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利用转基因荧光小鼠和改良型背部皮肤折叠窗腔进行肿瘤相关血管的活体显微成像

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DOI：

10.3791/55115

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2018年1月19日

 , 
1Laboratory Experimental Surgical Oncology, Section Surgical Oncology, Department of Surgery, Erasmus MC

本文内容

摘要

本方案描述了表达细胞特异性荧光标记的转基因小鼠的活体成像。活体成像提供了一种非侵入性方法，可通过植入式窗口对活体动物进行高分辨率观察，从而实现对生物学过程的显微可视化。该方法特别适用于研究纵向动态过程。

摘要

肿瘤及肿瘤血管的发育过程，以及肿瘤对治疗药物的反应，均为高度动态的生物学过程。组织学提供的信息是静态的，通常不足以进行准确解读。活体动态评估能够随时间追踪生物学过程，可提供额外的、往往是意想不到的信息。随着表达细胞特异性标记物和活细胞示踪剂的转基因动物的构建、成像设备的改进，以及多种成像腔室的开发，活体显微技术已成为深入理解生物学过程的重要工具。本文介绍了一种实验设计，可用于在空间和时间维度上研究肿瘤血管的发育过程及治疗效应。利用该实验系统，可对血管发育阶段、顶端细胞形成、管腔生成、血流情况、物质外渗、成熟血管网络的建立以及血管破坏等过程进行可视化观察和动态追踪。此外，还可实时监测治疗干预的效果、药物在肿瘤内部的命运及其定位分布情况。

引言

尽管 体外 研究能够实现对过程的高分辨率动力学成像， 体外 实验研究无法在适当的生理背景下进行评估。例如，肿瘤细胞与间质成分的相互作用，或药物在肿瘤内部的递送与分布情况，无法在培养皿中得到研究。因此，通常采用动物模型来模拟人体的生理与病理状态。然而，对生物过程进行长期、尤其是亚细胞分辨率的成像仍具有挑战性。分子成像技术，如磁共振成像（MRI）、单光子发射计算机断层扫描（SPECT）和正电子发射断层扫描（PET），具有良好的组织穿透深度，但分辨率较低，或难以呈现解剖结构。光学成像虽能提供高分辨率并实现结构可视化，但其组织穿透能力极差或非常有限。1结合背侧皮肤褶或腹部观察窗等观察窗技术的活体显微成像应用，可实现高分辨率成像 体内2,3,4该技术具有显著优势，可实现数小时甚至数天的纵向成像，从而在适当的生理背景下观察相关生物学过程例如， 成像组织中的细胞间相互作用），以及适用于先进共聚焦和多光子显微镜光学极限分辨率的成像。

引入带有细胞或蛋白质特异性荧光标记的转基因动物，为 体内 和 离体 实验。例如，可以研究细胞间的相互作用、蛋白质的产生以及对操作或治疗的响应 体内 使用这些模型5,6,7,8重要的是，利用适当的成像设备和方法，可以确定位置及其时间动态。本文介绍了在改良的背部皮肤折叠窗小室中植入肿瘤后，结合使用可注射试剂，对表达内皮标记物的动物进行活体显微成像的方法。

方案

所有动物实验均按照荷兰法律进行，并已获得荷兰鹿特丹伊拉斯姆斯医学中心动物实验委员会的批准。

1. 受体小鼠

  1. 转基因小鼠出生后，使用标准方法对动物进行基因型筛选9。
    注意：本论文中展示的数据来自本实验室自主研发的 eNOStag-GFP 品系9 和购自外部的 ROSA-mTmG（货号 007676）10 品系。
  2. 使用 12 周龄或以上且体重超过 20 g 的小鼠。

2. 供体小鼠

注意：用于植入背侧窗口的肿瘤碎片取自非转基因供体动物。根据肿瘤类型，使用正常小鼠（同源移植肿瘤）或免疫缺陷小鼠（异种移植）。

  1. 在37 °C、5% CO2条件下，将肿瘤细胞接种于含有适当补充物的培养基中，在培养瓶中进行培养。
  2. 从细胞培养瓶中移除培养基，用1× PBS洗涤一次，然后使用0.25%胰蛋白酶消化使细胞脱落。
  3. 加入细胞培养基以终止胰蛋白酶的消化作用。收集细胞，在1,200 × g条件下离心5分钟，弃上清，将细胞沉淀重悬于5 mL PBS中。
  4. 取20 µL细胞悬液与20 µL台盼蓝染液混合，台盼蓝可对死细胞进行染色。使用血细胞计数板计数活细胞与死细胞数量；死细胞比例不应超过10%。
  5. 再次在1,200 × g条件下离心5分钟，弃上清，将细胞沉淀重悬于预冷的PBS中，调整至每100 µL含100万个细胞。将细胞置于冰上运输至手术室。
  6. 使用异氟烷/O2对动物进行麻醉。打开氧气，调节流速至0.5 mL/min，将异氟烷挥发罐调节至3%。数分钟后，将小鼠放入麻醉舱内。 
    注意：应预先充满麻醉舱，确保其可立即使用，以 减少动物应激。
  7. 当小鼠进入镇静状态后，将其转移至保持在37 °C的手术加热板上，并将鼻部置入麻醉鼻罩中。
    1. 注意：当小鼠足垫受到夹捏刺激无反应时，表明麻醉效果充分。
  8. 剃除小鼠毛发以更清晰地暴露注射部位。使用0.5 mL胰岛素注射器进行接种，向小鼠侧 flank 注射100 µL细胞悬液，使其形成肿瘤。
  9. 根据所在机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的方法，在麻醉状态下通过颈椎脱位处死动物。使用显微剪刀和镊子在肿瘤部位剪开皮肤，分离并取出肿瘤组织。将肿瘤置于含PBS的培养皿中。使用显微剪刀和镊子将肿瘤切成约1 mm3大小的组织块（图1A-a）。
    注意：供体小鼠的肿瘤应足够大以提供充足的组织材料，但应避免使用体积过大或已发生坏死的肿瘤。对于大多数肿瘤，直径约10 mm即可满足要求。

3. 植入窗式观察室

  1. 所有操作均需在无菌条件下进行。对手术器械（图1A）和腔室材料（图1B）进行高压灭菌。
    注意：此处使用的窗式腔室总重量为1.1 g，由聚醚醚酮（PEEK）制成，这是一种轻质合成材料，具有磁共振成像（MRI）兼容性。PEEK比文献中常用于此类窗式装置的钛轻3.4倍。该材料耐大多数化学物质，性质惰性，不会引发免疫反应，且结构坚固。此窗式腔室的设计尺寸也小于先前发表的窗式装置。佩戴该腔室的小鼠运动能力完全正常，能够攀爬，体重增长情况与未佩戴窗式腔室的小鼠相当。由于动物可能啃咬该窗，合成材料窗的使用寿命可能略短于钛窗；但其制作简便且成本低廉。这些特定的窗式腔室为实验室自制，可根据需求获取。
  2. 使用吸入性麻醉剂（例如异氟烷/O2）在麻醉舱内对受体小鼠进行镇静。将小鼠转移至保持在37 °C的加热手术台上，并将鼻部置于麻醉鼻罩中（见步骤2.6）。涂抹眼膏以防止角膜干燥。
  3. 通过剃毛和涂抹脱毛膏去除小鼠背部全部毛发。仔细用接近体温的自来水冲洗，确保彻底清除所有脱毛膏残留。擦干小鼠后，用70%乙醇清洁皮肤。
    注意：剃毛操作也可在植入窗式腔室前一天完成。 必须用接近体温的水彻底清除脱毛膏，否则可能引起皮肤刺激。 
  4. 用记号笔在小鼠脊柱上标记中线，以确保腔室对称放置。调整小鼠体位，以中线为折叠位置将皮肤拉起成皮瓣，并捏住皮瓣中部。放置窗式腔室，使框架顶部至少低于中线2 mm，并用记号笔在皮肤上标出窗视区域的轮廓。
  5. 使用15号刀柄/刀片和显微剪刀，沿所画的圆形线切除皮肤。注意避免损伤下方筋膜。
    注意：此步骤形成腔室的观察窗区域，用于后续肿瘤移植。
  6. 提起皮褶，使用耳打孔器在观察窗区域两侧各打一个直径为1 mm的孔（图1A-b）。
    注意：这些孔用于安装两枚螺栓，以固定窗式框架。
  7. 使用螺栓安装定制的前部腔室框架（图1B-a、1B-c），并将后部框架（图1B-b）套入螺栓。在后部框架的螺栓上安装螺母（图1B-d）。
    注意：这些螺栓用于将腔室框架固定在皮褶上，并在显微镜下观察时用于固定腔室。
  8. 将皮肤拉起至框架顶部上方2-3 mm，确保可移植的观察窗区域与腔室区域对齐。将23 G针头穿过框架顶部的两个小缝合孔（图1B，黑色箭头）。使用微型螺丝刀（图1A-c）和夹持针持器拧紧螺栓上的螺母，以固定螺母。
    注意：需注意防止皮肤在螺栓周围扭转，且不可过度拧紧。
  9. 从顶部开始，用缝线替换针头，将框架固定在皮肤上。对框架上的5对缝合孔（图1B，白色箭头）均执行此操作。
  10. 将小鼠翻转，露出窗式腔室的背面。在后腔室区域放置一块直径为10 mm、厚度为0.55 mm的厚填充玻璃（图1B-e），然后放置一块标准的12 mm盖玻片（图1B-f）。使用固定环（图1B-g）将其固定在后腔室区域。
    注意：填充玻璃可防止筋膜与前部观察窗之间产生空隙，该空隙将用于成像。
  11. 用1 mL注射器吸取无菌0.9% NaCl，滴加数滴至即将植入肿瘤的观察窗区域，以保持湿润。用无菌棉签吸除多余生理盐水。
  12. 使用25 G针头（针尖弯曲成90°角）（图1A-d）在筋膜中创建一个足够容纳1 mm3肿瘤组织块（图1A-a）的腔隙。使用持针器或Kelly止血钳，将肿瘤组织块植入该腔隙中央的可移植观察窗区域。
  13. 用标准的12 mm盖玻片和固定环封闭观察窗区域。
    注意：可能会形成气泡，但数小时内会自行消失。

4. 动物的术前与术后护理

  1. 给予镇痛药物（即， 皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg），剂量需经本机构动物护理与使用委员会批准。将小鼠置于加热灯下，使其从麻醉状态恢复。
  2. 将带有窗口的小鼠单独置于笼中，并放置在温度设定为32 °C、湿度高于50%的控温室内。确保水瓶在安装到笼子前已达到环境温度，以防止漏水。使用允许小鼠无障碍活动并可自由接触食物和水的笼具及环境丰富化装置。
    注意：由于该窗式观察室耐受性极佳，小鼠表现出正常行为。单独饲养可防止其他小鼠对窗式观察室造成损伤，而高温/高湿度环境可避免皮肤褶的降温与脱水。
  3. 定期检查小鼠是否有咬断的缝线、松动的螺栓/螺母或破损的盖玻片，一旦发现应立即修复或更换。可使用轻质材料制成的保护罩覆盖窗口以提供保护。

5. 活体成像

注意：本实验步骤中使用多光子显微镜及相应的控制软件。此处使用显微镜配套提供的软件包。原则上，任何随显微镜配备、用于显微镜控制和图像采集的软件包均可满足此目的。

  1. 打开系统：开启电脑/显微镜、共聚焦控制单元电源、激光电源及激光发射。例如，启动该软件并初始化显微镜载物台图1E-a 和 1E-c) 通过点击 "初始化表格。" 打开系统并将其设置为允许电脑控制显微镜、xy载物台、z轴定位和图像采集的模式。
  2. 打开荧光灯（图1E-b).
    注意：此步骤用于通过目镜结合明场观察来评估荧光图像。
  3. 打开定制的温控平台（图1C-c；在讨论部分有更详细描述）设定为37 °C。
  4. 使用异氟烷/氧气开启麻醉机2 (图1E-d）。将麻醉管安装在显微镜载物台上（图1C-e）。在xy平台上安装一个夹具，以固定麻醉鼻罩部件。
  5. 在实验前对动物进行预评估，以确定肿瘤血管发育的阶段；该阶段取决于肿瘤生长速度，但在不同小鼠个体之间可能存在差异。
    1. 使用吸入性麻醉剂（异氟烷/O₂）对小鼠进行镇静2) 在麻醉室中（参见步骤 2.6）。
    2. 将动物放置在显微镜载物台上安装的温控平台上，以防止动物在麻醉过程中体温下降。确保小鼠的鼻部位于麻醉罩内，若检测时间超过5分钟，需涂抹眼膏。
      注意：若评估时间超过1小时，需将异氟烷气流调至2%。
    3. 使用腔室螺栓固定（图1C-b，完整的箭头）将腔室置于定制的腔室支架上（图1C-a）。将此固定器拧紧（图1C-d，虚线箭头）指向加热平台（图1C-c).
      注意：该组合可防止窗口观察区域出现运动伪影，同时仍允许动物自由呼吸。
    4. 务必使用蘸水的棉签清洁窗口观察区域的玻璃，以防止玻璃外部的碎屑造成图像模糊和干扰。将平台和小鼠放置在显微镜载物台上图1D).
      注意：确保尾部不会卡在平台与显微镜载物台之间。
    5. 使用10倍物镜，在明场和荧光光线下目视检查肿瘤血管发育阶段。
      注意：荧光标记的血管应处于清晰对焦状态，并可在明场下观察到血流。当血管结构清晰可见时，评估肿瘤血管发育的阶段。例如，判断是否存在以顶端细胞生长为特征的早期血管生成，或已形成可用于药物递送的成熟血管网络。同一动物可进行多次评估，由于肿瘤发育是一个连续过程，单个肿瘤内可同时观察到多个发育阶段。
      1. 当无法聚焦于血管系统时，将动物从载物台上移开，让小鼠恢复，并将其放回温控环境中。稍后再进行检查。当小鼠准备好接受评估时，继续执行下述步骤。
  6. 打开共聚焦激光器和控制面板，方法是单击 "激光" 和 "控制面板" 在配置选项卡中
    注意：建议将激光功率设置为较低水平，特别是使用氩离子激光器时，以防止荧光漂白、组织加热及光损伤。控制面板可根据个人偏好进行调节。对于使用多种荧光染料的活体成像，建议采用以下设置： "智能增益，每转100 V" "智能偏移，每次旋转10%" "放大，中等，" "X 位置，培养基" "Y轴位置，培养基，"和 "Z轴位置，每转100 µm。" 成像前，调整偏移量以降低噪声并优化信噪比。共聚焦显微镜的缩放功能可在不更换物镜的情况下实现更高倍数的放大。需通过 X、Y 和 Z 轴控制定位感兴趣的视野。进行活体显微观察时，由于需评估蜱虫组织，Z 轴定位每圈调节幅度应约为 100 µm。
  7. 点击 "采集" 在“采集”选项卡中，将设置更改为： "采集模式 XYZ 或 XYZT，" "格式（512x512 或 1024x1024）" 和 "速度（400 Hz 或 200 Hz）。" 点击 "针孔" 并将其设置为1艾里单位。单击 "双向X".
    注意：为了优化图像，应在激光功率、增益和针孔大小之间取得平衡，具体说明见讨论部分。
  8. 在评估多种荧光染料时，应选择“逐帧扫描”和“帧间扫描”模式，以防止串色现象，具体说明见讨论部分。  选择“Line Average 4”以有效降低噪声。
    注意：根据转基因动物体内固有的荧光特性，可将葡聚糖、Hoechst、FITC-BSA、荧光标记的化疗药物和/或纳米颗粒等其他荧光标记物用0.9% NaCl稀释至所需浓度后给予，并在肿瘤中进行检测。这些物质通过尾静脉或阴茎静脉注射。
  9. 点击 "实验" 在“采集”选项卡中选择 "新方法" 创建一个新的数据库。
  10. 根据研究问题，使用10X、20X或40X对动物进行评估 物镜。通过目镜找到一个位置进行评估。
    注意：最好使用数值孔径（NA）尽可能高的干镜，因为干镜的工作距离相对较长，且无需使用浸没液体。在讨论部分提到了水浸物镜的使用。
  11. 使用快速活体扫描来确定合适的增益和偏移，以防止过曝并优化信噪比。若需进行定量比较，则应在实验过程中及不同实验之间保持相同的成像设置。
    注意：最佳成像的其他注意事项详见讨论部分。可在实时扫描过程中，通过控制面板最终确定XYZ位置和缩放倍数。
  12. 要创建Z轴层叠图像，请选择 "Z轴扫描" 在“采集”选项卡中，使用控制面板中的 Z 轴位置进行快速 Z 扫描，并通过点击设置扫描的起始和结束位置 "开始 µm" 和 "末端 µm" 根据针孔大小设置Z步长。
  13. 点击以捕获图像 "开始。"
    注意：由于活体显微镜观察的重点是动力学过程，即动态生物学过程的成像，因此必须在图像采集所需时间与生物过程的动态速度之间做出权衡。通常情况下，分辨率越高、扫描的荧光通道越多、扫描视野越大，每幅图像包含的像素数量就越多。Z轴堆栈越厚，成像时间越长。成像时间延长会增加运动伪影的发生概率，并可能对被成像组织造成损伤。此外，需注意某些荧光标记在扫描过程中会发生光漂白和光毒性，其程度受激光功率以及染料在组织中累积浓度的影响。
  14. 扫描完成后，可通过点击“最大投影”快速评估Z轴层扫图像。Z轴层扫图像将自动保存至数据库中，并可重新命名。

6. 数据分析

  1. 根据原始研究问题，使用多种软件程序之一，例如 ImageJ5，Matlab11，或 Amira，用于数据分析。正确 分析至关重要。

结果

活体成像的主要特点是能够在无创条件下对细胞过程进行纵向可视化观察。为此，通常使用转基因动物，其目标细胞中可组成型或诱导型表达荧光标记物。 图2 展示 eNOStag-绿色荧光蛋白（GFP）中荧光标记的表达9 和 Rosa-mTmG 小鼠品系10eNOStag-GFP 是一种利用截短的 eNOS 基因作为 GFP 标签在本实验室自主构建的小鼠品系。值得注意的是，eNOS 在内皮细胞中高表达，GFP 信号在高尔基体和细胞膜上清晰可见图2A). Rosa-mTmG小鼠具有膜定位的双色荧光Cre报告等位基因。该品系在广泛分布的细胞中表达mTomato荧光，而在表达Cre重组酶的细胞中表达mGFP，被广泛用于谱系示踪。由于肿瘤组织来自非转基因供体，肿瘤中主要由间质部分表达红色荧光例如， 血管细胞、循环细胞、浸润的血细胞以及肿瘤相关成纤维细胞的细胞膜中（图2B)).

血管形成受到严密调控，发育中的视网膜是研究这一过程的优秀模型12,13。此外，肿瘤血管的生长是一种动力学过程，其基本原理与视网膜血管发育相似。然而，肿瘤血管缺乏有序结构，并且由于肿瘤持续发生重塑，其相关的脉管系统也随之不断改变。这在将肿瘤用作血管生成模型时可能具有优势，因为通常在同一肿瘤内可同时观察到血管发育的各个阶段。这些阶段包括向无血管区域延伸的内皮细胞出芽前沿（图2C）；受损的血管（图2D）；以及具有成熟、分支状血管的已建立血管床（图2E-I 和 图2E-II）。然而，在这些区域中也可发现具有血管生成活性的内皮细胞。在血管生成刺激因子的作用下，内皮细胞会伸出丝状伪足（图2E-III），并可进一步转变为顶端细胞，利用这些丝状伪足进行环境感知和定向迁移（图2E-IV）。该顶端细胞向肿瘤间质中迁移，并由随后分裂的柄细胞跟随。单个内皮顶端细胞在任意时刻均具有多个不断伸展、回缩和更新的丝状伪足，可通过活体显微镜进行追踪观察（图2F）。

其次，活体显微镜可用于观察血管生成前沿的管腔形成、肿瘤内部的血流情况以及血管外渗现象。根据动物体内已有的内源性荧光信号，可给予不同的荧光化合物。血流和血管外渗可通过 Hoechst、荧光标记的葡聚糖或 FITC-BSA 进行可视化。对于血流和颗粒外渗的长期研究，可使用粒径为 100 nm 的长循环荧光标记聚乙二醇化纳米颗粒。有关此类纳米颗粒制备的详细信息，请参见先前发表的文章5。这些化合物的应用示例如 Figure 3 所示。在 Rosa-mTmG 小鼠中，可以清晰地观察到内皮尖端细胞侵入肿瘤组织。通过系统注射的纳米颗粒在血管管腔中呈现紫色荧光，表明存在功能性血流（Figure 3A-I）。纳米颗粒接近内皮尖端细胞，显示了柄状细胞区域中管腔的形成（Figure 3A-II）。系统给予的化疗药物需依赖功能性的脉管系统才能到达肿瘤间质；如图 3B 所示，无论注射剂分子大小如何，均无法渗透至血管破坏、血管受压或存在血流停滞的区域。

在大多数器官中，内皮层在血液与下方组织之间形成一种功能性屏障，分子的通过受到严格调控。然而，与肿瘤相关的血管已知具有通透性，其孔径大小的截留阈值在很大程度上取决于肿瘤类型14。可通过注射不同尺寸的荧光标记葡聚糖来评估血流、通透性及外渗情况。Hoechst（615 Da）可快速扩散进入肿瘤组织，并被周围细胞摄取（图3C-I）。注射后不久，10 KDa葡聚糖（图3CII）和2 MDa葡聚糖（图3C-III）可在血液中检测到。然而，10 KDa葡聚糖也出现在肿瘤间质中，表明内皮层对较小分子具有通透性，这是肿瘤血管的一个特征。注射40分钟后（图3C-IV），10 KDa葡聚糖已从血液循环中清除（图3C-V），同时2 MDa葡聚糖的荧光强度也有所下降（图3C-VI）。然而，大分子葡聚糖未在肿瘤间质中发现，表明在此时间范围内，大分子无法通过血管壁，即缺乏对大分子的通透性。 

肿瘤病理生理学特征，如高度增殖、坏死及无血管化区域，在将肿瘤用作血管生成模型时可提供丰富的信息。然而，这也为有效治疗和研究带来了挑战。肿瘤相关血管结构的异质性导致了 给药药物分布不均，导致某些区域完全无药物15为了提高药物递送效率，可采用多种策略15,16,17，可利用该活体设计来检测治疗进展。可通过血管活性试剂调控肿瘤相关血管系统，以改善药物递送17本文展示了利用肿瘤坏死因子α（TNF）作为血管活性剂，联合阿霉素的脂质体包封制剂Doxil作为化疗药物，对肿瘤血管进行调控的结果。5,18,19与葡聚糖不同，聚乙二醇化纳米颗粒可在血液循环中持续数小时甚至数天20.

如前所述，可根据研究问题对肿瘤区域进行预扫描，以确定正确的肿瘤区域。可以评估药物在具有功能性血管系统的区域与血管床已受损区域内的分布情况（数据未显示）。为了在无细胞毒性干扰的情况下研究化疗药物的命运，可使用与治疗剂组成相同的纳米颗粒作为模型药物。一只eNOStag-GFP动物经尾静脉注射这些纳米颗粒，并在24小时后进行成像。此时纳米颗粒仍主要存在于血管系统中，仅有极少部分渗出至肿瘤间质（图4A-I）。然而，当纳米颗粒与TNF联合给药时，可观察到其从血液中渗出并进入肿瘤间质（图4A-II），从而提高肿瘤内的药物递送效率。通过使用高分辨率物镜，可识别化合物的细胞内定位，例如绿色的内皮细胞及肿瘤间质细胞中Hoechst的细胞核定位（图4B）。此外，由于许多化疗药物（如阿霉素）可与DNA发生嵌插作用，因此也可评估这些化合物的定位情况。阿霉素具有红色荧光特性，而纳米载体则可用高氯酸四甲基吲三羰花青（DiD）等染料标记。一只eNOStag-GFP动物经尾静脉注射Doxil-DiD并联合TNF给药，治疗24小时后采集图像。结果显示Doxil-DiD从血管中渗出，并被周围肿瘤组织摄取（图4C-I）。对单个细胞进行更详细的分析（图4C-II）显示，载体主要存在于细胞质中，而释放的阿霉素则定位于细胞核内。

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图1：实验所需仪器、背部皮肤皱襞窗室及设备装置。（A）用于移植的肿瘤组织块（a）及手术器械。非标准器械包括耳孔打孔器（b）、微型螺丝刀（c）和弯针（d）。（B）背部皮肤皱襞观察窗室。前窗（a）和后窗（b）（箭头：缝合孔；箭头末端：螺栓孔）、2个螺栓（c）、2个螺母（d）、1个填充玻璃片（e）、2个盖玻片（f）以及2个固定环（g）。必要时也可使用无钩固定环（白色箭头末端）。（C）定制的窗室固定架（a）、用于连接窗室与固定架的螺栓（b）、温控平台（c）、用于将固定架固定在平台上的螺栓（d），以及带麻醉导管的固定架（e）。（D）动物被固定于平台上的窗室固定架中。在观察窗区域可见B16BL6肿瘤（箭头）。（E）活体评估所需设备。配备成像与显微镜控制软件的计算机（a）、标准荧光光源（b）和显微镜。此处使用了多光子共聚焦显微镜（c）并连接麻醉装置（d）。请点击此处查看该图的放大版本。

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图2：转基因动物的内在荧光 所有显示的图像均为50至 70 µm 厚。A在eNOSGFP标记细胞系中，GFP在内皮细胞的高尔基体（星号）和细胞膜（箭头）中表达。比例尺 = 100 µm. (BRosa-mTmG 小鼠品系中肿瘤内 mTomato 的表达主要位于血管细胞（箭头）和血细胞（星号）的细胞膜。比例尺 = 100 µm. (C向无血管区域肿瘤内延伸的新生血管前端投影。比例尺 = 100 µm. (D) 部分肿瘤的投影，显示已建立和受损的血管（星号）。(E) 已建立肿瘤血管系统的投影（EI），显示成熟的粗大血管（EII）；具有丝状伪足的血管生成性内皮顶端细胞（EIII，箭头）；以及一条成熟血管，其单个内皮细胞向间质延伸出一个丝状伪足（EIV，箭头）。比例尺 = 100 µm. (F丝状伪足的运动情况持续观察1小时。每15分钟采集一次Z轴层扫图像，此处展示为最大强度投影。丝状伪足呈现延伸（白色箭头）、静止（=）、回缩（红色箭头）或甚至完全消失（-）的状态。比例尺 = 25 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。

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图3：注射可示踪标记物以展示外渗和血流情况。（A）对一只Rosa mTmG小鼠注射紫色荧光纳米颗粒，10分钟后采集侵袭性尖端细胞前端的Z轴层扫图像（AI）。投影图像显示大多数内皮细胞出芽具有功能性管腔（AII，箭头所示），极少观察到无血流的内皮出芽（AII，箭头指示处）。比例尺 = 250 µm。（B）该Z轴层扫投影显示，在治疗前，eNOStag-GFP动物模型中存在肿瘤血管破坏区域（BI）。对该动物注射纳米颗粒（紫色，BII）和Hoechst染料（蓝色，BIII）。纳米颗粒与Hoechst均无法到达破坏区域，该区域仍表达GFP，表现为颗粒状细胞碎片。比例尺 = 250 µm。（C）对一只eNOStag-GFP小鼠注射两种不同分子量的葡聚糖（红色 = 葡聚糖2 MDa；紫色 = 葡聚糖10 KDa）以及Hoechst染料（蓝色 = 615 Da），此处展示的是单层图像。注射后10分钟，可在同一图像中观察到物质在血液中的存在及其外渗情况。Hoechst几乎立即从血管中外渗并被周围细胞摄取（CI）。葡聚糖10 KDa（CII）可见于血管及肿瘤间质中，而葡聚糖2 MDa（CIII）仅存在于血管内。注射40分钟后（CIV），葡聚糖10 KDa已从血液中消失（CV），葡聚糖2 MDa的荧光强度也有所减弱（CVI）。比例尺 = 100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图4：化疗药物去向的研究。（A）一只eNOStag-GFP动物经静脉注射纳米颗粒，并在24小时后进行成像。纳米颗粒仍存在于血管中，在肿瘤间质中仅有极少的外渗（AI）。当纳米颗粒与TNF联合使用时，可观察到纳米颗粒从血液中外渗至肿瘤间质（AII）。比例尺 = 250 µm。（B）使用高分辨率物镜，可识别单个细胞的内皮细胞胞质（绿色）和细胞核（蓝色）。比例尺 = 50 µm。（C）一只eNOStag-GFP动物经静脉注射Doxil-DiD并联合TNF处理，24小时后采集图像。此处可见Doxil-DiD从血管外渗进入肿瘤间质的现象十分明显（CI）。对单个细胞进行更详细的观察（CII）显示，紫色的载体位于胞质内（箭头），而释放的阿霉素（红色）则出现在细胞核中（箭头指示）。比例尺 = 50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

由于肿瘤及肿瘤血管的发育过程以及肿瘤治疗效应具有高度动态性，活体评估是一种优雅的工具，可对这些过程进行时间和空间依赖性的准确评价。随着活细胞标记物的日益可及、转基因动物的构建以及成像技术的进步，活体成像正变得越来越普及。尽管组织学仍被常规使用，并且可利用多种标记物来识别细胞和结构，但在研究动态过程时，组织切片存在诸多缺点：需要进行组织解剖，仅能提供静态信息；固定处理会影响组织质量；切片过程会破坏细胞间的相互作用。此外，在研究动态过程时，若需在不同且常为推测的时间点进行组织解剖，则需要大量实验动物。 而通过活体成像，可在同一动物体内同时评估XYZ空间维度以及额外的时间维度，从而实现不同组分在空间和时间上的精确定位。因此，不会错过最佳时间点，且每个实验所需的动物数量显著减少。其次，通过活体评估建立的时间窗口可用于外推优化组织取材时机。第三，可在活体内识别血管生长的特定阶段，并将其作为整体组织进行染色观察。

本文所述的活体成像设计结合了在内皮细胞中表达荧光标记的转基因动物、改良的背部皮肤折叠腔模型以及专用的多光子共聚焦显微镜。

在血管生成过程中，内皮细胞会经历多个阶段21,22，这些阶段在肿瘤中常常可同时观察到。利用eNOSTag-GFP小鼠品系，可以追踪单个内皮细胞，甚至能够观察丝状伪足的动态变化。因此，该模型非常适合用于活体血管发育的研究。根据已有的内源性标记，可通过注射荧光试剂来评估管腔形成、血流、血管外渗及血液清除情况。小鼠可连续成像长达5小时。只要对动物麻醉采取若干预防措施，即可实现对动物的长期观察，相关方法已有先前文献描述23。由于本研究聚焦于癌症，因此植入了肿瘤组织或肿瘤细胞。但我们也曾尝试使用跖骨和胚胎肺组织。然而，所研究组织的生长速度存在限制：数周后皮肤开始再生，这对于生长缓慢的肿瘤或组织可能造成干扰。

在验证阶段，背侧皮肤褶窗室模型相较于经典模型进行了显著改进4。窗室框架由可高压灭菌的合成材料制成，质地轻便小巧，且具有较大的观察窗区域。固定环上的钩状结构（图1Bg，白色箭头）仅用于方便取下固定环；当钩状结构干扰成像时，可使用无钩的固定环。该模型中皮肤不会被过度拉伸，不会发生松脱现象，感染也极为罕见。这些改进显著减少了实验动物的不适，并优化了动物实验操作。此外，在使用 MRI24 对肿瘤进行成像时，金属部件可被轻松移除 。

任何显微镜均可用于活体成像背侧皮肤褶夹室。主要要求是显微镜载物台与物镜之间具备足够的空间。影响成像的一个重要因素是运动。为防止运动伪影，应使用一种可适配显微镜载物台（移除所有插件后）并能支撑小鼠的平台。当小鼠处于麻醉状态时，无需对其进行束缚，且最好让其自由呼吸。然而，需将夹室用螺栓固定于平台上，以实现视野的稳定固定即， 通过观察窗可清晰看到肿瘤。平台采用电子加热垫（常用于动物保温）进行加热。该平台为实验室自制，具体细节可根据要求提供。在评估细胞内过程时，必须使用高分辨率物镜，以便区分细胞质与细胞核。建议使用具有优良光学分辨率（高数值孔径，NA）且工作距离相对较长（ preferably 2 mm 或以上）的锥形透镜。成像的局限性主要在于光穿透深度以及荧光标记的强度。此外，成像过程中应避免光漂白、光毒性和信号饱和现象。

此处使用了集成的共聚焦-多光子显微镜和一台共聚焦显微镜。多光子显微镜为正置式，而共聚焦显微镜为倒置式。正置显微镜的优势在于可方便地使用水浸物镜。这类物镜即使在高倍率下也具有高数值孔径（NA）和长工作距离，例如， 20 或 40 倍）放大倍数下进行。建议选用数值孔径（NA）为 1.0 的 20 倍水浸物镜，该物镜由多家公司生产。需注意，使用浸液物镜时，物镜和浸液介质均需加热至 37 °C。为获得最佳图像，建议采用优化的共聚焦显微镜设置（即， 针孔直径设为1艾里单位，激光功率尽可能低，增益不宜过高（尤其是当增益引入噪声时），扫描线速度设为最大，且不进行扫描平均。过曝光、信号饱和以及图像间强度差异均会降低数据质量。建议避免信号饱和和过曝光，可通过在不同增益设置下采集图像来规避此问题。调节增益是改变图像亮度最简便的方法，必要时也可调整激光功率。为标准化图像质量，可使用具有固定荧光强度的载玻片。需注意的是，即使显微镜已优化设置，图像质量仍在很大程度上取决于观察窗腔和组织的质量。

同时扫描多个荧光标记时，必须避免串色干扰，即一种荧光染料的信号被检测到另一种荧光染料的通道中。可通过选用光谱重叠最小的荧光染料组合，并在不同帧之间进行逐次扫描来避免串色。本研究中展示的图像采用三次逐次扫描完成（通道1：GFP、DID或 fluor647，使用488和633激光器；通道2：罗丹明、Doxil或mTomato，使用543激光器；通道3：Hoechst，使用405激光器）。

本文展示了评估肿瘤血管发育多个阶段的可能性，包括顶端细胞动态、管腔形成、血管外渗以及血管损伤。利用 eNOStag-GFP 转基因品系，仍表达 GFP 的颗粒状细胞残留物可清晰指示血管床已被破坏的肿瘤区域。这些区域中未检测到可注射示踪剂，表明缺乏血流灌注，这意味着给予的化疗药物也无法到达这些区域。然而，血管破坏本身也可能是一种治疗效果。因此，在治疗前对肿瘤进行预评估，以确认是否存在治疗前的血管破坏，是准确评估疗效的前提，而本实验设计可轻松实现这一预评估。

活体显微镜的应用可能性极为广泛，详细讨论已超出本文的范围。简要而言，可能的应用包括研究化疗药物在肿瘤组织中的蓄积、血管的发育情况（例如血管数量、分支和交叉点）、血流动力学、细胞间相互作用、细胞靶向性以及细胞内加工过程，还包括上述及本处展示的示例。由于分析基于荧光信号，请注意因观察窗或组织质量导致的荧光强度波动。此外，由于肿瘤组织相对较厚，焦平面之上或之下的荧光也会对成像信号产生影响。最佳做法是将定量图像分析与客观测量手段相结合 。例如，若关注药物浓度，可在活体显微成像后将肿瘤组织从观察窗中取出，并采用高效液相色谱法（HPLC）测定药物含量，以与共聚焦图像进行比对。

肿瘤反应的评估也可使用此模型进行，但需采取一些预防措施。需要注意的是，肿瘤不仅向外生长，也会向皮肤内部生长。如果肿瘤侵入足够深，能够覆盖整个肿瘤，则可进行三维测量。在此情况下，应使用远红染料。此处所述的观察窗模型针对的是皮肤环境中的肿瘤，需要特别指出的是，观察窗所维持的温度略低于正常小鼠体温。因此，最好在合适的微环境条件下研究肿瘤，以验证背侧皮肤折叠观察窗模型中的活体研究结果。重要的是，背侧皮肤折叠观察窗可提供对生物过程与机制动力学的深入理解，为治疗方案的优化提供重要的实验基础。此外，还可获得有关药物体内分布及药代动力学的额外信息。传统上，这些体内分布研究通常通过处理荷瘤动物，随后解剖肿瘤或器官以测量药物摄取量来完成。利用这种活体模型，可获取药物在肿瘤内部的具体定位信息即， 血管内、瘤内、细胞内或细胞核内5,25,26不仅揭示了药物的分布位置，还明确了药物最佳摄取的时间窗口。

利用本文所述的实验设计，可以在时间和空间维度上评估多种参数。具体而言，本文展示了活体显微镜技术能够为肿瘤血管发育动态及治疗反应提供重要见解。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 Rien van Haperen 和 Rini de Crom 开发并捐赠 eNOSTag-GFP 小鼠品系，感谢 Joost A.P. Rens 在动物实验方面提供的技术支持，以及动物饲养人员给予的帮助。本研究所使用的显微成像设施隶属于伊拉斯谟光学成像中心（Erasmus Optical Imaging Center），我们感谢光学成像中心（OIC）工作人员提供的服务。本研究获得了荷兰癌症协会（Dutch Cancer Society）资助项目 DDHK 2000-2224、“Vereniging Trustfonds”伊拉斯谟大学鹿特丹分校以及“Stichting Erasmus Heelkundig Kankeronderzoek”基金会的支持，我们感谢各委员会成员的慷慨捐助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEMSigmaD1145添加10%胎牛血清（FCS）
胰蛋白酶-versene（EDTA）LonzaBE17-161E用PBS配制成0.1%的无菌溶液
PBS
窗框定制
填充玻璃片 10 mm，0.55 mmAbrisia technologies
盖玻片 12 mm，#1 厚度Thermo Scientific/VWR631-0713
脱毛膏（veet）适用于敏感肌肤
眼膏
盐酸布比诺啡使用剂量为0.05 mg/kg
麻醉装置氧气/异氟烷吸入装置，带麻醉舱、管路和面罩
胰岛素注射器 0.5 ml × 12.7 mm 29G，绿色BD324824
针头 23G 1 1/4"Braun4657640
针头 25G 5/8"Braun4657853
丝线缝合线 0.7Braun1134019
螺母Jeveka934 A2 1
螺栓Jeveka84 A2 1 10
0.9% NaCl
显微镜 + 软件载物台与物镜之间的空间需足够容纳动物
加热温控平台定制
窗片固定装置定制
四甲基罗丹明标记的分子量为2,000,000的葡聚糖InvitrogenD7139每只小鼠100 µg
Alexa Fluor 647标记的分子量为10,000的葡聚糖InvitrogenD22914每只小鼠100 µg
Hoechst 33342InvitrogenH1399每只小鼠25 µg
聚乙二醇化纳米颗粒参考文献5
LEICA TCS SP5 多光子显微镜Leica
LAS AF 软件Leica

参考文献

  1. Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
  2. Ellenbroek, S. I., van Rheenen, J. Imaging hallmarks of cancer in living mice. Nat Rev Cancer. 14, 406-418 (2014).
  3. Brown, E., Munn, L. L., Fukumura, D., Jain, R. K. In vivo imaging of tumors. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (7), pdb prot5452 (2010).
  4. Palmer, G. M., et al. In vivo optical molecular imaging and analysis in mice using dorsal window chamber models applied to hypoxia, vasculature and fluorescent reporters. Nat. Protocols. 6, 1355-1366 (2011).
  5. Seynhaeve, A. L., et al. Tumor necrosis factor alpha mediates homogeneous distribution of liposomes in murine melanoma that contributes to a better tumor response. Cancer Res. 67, 9455-9462 (2007).
  6. Schiffelers, R. M., et al. Ligand-targeted liposomes directed against pathological vasculature. J Liposome Res. 12, 129-135 (2002).
  7. Straetemans, T., et al. T-cell receptor gene therapy in human melanoma-bearing immune-deficient mice: human but not mouse T cells recapitulate outcome of clinical studies. Hum Gene Ther. 23, 187-201 (2012).
  8. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
  9. van Haperen, R., et al. Functional expression of endothelial nitric oxide synthase fused to green fluorescent protein in transgenic mice. Am J Pathol. 163, 1677-1686 (2003).
  10. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
  11. Manzoor, A. A., et al. Overcoming limitations in nanoparticle drug delivery: triggered, intravascular release to improve drug penetration into tumors. Cancer Res. 72, 5566-5575 (2012).
  12. Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat Protoc. 5, 1518-1534 (2010).
  13. Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. J Vis Exp. , e50546(2013).
  14. Hobbs, S. K., et al. Regulation of transport pathways in tumor vessels: role of tumor type and microenvironment. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 4607-4612 (1998).
  15. Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nat Rev Cancer. 6, 583-592 (2006).
  16. Koning, G. A., Eggermont, A. M., Lindner, L. H., Hagen, ten, L, T. Hyperthermia and thermosensitive liposomes for improved delivery of chemotherapeutic drugs to solid tumors. Pharm Res. 27, 1750-1754 (2010).
  17. Seynhaeve, A. L., Eggermont, A. M., ten Hagen, T. L. TNF and manipulation of the tumor cell-stromal interface: "ways to make chemotherapy effective". Front Biosci. 13, 3034-3045 (2008).
  18. Brouckaert, P., et al. Tumor necrosis factor-alpha augmented tumor response in B16BL6 melanoma-bearing mice treated with stealth liposomal doxorubicin (Doxil) correlates with altered Doxil pharmacokinetics. Int J Cancer. 109, 442-448 (2004).
  19. Hoving, S., Seynhaeve, A. L., van Tiel, S. T., Eggermont, A. M., ten Hagen, L. T. Addition of low-dose tumor necrosis factor-alpha to systemic treatment with STEALTH liposomal doxorubicin (Doxil) improved anti-tumor activity in osteosarcoma-bearing rats. Anticancer Drugs. 16, 667-674 (2005).
  20. Gabizon, A., et al. Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes. Cancer Res. 54, 987-992 (1994).
  21. Bergers, G., Benjamin, L. E. Tumorigenesis and the angiogenic switch. Nat Rev Cancer. 3, 401-410 (2003).
  22. Eilken, H. M., Adams, R. H. Dynamics of endothelial cell behavior in sprouting angiogenesis. Curr Opin Cell Biol. 22, 617-625 (2010).
  23. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. , e50088(2013).
  24. van Vliet, M., et al. MR angiography of tumor-related vasculature: from the clinic to the micro-environment. Radiographics. 25, Suppl 1. S85-S97 (2005).
  25. Dicheva, B. M., et al. Cationic thermosensitive liposomes: a novel dual targeted heat-triggered drug delivery approach for endothelial and tumor cells. Nano Lett. 13, 2324-2331 (2013).
  26. Li, L., et al. Improved intratumoral nanoparticle extravasation and penetration by mild hyperthermia. J Control Release. 167, 130-137 (2013).

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