评估小型有鳞爬行动物的空间学习与记忆能力

摘要

本文介绍了一种针对小型有鳞爬行动物改良的巴恩斯迷宫方法，该迷宫是一种用于评估啮齿类动物空间记忆与学习能力的标准实验范式。

摘要

临床研究已采用多种范式来评估认知衰退，通常关注空间学习和记忆能力。然而，针对非模式物种认知过程的研究兴趣也逐渐兴起，尤其是在生态学背景下。特别是对爬行动物认知过程的研究正在增长，尽管关于爬行类认知的实验研究仍较为稀少。少数已开展的爬行类空间学习与记忆实验研究通常采用经改造的啮齿类实验范式。然而，在测试该分类群基于空间的认知能力时，必须考虑其生理和行为上具有生态重要性的特征。本文描述了对陆基 Barnes 迷宫及其相关测试方案的改进，这些改进可提高在小型有鳞目爬行动物中探测空间学习和记忆能力时的实验表现。所述范式与操作程序已成功应用于雄性侧斑蜥蜴（Uta stansburiana），表明可通过生态相关性强的装置和方案对该分类群的空间学习与记忆能力进行评估。

引言

许多神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）均表现为认知能力进行性下降，通常伴随大脑的退化^1-4。为了检验脑损伤和脑退化对认知过程的影响，临床研究利用了模式啮齿类动物的优势，以及测试设备和方案的标准化。特别是，空间学习和记忆过程已通过多种标准范式进行评估，例如莫里斯水迷宫、巴恩斯迷宫和放射臂迷宫（有关这些及其他范式的全面综述，参见^5,6）。这些空间学习与记忆范式具有悠久的研究历史，已被证明非常成功，使研究人员能够深入了解人类记忆、脑功能与疾病之间关系的诸多方面和细微差异。

尽管认知过程的评估在临床研究中已受到长期关注，但针对非模式物种认知能力的研究相对较新。研究非模式物种认知的科研人员通常关注认知过程在生态学和进化上的意义，尤其是在生存与繁殖背景下的作用。一些爬行动物的研究表明，较高级的认知能力，特别是空间记忆，可能是一些行为的基础，尤其是与导航和定向相关的行为。然而，尽管许多研究已证明爬行动物在被移位后能够重新定向^7,8，但支撑这种重新定向行为的认知机制尚未被明确区分。因此，一些研究尝试通过实验手段评估空间学习与记忆在导航过程中的重要性^9-17。这些研究的方法主要借鉴啮齿类动物的实验范式和方案，有时会针对爬行动物进行修改，但这些方法在评估空间记忆方面的效果参差不齐。部分研究在某些物种中证实了空间学习与记忆的存在^11-17，而其他研究则未发现此类证据^9,10。因此，空间学习与记忆在爬行动物导航过程中是否发挥作用或是否存在，目前仍不明确。

在实验性评估爬行动物空间学习和记忆能力时，一个可能存在的问题是任务的生态相关性。爬行动物是一个在生态、行为和生理方面与啮齿类动物显著不同的特殊分类群。不同爬行动物物种之间的行为差异可能会影响其空间认知能力的评估，特别是当所采用的实验范式未能反映其自然行为时。例如，对于一种通常在狭小缝隙中寻找庇护的物种，使用巴恩斯迷宫（Barnes maze）可能更容易评估其空间能力；而对于一种通常保持静止不动的物种，该迷宫则可能不是理想的实验范式。同样，大多数有鳞目爬行动物并非水生，因此莫里斯水迷宫（Morris water maze）可能并不适合用于测试其空间学习和记忆能力（但参见¹⁵）；然而，该迷宫可能是测试龟类空间能力的理想选择¹⁶。最后，必须考虑该类群的生理特性，因为爬行动物为变温动物，在实验过程中必须特别注意温度的维持，尤其是基质温度的控制。

本文所述的实验方案和范式用于研究成年侧斑鬣蜥（Uta stansburiana）¹³的空间学习与记忆能力，这是一种小型蜥蜴， 通常会逃入岩石中的狭小缝隙以躲避捕食者¹⁸。基于对该物种自然史和行为特征的了解，我们对传统的巴恩斯迷宫进行了改良，以检测其空间学习与记忆能力。巴恩斯迷宫是一种陆地迷宫，通常用于啮齿类动物模型的空间认知测试。我们在设计和实验流程方面对啮齿类用迷宫进行了多处修改（如下所述）。我们的迷宫由一个圆形平台构成，平台边缘均匀分布着10个等距的孔（图1）。本文所述的实验流程包括让受试个体参与训练试验，以学习目标孔的位置；当受试个体掌握目标孔位置后，再通过探测试验来评估其在导航至目标孔过程中对空间记忆的运用情况。

方案

所有实验程序均经宾夕法尼亚州立大学 机构动物照护与使用委员会（IACUC - 协议编号：43242）批准，并严格遵守所有地方、州和联邦法规。

1. 准备

1. 购买或制作巴恩斯迷宫，确保目标孔的尺寸适合目标物种。本方案中使用七只成年侧斑蜥蜴（Uta stansburiana）。为使用其他物种的研究确定适当的样本量。
   1. 若自行搭建巴恩斯迷宫，请购买任意标准的非多孔圆形桌面（直径106 cm），并将其架高至离地76.2 cm。
   2. 使用卷尺在桌子边缘周围标记10个等距点，各点间距为26 cm，距离桌边6.35 cm。设置10个孔洞，而啮齿类动物迷宫通常具有更多孔洞。这样做可减少逃生选项的数量。
   3. 使用直径为2.54 cm的孔锯钻头钻出全部10个目标孔，并打磨锋利的边缘。
   4. 使用家用外壳作为尺寸参考，将四个搁板支撑销用螺丝固定在每个孔的下方。
2. 将迷宫置于一个安静的房间内，顶部照明充足，并提供可用于导航的空间线索（如门、柜子） 等等。).
3. 在迷宫正上方安装一个自动对焦广角镜头网络摄像头（11.3 cm × 3.99 cm）或其他合适的相机，确保视频画面的视野覆盖整个迷宫。
4. 将计算机和观察者座椅放置在距离迷宫至少1米的位置。
5. 用永久性记号笔或胶带在地面标记迷宫的各个臂。这有助于校正试验过程中迷宫可能发生的微小移动。
6. 随机指定其中一个孔作为 "1" 并依次连续编号其余孔洞 "10"用永久性记号笔在迷宫外侧边缘标记数字，以便参考。确保迷宫内的动物无法看到这些数字。
7. 使用随机数生成器为受试者随机分配目标孔。

2. 训练试验

注意：爬行动物具有其偏好的体温，该数值可从文献中获取。如果动物在多次训练试验中表现出反应迟钝，说明迷宫环境可能过冷，从而影响其行为表现。可在迷宫底部使用小型空间加热器或加热带，适当提高迷宫表面温度——这是反映体温的最佳热指标，以维持动物的最适体温和正常行为表现。

1. 如果受试动物饲养在测试室外，应在测试前至少30分钟将其连同饲养笼具一同移入测试房间。务必在饲养笼具中提供热源（例如，加热灯，加热带）以在测试前维持体温。
   1. 打开跟踪软件和网络摄像头应用程序以获取视频流。该自定义跟踪软件使用 Matlab 及其图像处理工具箱编写；其他跟踪软件可从商业途径获得。
   2. 从视频画面中评估视野范围。如果迷宫不在视野范围内，请检查迷宫是否位于地面标记之内。
   3. 打开工作表，其中包含训练试验的日期、开始/结束时间、受试者编号、指定的目标孔、已完成的训练试验次数、备注以及观察者的姓名首字母。
   4. 随机化受试者的测试顺序。以系统化的方式对受试者进行测试。
2. 将第一只实验动物从其饲养笼中取出，轻轻放置于迷宫中央。用一个塑料桶罩住动物，以避免研究者产生无意识的方向偏倚。静置30秒以适应环境。
3. 将动物的居住笼固定在迷宫正下方指定的目标洞口处，通过将笼顶滑入支架固定装置完成安装。确保居住笼内的晒背石正好位于洞口正下方，以便动物从洞口下降时可将其作为落脚点。此时，居住笼的热源或化学线索是否可用于导航并不重要。
   1. 啮齿类动物迷宫 使用一个干净的饲养盒作为受试动物的逃离区域。但在训练试验期间，通过将动物的原饲养盒置于迷宫下方，以鼓励其进入洞中。
4. 轻轻地将塑料容器从迷宫顶部取下。
5. 使用网络摄像头应用程序开始记录训练试验。
   1. 让受试对象在迷宫中探索10分钟。如果出现任何异常情况，需在记录表中注明。
   2. 如果实验动物从迷宫上跌落或跑出迷宫，应轻柔地将其放回迷宫中央。若动物离开迷宫的时间在30秒或以内，继续计时并记录数据。若动物离开迷宫的时间超过30秒，则中止该次试验。将上述情况记录在工作表的备注部分。
   3. 如果受试者在没有辅助的情况下进入目标洞，则视为该次试验结束。
   4. 如果受试对象在10分钟后仍未进入目标孔，则视为该次试验结束。
6. 如果受试动物在10分钟内未进入目标孔，可手动轻轻引导动物头部朝前进入相应的目标孔。
7. 停止视频和追踪软件。保存视频资料。
8. 让受试动物在其饲养笼内休息至少2分钟，期间饲养笼仍固定在迷宫下方。
9. 使用喷雾瓶和纸巾，用稀释的肥皂水（肥皂与水的比例为1:10）清洁迷宫表面。这样做可避免动物在穿越迷宫时利用化学线索。某些物种，尤其是高度依赖化学感官信息的物种，需要进一步用热水冲洗迷宫，以彻底清除所有气味线索。
10. 从迷宫下方移除围栏，可对同一受试个体或新个体重复训练试验。每个受试个体每天最多可进行5次训练试验，每次间隔30分钟 个体试验之间的间隔时间。
11. 重复此操作，直至实验对象在3次不同的训练试验中无需辅助即可进入目标孔洞，表明其已学会目标位置。这3次训练试验无需连续进行。若实验对象达到此标准，则进入探测试验，以评估其空间记忆能力。

3. 探针试验

注意：当受试者达到标准时，表明其已学会如何导航至目标。然而，此时仍不清楚受试者是使用空间策略还是其他某种导航策略来完成任务。探测试验可用于检验这一点，应在受试者在训练试验中达到标准后的第二天进行。

1. 将迷宫旋转180°，确保迷宫的支脚位于地面标记范围内。旋转迷宫可使直接指示目标位置的局部线索与更稳定的空间线索产生直接冲突。
2. 重复步骤2.1–2.5.2，但省略步骤2.3中将受试动物的饲养笼固定在迷宫下方的操作。此举可避免在迷宫探索过程中使用来自饲养笼的嗅觉或其他线索。
3. 在探测试验期间，允许受试动物在迷宫中自由探索整整10分钟，以评估其探索行为。10分钟后，停止视频录制和轨迹追踪软件。
4. 将受试动物从迷宫中移出，并放回其饲养笼中。
5. 使用稀释的肥皂液清洁迷宫顶部表面。

4. 行为学测量

注意：在训练试验中，应包括行为学指标，例如到达目标孔的潜伏期、发生的错误次数（对非目标孔的探究；动物的鼻尖必须进入距孔1 cm范围内）以及在迷宫正确象限中所花费时间的比例。

1. 在训练试验中，确定一种搜索策略。直接策略定义为进入目标孔时错误次数少于3次；序列策略指沿迷宫周边连续检查3个或以上迷宫孔；随机策略指非序列性地检查迷宫孔且错误次数达3次或以上。
   注：在探测试验中，行为学测量指标包括到达空间位置正确孔的潜伏期、在探索空间位置正确孔之前发生的错误次数，以及在迷宫空间位置正确象限所花费时间的比例。
2. 为了更严格地评估对空间位置正确目标孔的非随机选择，计算偶然概率时应采用无放回抽样方法。

结果

本方案可用于对小型蜥蜴基于空间的导航能力进行实验性评估。先前一项研究已成功应用该方案探究雄性侧斑蜥蜴的空间导航能力¹³。在该研究中，雄性个体被训练以寻找目标孔洞；当达到预定标准后，即进入探测试验阶段，以评估其在寻找目标孔洞时优先利用的线索。

本研究的代表性结果如图所示，表明尽管蜥蜴学会了目标位置，但每个个体达到标准所需的训练次数差异较大，范围为 17 至 81 次训练（平均：48.29 次）。由于不同个体达到标准所需的训练次数存在差异，因此将训练试验按四分位数划分并取平均值。在多次训练试验中，个体找到目标孔所需时间逐渐减少，尤其在第一与第四四分位数之间差异显著，表明受试个体正在学习目标孔的位置（p = 0.012，图 2）。在探测试验中，迷宫被旋转，从而导致局部线索与空间线索发生冲突。个体趋向空间位置正确的目标孔的频率显著高于随机概率（p < 0.001，图 3

讨论

在实验性测试空间学习与记忆时，本方案的主要步骤中涉及若干重要的概念性问题。首先，受试对象必须在训练试验过程中表现出对目标孔位置的学习能力。达到预设标准即表明已成功学习目标孔的位置。如果受试对象未能学会目标孔的位置，则无法有效判断其导航策略。若动物达到了标准，探测试验对于确定在迷宫中导航时优先使用的线索类型至关重要。在探测试验期间，局部线索与空间线索之间存在冲突，迫使受试对象只能优先选择其中一类线索进行导航。因此，探测试验对于评估在迷宫导航过程中被回忆并优先使用的线索类型具有重要意义。由于研究重点在于空间线索与局部线索的比较，必须消除其他可能用于导航的潜在线索；这些线索可能成为研究中的混杂因素。特别是对于有鳞类爬行动物而言，嗅觉线索在其配偶选择、躲避捕食者以及寻找食物等行为中起着重要作用¹⁹。因此，在试验之间清除嗅觉线索非常重要，以防止动物在迷宫中依赖嗅觉线索进行导航。

尽管该方案在成年雄性侧斑蜥蜴上取得了良好效果¹³，但在对幼年蜥蜴或不同物种进行空间学习与记忆测试时，可能需要对迷宫结构和实验方案进行相应调整（LaDage，未发表数据）。例...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
巴恩斯迷宫	TSE Systems	302050-BM/M	可从其他供应商处获取。或者，也可使用标准的非多孔圆形桌自制巴恩斯迷宫。
加热带	Big Apple Pet Supply		也可使用放置在迷宫下方地面的小型空间加热器。
小型动物饲养笼	Petco	1230204	可安装在迷宫下方的饲养装置。
镀镍层板支撑销	Newegg	241941	固定于迷宫底面的销钉，用于在实验过程中将饲养装置固定在迷宫上。
LifeCam Studio 网络摄像头	Microsoft	Q2F-00013	可从其他供应商处获取。也可使用其他品牌的网络摄像头。
追踪软件	为Matlab 及图像处理工具箱定制的代码		视频追踪软件。也可使用TSE Systems公司的VideoMot 2等其他追踪软件。