Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

摘要

该协议概述了图像引导、基于激光的水凝胶降解的实施，以制造嵌入聚（乙二醇）二丙烯酸酯 （PEGDA） 水凝胶中的血管衍生仿生微流体网络。这些仿生微流控系统可用于组织工程应用、体外疾病模型的生成以及先进的"片上"设备的制造。

摘要

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic networks embedded in PEGDA hydrogels. Here, we describe the creation of virtual masks that allow for image-guided laser control; the photopolymerization of a micromolded PEGDA hydrogel, suitable for microfluidic network fabrication and pressure head-driven flow; the setup and use of a commercially available laser scanning confocal microscope paired with a femtosecond pulsed Ti:S laser to induce hydrogel degradation; and the imaging of fabricated microfluidic networks using fluorescent species and confocal microscopy. Much of the protocol is focused on the proper setup and implementation of the microscope software and microscope macro, as these are crucial steps in using a commercial microscope for microfluidic fabrication purposes that contain a number of intricacies. The image-guided component of this technique allows for the implementation of 3D image stacks or user-generated 3D models, thereby allowing for creative microfluidic design and for the fabrication of complex microfluidic systems of virtually any configuration. With an expected impact in tissue engineering, the methods outlined in this protocol could aid in the fabrication of advanced biomimetic microtissue constructs for organ- and human-on-a-chip devices. By mimicking the complex architecture, tortuosity, size, and density of in vivo vasculature, essential biological transport processes can be replicated in these constructs, leading to more accurate in vitro modeling of drug pharmacokinetics and disease.

引言

The vascular system, consisting of both lymphatic and cardiovasculature, forms highly dense networks that are essential for the transport of nutrients and oxygen and for the removal of metabolic waste. Accordingly, cells residing in vascularized tissues are never more than 50-100 µm away from a vessel¹. The ability to reproduce in vivo vascular architecture in vitro is critical to accurately model in vivo transport processes using engineered constructs. With a recent drive to develop organ-on-a-chip devices² for high-throughput drug screening^3,4 and disease modeling^5,6, methods to create microfluidic networks that recapitulate in vivo-like transport in synthetic or natural hydrogels are drawing significant interest. To enhance the biomimicry of microtissues used in these devices, we developed an image-guided, laser-based hydrogel degradation method that utilizes three-dimensional (3D) image stacks of native vasculature as templates to generate vascular-derived microfluidic networks embedded in PEGDA hydrogels⁷. This protocol outlines the use of a commercially available laser-scanning confocal microscope equipped with a femtosecond pulsed laser to fabricate vascular-derived, biomimetic microfluidic networks in PEGDA hydrogels via image-guided, laser-based degradation.

Current approaches to fluidize hydrogels include the induction of vasculogenic^8-10 or angiogenic^10-12 endothelial cell self-assembly and microfabrication techniques to create pre-defined channels for endothelialization^13-16. While self-assembled networks recapitulate the density and complex architecture of microvasculature, they are often more permeable than in vivo networks^11,17,18, which may be problematic in modeling transport for drug screening applications. Self-assembled networks consist of physiologically relevant, capillary-sized vessels, but they can be difficult to integrate with bulk fluid flow due to limitations in generating larger arteriole-sized vessels. As there is no direct control over the assembly of these networks, the final architecture can vary from sample to sample, making it difficult to repeatedly produce networks with the same fluid flow and transport properties.

To generate 3D, hydrogel-embedded microfluidic networks with repeatable geometry and well-defined architecture, a number of microfabrication techniques have been developed, including modular assembly¹³, 3D printing of sacrificial materials¹⁶, direct-write assembly¹⁴, and omnidirectional printing¹⁵. Applying these methods, microfluidic architecture, and therefore fluid flow and transport properties, can be repeatedly fabricated across many constructs. A major limitation of these approaches, however, is the inability to create microfluidic networks with capillary-sized features, 4 to 10 µm¹⁹. Most microfabrication techniques are often limited to features ranging from 150 to 650 µm in diameter^13,16. Some existing techniques are capable of generating hierarchical networks with channels across a wide diameter range, 10 to 300 µm for direct-write assembly¹⁴, and 18 to 600 µm for omnidirectional printing¹⁵, but they are limited in their ability to generate dense networks or to produce multiple microfluidic networks in close proximity within a single construct⁷.

To overcome some of these limitations, we developed an image-guided, laser-based hydrogel degradation technique that allows repeatable fabrication of biomimetic, hierarchical microfluidic networks that recapitulate the architecture of in vivo microvasculature. To do so, a 790 nm, 140 femtosecond (fs) pulsed laser operating at 80 MHz is raster-scanned in desired 3D locations within a hydrogel, as defined by images of in vivo vasculature. We speculate that the degradation process operates through the laser-induced optical breakdown of water, the resultant plasma formation, the subsequent rapid thermoelastic expansion of water, and the local degradation of the hydrogel as the water expands²⁰. This mechanism varies slightly from laser-based degradation of protein-based hydrogels^21-24. Unlike PEGDA, which has a low multiphoton cross-section, proteins often have a large multiphoton cross-section and are therefore degraded via a multiphoton absorption-induced chemical breakage²³. To generate image-guided microfluidic networks, the laser shutter is controlled by image-derived virtual masks, which consist of a mosaic of regions of interest⁹ that define the microfluidic architecture. Using this approach, we have demonstrated the ability to fabricate 3D vascular-derived biomimetic microfluidic networks, which recapitulate the dense and tortuous architecture of in vivo vasculature, in order to locally control the porosity of hydrogels by altering the amount of energy delivered during degradation. We have also been able to generate two independent microfluidic networks that intertwine in close proximity (15 µm) but never directly connect⁷. We have also demonstrated the ability to endothelialize laser-degraded microchannels through post degradation functionalization with the integrin ligating peptide sequence, Arginine-Glycine-Aspartic Acid-Serine (RGDS), to promote endothelial cell adhesion and lumen formation⁷.

With this protocol, the generation of complex microfluidic networks in PEGDA hydrogels is made possible via image-guided, laser-based degradation using a commercially available microscope accessible on many university campuses. As the degradation process is guided by digital, virtual masks, this fabrication technique is amenable for the creative design of microfluidic networks, allowing its use in a wide variety of applications. We anticipate that the method described here will be most advantageous in designing biomimetic organ- and human-on-a-chip devices capable of replicating biological transport processes important in modeling drug transport². This fabrication technique may also be of interest for the generation of in vitro disease models, including cancer metastasis^5,6 and blood-brain barrier models²⁵. As laser-based hydrogel degradation has previously been used to create tracks for the guidance of neuronal outgrowth^21-23, the image-guided extension of this technique could prove useful in advanced tissue engineering strategies to position cells in user-defined 3D spatial arrangements.

方案

1. 生成虚拟掩码

注意：选择小鼠脑微血管系统的 3D 图像堆栈作为本协议的微流体模型，它是从包含整个小鼠大脑微血管系统图像的更大数据集中挑选出来的。通过刀刃扫描显微镜 （KESM） 获取微血管图像^26,2;类似的微血管数据可通过 KESM 小鼠脑图谱²⁸ 公开获得。

1. 打开图像处理软件²⁹，打开并裁剪天然脉管系统的3D TIF图像堆栈，以便要在水凝胶内生成的所需微流体网络适合450μm×450μm×1.5mm（x×y×z）窗口。为此，请在所需区域周围画一个正方形，然后单击"图像"→"裁剪"。通过单击"图像"→"复制"来删除 z 方向的切片，然后键入所需的切片范围。
   注：这可确保所需的特征适合视场 （x x y）（使用框架尺寸为 2,884 x 2,884 像素，变焦为 0.8 的 20X （NA1.0） 水浸物镜时为 531.2 x 531.2 μm，使用激光扫描共聚焦显微镜时）和 20X （NA1.0） 水浸物镜的工作距离 （z）。如果未知，则可以通过获取具有所需物镜和设置的图像来确定其他系统的视场。
2. 通过单击"图像"→"变换"→"旋转"，旋转图像堆栈，使特征主要与光栅扫描的方向或 x 方向对齐。这减少了制造所需的时间。
3. 缩放裁剪后的图像堆栈，使像素大小匹配或超过共聚焦显微镜上用于降解的设置（使用20X（NA1.0）水浸物镜时，像素大小为2,884 x 2,884像素，缩放比例为0.8时，为0.184μm/像素）。为此，请单击"图像"→"调整"→"大小"，然后输入"宽度"的"2446"（即 450 μm，或图像大小除以 0.184 μm/像素）。
4. 通过键入 "Ctrl + Shift + T" 对图像堆栈进行阈值/二值化。取消选择 "Dark Background"，然后单击 "apply" → "ok"。通过单击"Image"→"Lookup Tables"→"Invert LUT"来完成该过程。
5. 在编程软件⁹ 中使用自定义算法（源代码可在参考手稿的补充材料中找到），用平行于光栅扫描方向（x 方向）的单个像素高四边形的马赛克拟合二值化（白色）特征，以生成引导激光位置和快门的感兴趣区域 （ROI）^9， 7,30,31,32.
   注意：自定义算法⁹ 将 TIF 图像堆栈中的每个单独平面转换为 RLS 文件。
6. 将 RLS 文件的文件扩展名更改为 。在降解过程中使用的 OVL。

2. 配置激光扫描共聚焦显微镜

注意：虽然可以使用其他配备脉冲激光器的激光扫描显微镜，但此处的设置和协议描述了激光扫描显微镜 （LSM） 与其软件的结合使用。

1. 打开激光扫描共聚焦显微镜后，打开显微镜软件，然后单击"启动系统"。在"维护"选项卡中选择物镜"W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC VIS-IR M27 75mm"。
2. 设置 "Hydrogel Visualization" 配置
   1. 在 "Acquisition" 选项卡中，确保选择 Laser line（514 nm 氩激光）并在 "Laser" 窗口中打开。注：该通道用于通过曙红 Y 荧光对水凝胶进行成像，用于定向目的⁷。
   2. 在"Imaging Setup"窗口中，将"Mode"设置为"Channel Mode"，将"Switch track every"设置为"Frame"，然后选择"Track1"。
   3. 在"光路"窗口中，仅选择范围为 516 至 735 nm 的 Ch1 荧光检测器;可见光线上的主分束器 （MBS） 458/514 滤光片;以及不可见光线上的板。取消选择明场光电倍增管检测器"T-PMT"。
   4. 在"采集模式"窗口中，检查是否选择了正确的物镜，并将"扫描模式"设置为"帧"，将"帧大小"设置为"2884"（X 和 Y），将"线步长"设置为"1"，将"数字平均"设置为"1"， "平均模式"为"线"，"平均方法"为"平均值"，"位深度"为"16 位"，"方向"为"<->"，用于双向扫描。
   5. 在"采集模式"窗口中，根据需要设置"速度"，并将"校正 X"和"Y"设置为"0.05"或根据需要调整所使用的特定显微镜。取消选择 "HDR"。
   6. 在"采集模式"窗口中，确保"扫描区域"显示"图像大小"为"531.2 μm x 531.2 μm"，"像素大小"为"0.18"，"缩放"设置为"0.8";将所有其他"扫描区域"值设置为零。
   7. 在 "Channels" 窗口中，选择 "Track1" 作为 Ch1 荧光检测器。选择激光线"514"，百分比功率为"10.0"，"针孔"为"1AU"，初始"增益（主）"为"800"，"数字偏移"为"0"，"数字增益"为"1".
      注意：根据所使用的特定显微镜的需要调整这些设置。
   8. 将此配置另存为 "Hydrogel Visualization"。
3. 设置 "Channel Formation" 配置
   1. 在 "Acquisition" 选项卡中，确保激光线（790 nm 140 fs 脉冲 Ti：S 激光器）已选中，并在 "Laser" 窗口中打开。将"GDD Correction"设置为"4000"，以获得 790 nm 处的最大功率输出。
   2. 按照步骤 2.2.2 中的说明设置"Imaging Setup"（成像设置）窗口。
   3. 在"光路"窗口中，确保未选择荧光检测器，可见光线上使用 MBS 458/514/561/633 滤光片，不可见光线上使用 MBS 760+ 滤光片。取消选择明场光电倍增管检测器"T-PMT"。
   4. 在 "Acquisition Mode" 窗口中，检查是否列出了正确的物镜。将 "Speed" 设置为 "3" 和步骤 2.2.4 中概述的所有其他设置。
   5. 在"Channels"窗口中，选择"Track1"作为 T-PMT 检测器。选择激光线"790"，百分比功率为"100.0"，初始"增益（主）"为"800"，"数字偏移"为"0"，"数字增益"为"1"。
   6. 在 "Stage" 窗口中，单击 "set zero" 将舞台归零。通过单击"标记"来标记位置。这对于在步骤 3 中将虚拟掩模上传到显微镜宏观至关重要。
   7. 在 "Time Series" 窗口中，将 "Cycles" 设置为 "1" ，将 "Interval" 设置为 "0"。
   8. 在"漂白"窗口中，选中"# 次扫描后开始漂白"框，并将其设置为"0 of 1"的值。选择"Different scan speed"，值为"3"（对应于 8.96 μs/像素的像素停留时间）。选择 "Safe bleach for GaAsP"。
   9. 在"漂白剂"窗口的激光线部分，选择 790 激光线并将百分比功率设置为"100.0"。保持漂白窗口中的所有其他框未选中。将漂白剂设置保存在 "Bleach" 窗口中。
   10. 将此配置另存为 "Channel Formation".
       注意："Z-Stack"、"Regions"、"Focus"和"Stage"窗口对于此协议也很重要，但不需要在初始配置期间设置或调整。

3. 创建配方并将虚拟遮罩上传到显微镜软件和宏

1. 在激光扫描共聚焦显微镜仍在运行且显微镜软件仍处于开启状态的情况下，在"通道形成"配置中仅选择"区域"窗口（"开始实验"按钮旁边）。
2. 为确保掩模正确加载到显微镜宏观上，请将"通道"窗口中的功率百分比设置为"0.2"，将"采集模式"窗口中的"速度"设置为"8"，然后单击屏幕左上角的"捕捉"。
3. 在图像的"信息"选项卡中，检查图像大小是否仍为"531.2 μm x 531.2 μm"，像素大小为"0.18"。如果这些值不正确，请再次检查"Frame Size（帧大小）"和"Zoom（缩放）"值。
4. 关键：在打开显微镜微距之前，请检查"载物台"窗口中的 X 和 Y 位置是否已归零，并且位置是否已标记。请参阅步骤 2.3.6。
5. 要打开显微镜宏，请键入"Alt+F8"，单击"加载"，然后选择正确的版本。有关详细信息，请参阅特定材料/设备清单。在 "Macro Control" 窗口中将打开一长串子宏。
6. 在"宏控制"窗口中，单击"运行"打开显微镜宏，然后关闭"宏控制"窗口><。 注意：显微镜宏观的替代版本可能与使用此方案的基于激光的水凝胶降解不兼容。
7. 在显微镜微距的"保存"选项卡中，提供任意的"基本文件名"，选择"单个文件输出"，然后选择"临时文件"文件夹。将"打开临时文件夹"设置为位置"1"，选择"单个临时图像文件夹"，然后在"存储/应用配方"中为配方命名，并选中"调用位置列表"。单击"Store（存储）"以初始创建配方。
8. 在显微镜宏观的"采集"选项卡中，确保"扫描配置"与步骤 2.3 中设置的显微镜软件配置的名称相匹配。将 "Number of Time Points within Block" 设置为 "1"，将 "Interval" 设置为 "0"。确保"Marked Z - Top of the Z Stack"（标记的 Z - Z 堆栈顶部）以绿色突出显示。所有其他默认设置都很好。
9. 在显微镜宏的"Timing"选项卡中，确保"Wait Delay"以绿色突出显示，将"Experiment Repetitions"和"Group Repetitions"设置为"1"，将"Wait Interval Before Block at First Location Only"设置为"0"。所有其他默认设置都正常。
   注意："组重复"（而不是"实验重复"）框是可以设置激光扫描一个区域（即配方的重复次数）的地方。
10. 在显微镜宏观的"Z 列表"选项卡中，指定了 z 方向的降解平面。将 z 间距 "dZ" 设置为 "1 μm"，并将 "Number of Positions" 设置为与要使用的虚拟蒙版数量相匹配。
11. 单击"Create Z Stack"按钮，使"Z List"出现在窗口底部的"List of Locations"下拉列表中。检查位置数和 z 间距是否正确，以及 X 和 Y 位置是否归零。
    注意：如果不是，请不要存储配方;关闭显微镜微距并重复步骤 2.3.6，然后重新打开显微镜微距并再次设置配方。
    注意：例如，与其使用 100 个掩码，每个掩码间隔 1 μm，不如使用 50 个掩码，每个掩码使用两次，间隔 1 μm，以获得等效的微流体结构，因为将单个掩码加载到显微镜宏观上可能很耗时。
12. 在显微镜宏观的"漂白剂"选项卡中，必须加载所有掩模，并与"位置列表"中的特定编号位置匹配。首先，选择 "漂白剂" 框并确保 "配置" 与显微镜软件主屏幕中 "漂白剂" 窗口中的漂白剂设置名称匹配（请参阅步骤 2.3.8）。将"漂白后等待延迟"设置为"0"，取消选择"spot"，并将"ROI"留空。
13. 请勿更改 "Location"（位置）、"Tile（平铺）"、"Grid"（网格）、"Autofocus"（自动对焦）、"Blocks"（块）和 "Options"（选项）选项卡中的任何内容。
14. 要将掩模加载到显微镜宏观上，只需在显微镜软件中选择"区域"窗口，然后打开显微镜宏观的"漂白"选项卡。在"区域"窗口中，单击"加载"并选择 .正在降级的 z 堆栈底部的掩码的 OVL 文件。
    注："Z 列表"中的第一个位置是 z 堆栈的底部，显微镜宏观装置会一直工作到 z 堆栈或水凝胶的顶部。
15. 一旦 ROI 列表出现在"区域"窗口中，单击箭头按钮以查看视野内蒙版的 ROI（在步骤 3.2 中拍摄的图像上）。验证 ROI 是否适合视域。
16. 要将加载的掩模保存在显微镜宏观中，请在"漂白"选项卡上的"将当前区域添加到 ROI 列表"框中为掩模命名和编号，然后单击"将当前区域添加到 ROI 列表"按钮。名称和编号将与任何其他掩码（包括来自其他先前创建的配方的掩码）一起出现在 "ROI" 下拉列表中。在显微镜软件的"区域"窗口中删除掩码。
17. 重复步骤 3.14 和 3.16 将所有蒙版上传并保存到显微镜宏。
18. 要将上传的蒙版分配给每个 Z 位置，请突出显示下拉列表"List of Locations"中的位置 1。从 "ROI" 下拉列表中选择适当的 ROI。确保在显微镜宏的 "Bleach" 选项卡顶部选择 "Bleach" 框。
19. 对下拉列表 "List of Locations" 中的所有位置重复步骤 3.18，然后单击 "Saving" 选项卡上的 "Store" 以将配方保存为最终形式。

4. 光聚合 PEGDA 水凝胶

1. 用三乙醇胺 （TEOA） 制备无菌 HEPES 缓冲盐水 （HBS）
   1. 在 1 L 烧杯中，加入 500 mL DI H₂O。使用搅拌棒，在通风橱中加入 2.922 g 氯化钠、1.196 g HEPES 和 7.5 mL TEOA。
   2. 用巴斯德移液管滴加，用 1 N 氢氧化钠溶液调节至 pH 8.3。
   3. 通过 0.2 μm 真空过滤杯将溶液无菌过滤到 500 mL 高压灭菌玻璃培养基瓶中。分装并储存在 4 °C。
2. 将一圈带背衬的双面胶粘剂连接到专用的 60 mm 培养皿上，并在底部切出一个 20 mm 的孔。将背衬留在粘合环上，压出培养皿和粘合剂之间的任何气泡。
3. 准备材料。将合成的³³ 3.4 kDa PEGDA 从 -80 °C 冰箱中取出，使其达到室温。在光聚合水凝胶之前至少 15 分钟打开白光源。
4. 在通风橱中，将 1 mL 含 TEOA 的 HBS 添加到铝箔覆盖的 2 mL 琥珀色离心管中（用于防止光引发剂伊红 Y）曝光。在 DI H₂O 中加入 10 μL 1 mM 伊红 Y 二钠盐。
5. 在通风橱中，用巴斯德移液管将少量 1-乙烯基-2-吡咯烷酮 （NVP） 提取到玻璃烧杯中。从该体积中，将 3.5 μL NVP 移液到装有 HBS、TEOA 和伊红 Y 的琥珀色离心管中。
6. 在第二个铝箔覆盖的 2 mL 琥珀色离心管（用于防止预聚物溶液的错误光活化）中，加入 10 mg 3.4kDa PEGDA。加入 0.2 mL 的 HBS、TEOA、伊红 Y、NVP 溶液，得到 5% w/v PEGDA 预聚物溶液。涡旋直至 PEGDA 完全溶解。使用功率计和探测器棒，将白光源的强度调整为 95 mW。
7. 构建聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 模具
   为了
   1. 便于处理，在较大的表面（玻璃、聚苯乙烯组织培养皿）上构建 PDMS 模具⁷，并组装模具，使模制水凝胶适合直径为 20 mm 的圆圈。
   2. 为了生成厚度为 500 μm 的矩形水凝胶，将两个 500 μm 厚的 PDMS 垫片放在 PDMS 表面上，以创建两个定义的水凝胶边缘。
   3. 包括一个 300 μm PDMS 垫片，以在水凝胶表面施加 300 μm 深的孔，这有助于引入液体。
8. 将 60 μL 的 5% w/v PEGDA 预聚物溶液移液到 PDMS 模具上。小心不要在移液过程中引入任何气泡。
9. 将 [3-（甲基丙烯酰氧基）丙基] 三甲氧基硅烷 （TMPSA） 官能化的⁷、直径为 40 毫米、#1.5 玻璃盖玻片居中并放置在溶液顶部。确保盖玻片放在 500 μm PDMS 垫片上。水凝胶将与甲基丙烯酸酯盖玻片结合，并防止水凝胶漂浮在溶液中。
10. 将 PDMS、PEGDA 预聚物溶液并在白色光源下盖玻片组件 3 分钟。
11. 在模具和盖玻片之间流动 DI H₂O 以将水凝胶与 PDMS 分离。用 DI H₂O 冲洗水凝胶。用实验室纸巾擦干盖玻片的边缘。小心不要触摸或吸走水凝胶中的水。
12. 从粘合剂上去除背衬后，将盖玻片粘附在准备好的培养皿上，并轻轻去除粘合剂和玻璃之间的气泡。将水凝胶浸入培养皿中，用 DI H₂O.
    注意：如果用 DI H₂O 冲洗，用氮气干燥并保持无尘，PDMS 模具可以重复使用以制造额外的水凝胶。

5. 通过基于激光的降解制造血管衍生的微流体网络

1. 在激光扫描共聚焦显微镜和显微镜软件开启的情况下，在"维护"选项卡中选择物镜"W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC VIS-IR M27 75mm"。在 "Acquisition" 选项卡中，确保必要的激光线（514 nm 氩激光和 790 nm 140 fs 脉冲 Ti：S 激光）已打开并预热。
2. 设置水凝胶以形成入口通道
   1. 将水凝胶和培养皿安装在载物台插件上，然后将载物台插件放在显微镜载物台上。用至少 5 mL 的 DI H₂O 填充培养皿。在将水浸物镜降低到 DI H₂O.
      之前，用眼睛将水凝胶和孔特征居中 注意：不要用物镜压碎水凝胶——两者绝对不能接触！
   2. 要找到水凝胶，请从步骤 2.2 切换到"水凝胶可视化"配置。单击"实时"打开激光线并使物镜更靠近水凝胶，直到可以看到水凝胶顶部的伊红 Y 信号（由 Ch1 荧光检测器检测到><）。 注意：为了轻松找到水凝胶，可以增加百分比功率或打开针孔。然而，一旦物镜聚焦在水凝胶上，就降低百分比功率以保护荧光检测器，并将针孔减少到 1AU，以避免检测器过度饱和并准确找到水凝胶表面。
   3. 在"阶段"窗口中，标记水凝胶的顶部和底部以及孔底部的位置。
      注意：此处的 z 值将有助于确定水凝胶的厚度和孔的深度。
   4. 使用纵杆在 X 和 Y 方向上移动以找到井的边缘。将水凝胶放在屏幕的右侧，孔放在左侧，反之亦然。 让水凝胶填充不超过三分之二的视野。
   5. 通过在"聚焦"窗口中将"步长"设置为"150"，然后单击"Z 位置"框旁边的向下箭头，将聚焦平面向下放入水凝胶中 150 μm。如有必要，重复步骤 5.2.4。
      注意：入口的 x、y 和 z 位置完全取决于虚拟掩码的设计。
   6. 严重：将"舞台"窗口中的 X 和 Y 位置归零，删除所有其他标记的位置，并仅标记此位置。
      注意：如果不执行此步骤，显微镜微距将无法正确恢复先前保存的配方中的位置，并且水凝胶不会在所需位置降解。
3. 形成入口通道
   1. 使用"区域"窗口中的矩形按钮"捕捉"图像并绘制一个矩形区域，该区域将成为血管网络的入口。
      注意：确保部分区域延伸到孔中，以确保入口将孔连接到血管网络。
   2. 在"区域"窗口中生成的 ROI 旁边，选择"Acquisition"并取消选择"Bleach"和"Analysis"。
   3. 保存 "Hydrogel Visualization" 配置，取消选择 "Regions"，然后更改为 "Channel Formation" 配置，在步骤 2.3 中设置。在 "Channel Formation" 配置中，再次选择 "Regions"。
      注：在 "Hydrogel Visualization" 和 "Channel Formation" 配置之间切换时，请务必取消选择屏幕左上角的区域。有时，如果不这样做，区域扩展可能会在配置之间意外更改。
   4. 在 "Channel Formation" 配置中，确保仅选择 "Regions" 和 "Z-Stack" 。在"Z-Stack"窗口中，单击顶部的"Center"按钮，然后单击"Offset"上方的"Center"按钮，将 z 堆栈的中心设置为当前 Z 位置。根据入口需要多大，将 "Slices" 的数量设置为 "Interval" 为 "1"。Z 堆栈的大小将显示在 "Range" 下方。
   5. 检查 "Acquisition Mode" 窗口中的 "Speed" 是否设置为 "3"，以及 "Channels" 窗口中的 "Percent Power" 是否设置为 "100"。保存配置并单击 "Start Experiment" 按钮。
      注：在多个平面上降解相同的简单形状不需要显微镜宏观，如此处执行以生成入口通道。仅当降级每个单独平面上的不同区域时，才需要该宏，并且它用于将虚拟蒙版存储在配方中。
   6. 为了在降解过程中可视化水凝胶，如果视野中的区域为黑色，则增加"通道"窗口中的"增益（主）"，如果该区域为白色，则减小"增益（主）"。
      注：此处气泡的形成表明激光诱导的水凝胶降解。
   7. 要多次降低进样口性能，而不是仅降低一次，请调整"Time Series"窗口中的"Cycles"（周期）。
   8. 在 "Hydrogel Visualization" 配置中，单击 "live" 以确保形成入口。
4. 设置水凝胶以生成微流体网络
   1. 在 "Regions" 窗口中，加载任何 .OVL 文件，然后单击箭头按钮以查看视野中的 ROI。
   2. 单击"实时"实时扫描"水凝胶可视化"配置，并使用纵杆或"阶段"窗口将水凝胶定位在 X 和 Y 方向，以便入口连接到血管网络内的正确位置><。 注意： 确保虚拟掩模的 ROI 与之前形成的入口略有重叠。
   3. 使用"聚焦"窗口中的"步长"并单击"Z 位置"框旁边的向下箭头，将聚焦平面从先前的中心 Z 位置下降 50 μm，或从水凝胶表面下降 200 μm。这将是显微镜 macro 中的第一个位置。
      注意： 沿 z 方向移动的实际距离取决于网络设计。确保所需的网络在 z 方向上不会超出水凝胶的顶面或底面。
   4. 关键：将"舞台"窗口中的 X 和 Y 位置归零，删除所有其他标记的位置，只标记此位置。
      注意：这将是显微镜宏观的起点。配方将回到水凝胶的表面。
   5. 在 "Hydrogel Visualization" 配置中 "捕捉" 图像，删除并取消选择 "Regions"，然后保存配置。
5. 生成微流体网络
   1. 更改为 "Channel Formation" 配置，只选择 "Time Series" 和 "Bleaching" 窗口。验证"Time Series（时间序列）"和"Bleaching"（漂白）窗口的设置是否与步骤 2.3.7 和 2.3.8 中最初设置的设置相同。
   2. 将"采集模式"窗口中的"速度"设置为"8"，将"通道"窗口中激光线的功率百分比设置为"0.2"。保存配置。
   3. 按照步骤 3.5 打开显微镜宏。在宏的"保存"选项卡上，从步骤 3 中选择之前制作的配方，然后单击"应用"。
      注意：请勿点击"商店"，否则配方将被覆盖！
   4. 检查所有选项卡上的设置，并验证虚拟掩码 （.OVL 文件）仍与下拉列表中的 Z 位置正确关联。还要检查第一个 Z 位置是否与显微镜软件的"载物台"窗口中的标记位置相匹配。
      注意：与直觉相反，下拉列表中的第二个位置将在物理上位于第一个位置的上方，因为显微镜微距将从水凝胶底部（离物镜最远）到水凝胶顶部（离物镜最近）。
   5. 再次保存 "Channel Formation" 配置，然后单击显微镜宏中的 "Update"。单击"否"到"覆盖当前位置列表"，然后单击显微镜宏中的"开始"以开始配方。

6. 可视化微流体网络

1. 要查看降解后的水凝胶和形成的微流体网络，请关闭显微镜微距。切换到 "Hydrogel Visualization" 配置以查看水凝胶的 eosin Y 信号;降级的网络将显示为暗
   注：显微镜宏观运行时无法看到水凝胶降解。
2. 要具体查看微流体网络，请在较低的激光功率下使用"水凝胶可视化"配置，以实现引入的荧光素 （FITC） 标记的葡聚糖的成像，其信号比水凝胶的天然曙红 Y 信号更亮。
3. 在引入荧光标记的葡聚糖之前，使用实验室纸巾从水凝胶中的孔中吸水。在 DI H₂O 中移液 10 μL 5 mg/mL 2,000 kDa FITC 标记的葡聚糖（通过 0.2 μm 注射器过滤器预过滤><）。 注：使用任何尺寸为 2,000 kDa 或更大的葡聚糖，以防止扩散到凝胶中。如果成像时间超过 30 分钟，请使用湿度为 60%（或更高）的孵育台，以防止水凝胶干燥和水分从 FITC 标记的葡聚糖溶液中蒸发。
4. 从载物台上取下水凝胶和培养皿并标记培养皿，以便在以后的实验中轻松定位形成的血管网络。

结果

为了演示实现图像引导的、基于激光的水凝胶降解以生成 3D、血管衍生的微流体网络，我们利用了通过刀刃扫描显微镜 （KESM） 获取的小鼠脑脉管系统的 3D 图像堆栈^26,27.如上所述，将较大微血管数据集的选定 3D 区域转换为一系列虚拟掩码，用于图像引导微流体网络的形成。制造后，用 FITC 标记的 2,000 kDa 葡聚糖溶液灌注所得的微流体网络，并通过共聚焦显微镜成像。定义网络架构的体内脉管系统（图 1A 和 C）和制造的微流体网络（图 1B 和 D）的图像堆栈用于生成 Z 投影（图 1A 和 B）和 3D 渲染（图 1C 和 D）。图像的比较表明，图像引导的、基于激光的水凝胶降解能够制造 3D 仿生微流体网络，该网络概括了体内脉管系统的大小、曲折和复杂结构。该技术适用于制造包含各种直径的网络;在图 1 中，生成了直径为 3.3 至 28.8 μm 的通道。请注意，图 1B 左上角和图 1D 左上角的较大矩形结构是将流体引入管网的入口通道。

图 1：血管衍生的微流体网络。 一系列来自小鼠脑脉管系统（A 和 C）图像堆栈的虚拟掩码用于通过图像引导、基于激光的降解制造嵌入 PEGDA 水凝胶（B 和 D）中的 3D 仿生微流体网络。用 2,000 kDa FITC 标记的葡聚糖灌注微流控网络，并通过共聚焦显微镜成像。两个网络的 Z 投影（A 和 B）和 3D 渲染（C 和 D）展示了生成微流体网络的能力，这些网络概括了体内脉管系统的密度、组织和整体结构。箭头 （D） 标记为引入葡聚糖而创建的矩形入口。比例尺代表 50 μm。请单击此处查看此图的较大版本。

我们已经实施了两种方法，压力头和注射泵，以在这些嵌入式微流体网络中启动流体流动。例如，制造了一个 30 x 30 μm 的矩形通道，以连接微成型 PEGDA 水凝胶中的两个孔（图 2A），流体流动通过压力头⁷ 驱动。在左侧井中产生，压力头诱导水流通过微通道进入右侧的井。在图 2A 中，使用延时显微镜观察到四甲基罗丹明 （TRITC） 标记的 70 kDa 葡聚糖的初始前沿通过通道。后来，在图 2B 中，一个直径为 10 μm 的荧光聚苯乙烯球体从左侧孔流过通道，流向右侧的孔。由于流动持续时间由入口处微成型井中存在的流体体积控制，流速由入口和出口井之间产生的静水梯度控制，微成型水凝胶中的压力扬程驱动流动提供了一种简单的引流方法，无需外壳或注射泵。

图 2：微成型 PEGDA 水凝胶中的压力头驱动流。 PEGDA 被微成型以形成水凝胶，其中包含两个由嵌入式微通道连接的孔。在左孔中产生一个压力头，以启动TRITC标记的70 kDa葡聚糖（A1-A3）和10 μm聚苯乙烯球（B1-B3）通过30 x 30 μm矩形通道从一个孔流向另一个孔。比例尺代表 50 μm。请单击此处查看此图的较大版本。

或者，为了在微流体网络中产生恒定的流体流动，可以通过在具有注射泵接口的入口和出口的二级微流体装置内部对水凝胶进行光聚合来启动注射泵驱动的流动。在图 3A 中，显示了一种市售的预制微流体装置，其 1 mm 水凝胶光聚合带贯穿装置的宽度⁷。实施基于激光的降解以使用此处描述的与独立式水凝胶相同的协议在封装水凝胶中制造微流体通道和网络。在图 3B 中可以看到注射泵产生的流动，其中在微流体装置中的水凝胶中制造了一个直径为 20 μm 的圆柱形通道。在这个直径为 20 μm 的通道中，单个 2 μm 荧光聚苯乙烯球体无需流体流动即可轻松分辨（图 3B1），而当施加 5 μL/s 的流速时，球体会穿过视场，如条纹所示（图 3B2）。使用相同的方法诱导流过 2D、血管衍生网络，以监测 TRITC 标记的 65 kDa 葡聚糖通过网络并扩散到周围水凝胶中的流动（图 3C）。

图 3：在微流体外壳中聚合的 PEGDA 水凝胶中的注射泵驱动流动。 具有 17 x 3.8 x 0.53 毫米 （x，y，z） 微通道的市售预制微流控装置 （A） 包含一个光聚合的 1 x 3.8 x 0.53 毫米 （x，y，z） PEGDA 水凝胶，如黑色箭头所示。直径为 20 μm 的圆柱形通道通过水凝胶降解，2 μm 聚苯乙烯球体通过装置泵送 （B）。在没有流体流动的情况下，球体可以清晰地分辨 （B1），但在 5 μL/s （B2） 的流速下，它们会表现为条纹。在另一种封装的水凝胶中，构建了 2D 血管衍生网络并进行了 TRITC 标记，通过网络泵送了 65 kDa 葡聚糖 （C）。延时显微镜用于监测荧光葡聚糖，因为它填充通道并扩散到周围的水凝胶中。（B） 和 （C） 中的白色箭头表示流体流动的方向。（C） 中的校准条表示荧光葡聚糖的强度。比例尺代表 （B1） 和 （B2） 中的 20 μm 和 （C） 中的 50 μm。请点击这里查看此图的较大版本。

讨论

显微镜宏观必须仔细设置和作，这对于覆盖显微镜软件的标准功能以实现虚拟掩模进行图像引导、基于激光的降解至关重要。显微镜软件与显微镜宏观的接口方式有时有悖常理，为了开发这种方法，我们投入了大量精力来确定两个程序中的最佳设置。建议对基本的激光扫描共聚焦显微镜使用有一个大致的了解，特别是在尝试基于激光的降解之前，使用“载物台”和“焦点”窗口来查找和正确定位 x、y 和 z 维度的水凝胶。此外，入口通道的制造对协议至关重要;悬浮荧光物质必须能够进入微流体系统，才能成功成像和网络表征。重要的是要注意，该协议适用于配置有特定飞秒脉冲激光的特定激光扫描共聚焦显微镜，运行特定版本的显微镜软件和显微镜宏观（参见特定材料/设备列表中的详细信息）。我们发现较新版本的显微镜宏缺乏图像引导激光控制所需的必要控制和功能。虽然可以使用其他显微镜平台和脉冲激光源，但该协议专门适用于该系统，并且需要根据平台、激光源和实施的软件进行修改。但是，整个协议的基本原则仍然适用。

对该协议的潜在修改涉及改变水凝胶组成。在这里，我们使用了 5 wt%、3.4 kDa 的 PEGDA 水凝胶，但已经实施了基于激光的降解（用于微流体网络生成以外的目的）来降解合成和天然水凝胶，包括聚乙二醇化纤维蛋白原^21,22、蚕丝蛋白水凝胶²³ 和胶原蛋白²⁴。调整激光功率、扫描速度、Z 切片之间的间距和重复次数将有助于确定在其他水凝胶配方中制造微流体网络的最佳参数。

该技术目前的一个限制是可以在可行的时间内降解的水凝胶总体积。为了在水凝胶内产生开放的空隙或微流体特征，当使用37.7 nJ/μm²的激光通量时，激光停留时间必须等于或高于8.96 μs/像素（或激光扫描速度为0.021 μm/μs）。使用这些设置，降解 0.014 mm³ 体积内的血管需要 1.4 小时（如 图 1 所示）。使用4.48μs/像素或以下的激光停留时间，传递的能量不足以完全降解此处使用的水凝胶配方。实施不同的水凝胶组合物可以克服这一限制。使用含有光敏组分^34-36 的光不稳定凝胶或具有大多光子横截面^21-24 的水凝胶是不错的选择，它们将能够使用更少的能量并导致更快的降解。关于尺寸限制，在水凝胶⁷中已经制造了深达1.5毫米的特征。可达到的深度是物镜工作距离的函数，可以使用针对 体内 成像优化的超长工作距离物镜来增加。使用20X（NA1.0）水浸物镜创建的最小测量通道⁷ 的宽度为3.3 μm，深度为8.9 μm，与 图1中生成的最小通道的大小相当。虽然其他实验室使用了较低的NA物镜^21,23,24，但我们预计可以使用更高的NA物镜生成具有较小特征的微流体网络，但代价是缩短了工作距离。然而，最终，该技术的分辨率取决于聚焦激光束的点扩散函数、激光扫描特性、激光传递的能量以及被降解材料的激光吸收特性。

此外，必须根据水凝胶特性（交联密度、大聚体/单体分子量、重量百分比和水凝胶类型：蛋白质基与合成）优化激光特性（速度、通量、虚拟掩模之间的间距和重复次数），因为这些特性将固有地改变与激光的相互作用，从而改变过程的最终分辨率。由于输送的能量也受到所用物镜的影响，因此在物镜之间切换时需要进行额外的优化。就所涉及的成本而言，需要使用带有脉冲激光的显微镜，虽然可以使用许多不同的物镜，但那些具有高数值孔径和长工作距离（用于 体内 成像）的物镜可能会很昂贵。

除了此处详述的方案之外，使用该技术生成的微流体网络也可以在通道制造后用细胞粘附肽进行功能化，以诱导内皮细胞粘附和管腔^形成7。此外，在通道降解之前在块状材料⁹中掺入细胞可降解肽序列可以允许研究细胞迁移到水凝胶中并通过水凝胶。为了实现水凝胶内微流控网络的连续流化，水凝胶可以在较大的流体装置或外壳中进行光聚合，如图2和图3所示 ⁷。

通过血管生成或血管生成自组装^8-12生成血管网络提供了一种在相对较大的水凝胶体积中诱导血管化的直接方法。虽然这种方法产生了可灌注的流体网络，但很难直接控制尺寸、曲折度、密度和整体网络结构。由于这种限制，脉管系统中的流动剖面和剪切速率可能在实验之间有所不同。或者，微加工技术^13-16允许直接控制网络结构，但通常受到其无法产生小的毛细管大小通道或制造模拟体内血管结构的密集网络的限制。虽然这里概述的基于激光的水凝胶降解技术已被重新用于微流控生成，但它同时克服了现有微加工方法的结构控制和基于尺寸的限制，通过创建 3D 仿生微流控网络来概括体内的密度、迂曲、尺寸范围和整体结构血管。此外，可以在单个水凝胶中生成多个流体网络，从而可以研究网络间传输⁷。对于努力在体外更紧密地复制体内转运过程的组织工程应用，这里概述的高分辨率水凝胶嵌入微流控网络非常适合。我们预计该协议将有助于开发更准确地模拟体内转运的组织结构，用作药物筛选设备和体外疾病模型。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MATLAB	Mathworks	R2015a	在协议中被命名为"编程软件";有关算法的详细信息，请参阅来源 9 FIJI
（斐济只是图像 J）	NIH	1.51a 版	在协议中被命名为"图像处理软件"
LSM 780 共聚焦显微镜	蔡司		在协议中被命名为"激光扫描共聚焦显微镜";用于基于激光的水凝胶降级
Zen 2010B SP1	蔡司	发布版本 6.0	在方案中命名为"显微镜软件";用于蔡司 LSM-780
Multitime，2010	年蔡司	v16.0	在方案中命名为"显微镜微距";用于蔡司 LSM-780（与 Zen 配合使用）
物镜 W 平场复消色差物镜 20X/1.0 DIC D=0.17 M27 75 mm	蔡司	421452-9880-000	用于蔡司 LSM-780
Chameleon Vision II 锁模 Ti：S 激光器	相干公司		在协议中被命名为"高功率脉冲激光器"
氯化钠	Sigma-Aldrich	S5886-1KG
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-250G
三乙醇胺 （TEOA）	Sigma-Aldrich	90279-100ML	易燃;对皮肤和眼睛有刺激性;在通风橱中使用
氢氧化物	Sigma-Aldrich	S5881-500G
150 mL 真空过滤杯，带 0.2 和微量;m PES 膜	VWR	10040-460
PEGDA	内部		，参考来源 33 了解合成方法;储存在氩
氩 曙红 Y 二钠盐	Sigma-Aldrich	E6003-25G
1-乙烯基-2-吡咯烷酮 （NVP）	Sigma-Aldrich	V3409-5G	储存在氩下;致癌;在通风橱中使用
3M 双面胶带，9500PC，6.0 mil	Thomas Goldkamp	37728
Flexmark 90 PFW 离型	FLEXcon	FLX000620	背衬，用于处理双面胶带
SC 型绘图仪（胶粘剂切割机）	USCutter	SC631E	用于切割环形胶粘剂，以将盖玻片连接到培养皿
带 20 mm 孔的培养皿 60 mm 培养皿	MatTek Corporation	P60-20-F-NON
高强度照明器（白光源）	Fiber-Lite	4715MS-12WB10
功率计	Newport	1916-R	使用白光源时可在 524 nm 处检测功率
超薄型棒状检测器	Newport	918D-ST	与功率计一起使用
Sylgard 184 硅胶弹性体套件	道康宁	3097358-1004	用于制造 PDMS 模具;方法参见来源 7
TMPSA 官能化 #1.5 盖玻糖，40 mm 内部	合成		方法参见来源 7
葡聚糖、荧光素、2,000,000 MW、阴离子、赖氨酸可固定	Life Technologies	D7137	可以使用替代标记的葡聚糖;2,000 kDa 不易扩散到 5% 3.4 kDa PEGDA 水凝胶
1 mL 注射器中，Luer-Lok	BD	309628
Acrodisc Syring 过滤器，0.2 µm Supor膜，低蛋白结合颇	尔	PN 4602
粘性载玻片VI0.4	Ibidi	80601	容纳水凝胶的微流体装置