光源，但本方案专门针对该系统设计，若更换平台、激光源或软件，则需相应调整。然而，本方案中的基本原理仍然适用。

对该方案的一种可能改进是改变水凝胶的组成。本研究中采用的是5 wt%、3.4 kDa的PEGDA水凝胶，但基于激光的降解技术（除用于生成微流控网络外）已被应用于降解多种合成和天然水凝胶，包括聚乙二醇化纤维蛋白原^21,22、丝蛋白水凝胶²³以及胶原蛋白²⁴。调整激光功率、扫描速度、Z层间间距以及重复次数，将有助于确定在其他水凝胶体系中构建微流控网络的最佳参数。

该技术目前的一个局限性在于，在合理的时间内可降解的水凝胶总体积有限。为了在水凝胶内形成开放的空腔或微流体结构，当使用37.7 nJ/µm²的激光能量密度时，激光驻留时间必须达到或超过8.96 µs/像素（或激光扫描速度为0.021 µm/µs）。在这些参数设置下，降解0.014 mm³体积内的血管结构需要1.4小时（如图1所示）。若采用4.48 µs/像素或更低的激光驻留时间，所提供的能量不足以完全降解本研究所使用的水凝胶配方。通过采用不同的水凝胶组成，有望克服这一限制。使用含有光敏组分的光可解离凝胶^34-36，或具有较大双光子吸收截面的水凝胶^21-24，是两种可行的方案，可降低所需能量并实现更快的降解速度。在尺寸限制方面，已有研究在水凝胶中加工出深达1.5 mm的结构⁷。可实现的加工深度取决于物镜的工作距离，使用专为in vivo成像优化的超长工作距离物镜可进一步增加深度。使用20X（NA1.0）水浸物镜所制备的最小通道⁷，其宽度为3.3 µm，深度为8.9 µm，与图1中生成的最小通道尺寸相当。尽管其他实验室曾使用较低数值孔径（NA）的物镜^21,23,24，但我们预计，采用更高NA的物镜可在牺牲工作距离的前提下，制造出特征尺寸更小的微流体网络。然而，最终该技术的分辨率取决于聚焦激光束的点扩散函数、激光扫描特性、激光输出能量以及被降解材料对激光的吸收特性。

此外，必须根据水凝胶的性质（交联密度、大分子/单体分子量、质量百分比以及水凝胶类型：蛋白质基与合成型）来优化激光参数（扫描速度、能量密度、虚拟掩模间距及重复次数），因为这些因素会固有地改变激光与材料的相互作用，从而影响最终加工分辨率。由于激光能量输出还受所用物镜的影响，在更换不同物镜时还需进行额外的参数优化。就相关成本而言，需要配备带有脉冲激光器的显微镜，尽管可使用多种不同物镜，但应优先选择高数值孔径（NA）且工作距离较长的物镜（用于 体内 成像可能成本较高。

除了本文详细描述的方案外，使用该技术制备的微流控网络还可于通道成型后通过功能化修饰细胞黏附肽，以诱导内皮细胞黏附及管腔形成⁷。此外，在通道降解前，若于体相材料中引入细胞可降解的肽序列⁹，则可实现细胞向水凝胶内部及穿过水凝胶的迁移行为研究。为实现水凝胶内微流控网络的持续流体化，可将水凝胶在较大的流体装置或外壳中进行光聚合，如图2和图3所示⁷。

通过血管发生或血管生成的自组装形成血管网络^8-12 提供了一种简单的方法，可在相对较大的水凝胶体积内诱导血管化。尽管该方法能够形成可灌注的流体网络，但难以直接控制血管网络的尺寸、迂曲度、密度及整体结构。由于这一局限性，不同实验之间的血管内流动轮廓和剪切速率可能存在差异。相比之下，微加工技术^13-16 可直接控制网络结构，但通常受限于无法生成毛细血管尺寸的微小通道，或难以制造出模拟密集网络的结构 体内 血管结构。本文所述的基于激光的水凝胶降解技术虽为新近重新用于微流控结构生成，但其同时克服了现有微加工方法在结构控制和尺寸限制方面的不足，能够构建出在密度、迂曲度、尺寸范围及整体结构上均模拟天然血管的三维仿生微流控网络 体内 血管系统。此外，可在单个水凝胶中生成多个流体网络，从而实现对网络间物质运输的研究⁷. 对于致力于更精确模拟的组织工程应用 体内 转运过程 体外，此处所述的高分辨率水凝胶包埋微流控网络非常适用。我们预计该方案将有助于开发更精确模拟天然组织的构建物 体内 用于药物筛选装置的运输 体外 疾病模型

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MATLAB	Mathworks	R2015a	在实验方案中称为“"编程软件"；有关算法的详细信息，请参见文献来源9
FIJI（Fiji is Just Image J）	NIH	版本 1.51a	在实验方案中称为“"图像处理软件"”
LSM 780 共聚焦显微镜	Zeiss		在实验方案中称为“"激光扫描共聚焦显微镜"”；用于基于激光的水凝胶降解
Zen 2010B SP1	Zeiss	发布版本 6.0	在实验方案中称为“"显微镜软件"”；用于 Zeiss LSM-780
Multitime, 2010	Zeiss	v16.0	在实验方案中称为“"显微镜宏"”；用于 Zeiss LSM-780（需与 Zen 配合使用）
物镜 W Plan-Apochromat 20X/1.0 DIC D=0.17 M27 75 mm	Zeiss	421452-9880-000	用于 Zeiss LSM-780
Chameleon Vision II 锁模钛宝石激光器	Coherent		在实验方案中称为“"高功率脉冲激光器"”
氯化钠	Sigma-Aldrich	S5886-1KG
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-250G
三乙醇胺（TEOA）	Sigma-Aldrich	90279-100ML	易燃；对皮肤和眼睛有刺激性；应在通风橱中操作
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	S5881-500G
150 mL 真空过滤杯，带 0.2 µm PES 膜	VWR	10040-460
PEGDA	实验室自制		合成方法请参见文献来源33；需在氩气环境下储存
曙红Y二钠盐	Sigma-Aldrich	E6003-25G
1-乙烯基-2-吡咯烷酮（NVP）	Sigma-Aldrich	V3409-5G	需在氩气环境下储存；具有致癌性；应在通风橱中操作
3M 双面胶带，9500PC，6.0 mil	Thomas Goldkamp	37728
Flexmark 90 PFW 衬垫	FLEXcon	FLX000620	用于双面胶带的操作背衬
SC 型绘图仪（胶粘剂切割器）	USCutter	SC631E	用于将胶粘剂切割成环形，以连接盖玻片与培养皿
60 mm 培养皿，带 20 mm 孔	MatTek Corporation	P60-20-F-NON
高强度照明器（白光光源）	Fiber-Lite	4715MS-12WB10
功率计	Newport	1916-R	使用白光光源时检测 524 nm 处的功率
超薄型探头检测器	Newport	918D-ST	与功率计配合使用
Sylgard 184 硅橡胶弹性体试剂盒	Dow Corning	3097358-1004	用于制作 PDMS 模具；制备方法请参见文献来源7
TMPSA功能化#1.5盖玻片，40 mm圆形	实验室自制		制备方法请参见文献来源7
葡聚糖，荧光素标记，分子量2,000,000，阴离子型，可与赖氨酸交联	Life Technologies	D7137	可使用其他标记葡聚糖；2,000 kDa 的分子量不易扩散进入5% 3.4 kDa PEGDA水凝胶
1 mL 注射器，鲁尔锁扣式	BD	309628
Acrodisc 注射器滤器，0.2 µm Supor 膜，低蛋白结合	Pall	PN 4602
sticky-Slide VI0.4	Ibidi	80601	可用于承载水凝胶的微流控装置