在无异源条件下通过三维培养制备并给予治疗性间充质干细胞/基质细胞（MSC）球体

摘要

间充质干细胞/基质细胞（MSCs）的治疗潜力已有充分文献记载，但如何制备适用于患者的细胞仍存在争议。本文介绍在无异种成分条件下有效制备和施用经预处理的治疗性MSC球形聚集体（“球体”）的实验方案，适用于实验研究和临床应用。

摘要

间充质干细胞/基质细胞（MSCs）在生物工程与再生医学领域具有广阔的应用前景。MSCs 可从多种成体组织中分离获得，其分离基于它们对组织培养塑料的强附着性，随后可进一步扩增 体外，最常用的是胎牛血清（FBS）。由于FBS可能导致间充质干细胞（MSCs）产生免疫原性，其在MSC培养中的存在限制了这些细胞在临床和实验研究中的应用。因此，采用化学成分明确且无异源成分（xeno-free, XF）的培养基培养MSC的研究具有极高价值。MSC的多种有益作用被认为主要归因于其调节炎症和免疫的能力，这种能力主要是通过分泌免疫调节因子实现的，例如肿瘤坏死因子刺激基因6（TSG6）和前列腺素E2（PGE2）。然而，MSC需要被激活才能产生这些因子，且MSC的作用往往具有短暂性，因此目前人们越来越关注如何在使用前对细胞进行预激活，以消除激活所需的滞后时间 体内. 本文介绍了在三维（3D）培养条件下高效激活或启动间充质干细胞（MSCs）的实验方案 在化学成分明确的XF条件下培养，并给予这些预先激活的MSCs 体内具体而言，我们首先描述在XF培养基中利用悬滴法生成球形间充质干细胞微组织或“球体”的方法，并演示如何收集这些球体及其条件培养基（CM）用于各种应用。其次，我们描述基因表达筛选方法。 体外 用于快速评估球状体中MSC活化水平的功能性检测方法，重点突出这些细胞的抗炎和抗癌潜力。第三，我们介绍了一种将完整MSC球状体注射到小鼠腹腔内的新方法 体内 功效测试。总体而言，本文所述方案克服了在化学成分明确的无饲养层条件下获取预激活间充质干细胞的主要难题，并提供了一个灵活的系统，用于递送间充质干细胞球体以开展治疗。

引言

间充质干细胞/基质细胞（MSCs）在多种再生医学应用中展现出巨大潜力。MSCs最初作为骨髓基质成分被分离获得，此后亦从多种其他成体组织中成功分离，包括脂肪组织。^1,2,3有趣的是，主要的分离方法利用了间充质干细胞（MSCs）在胎牛血清（FBS）存在下能够紧密贴附于组织培养塑料表面的显著特性。尽管这种传统的分离技术可在二维（2D）培养条件下实现MSCs的简便且快速扩增，但其人工化程度较高，忽略了细胞所处天然三维（3D）微环境的重要性，可能导致重要细胞特性的丧失^4,5,6因此，为了寻找更接近生理条件的培养环境，间充质干细胞在三维培养体系中的研究逐渐兴起，该体系相较于传统的二维培养更具生理相关性 "丢失/减弱" 间充质干细胞的特性。此外，人们越来越关注确定无异源成分（XF）且化学成分明确的间充质干细胞培养与激活条件，从而使这些细胞更适用于临床应用。

已有大量研究发表，展示了间充质干细胞（MSCs）在生物材料中以及以球形聚集体或球体形式进行的三维培养。最初，生物材料中的MSCs培养设计用于组织工程，....

方案

1. 间充质干细胞的分离与扩增

1. 从成人干细胞制备与分发中心（http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html）获取早期传代的间充质干细胞（MSCs），以冻存管形式保存¹⁵。或者，也可按照常规方案从骨髓穿刺液中分离MSCs¹⁴，并以冻存管形式储存。
2. 配制完全培养基（CCM），即在最低必需培养基α（αMEM）中添加15-20%优质选择胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺和1×青霉素-链霉素。通过过滤除菌处理培养基。
3. 将30 ml CCM加入150 mm细胞培养皿中，置于含5% CO₂的湿润化培养箱内，37 °C孵育30分钟。
4. 将含有约10⁶个MSCs的冻存管在37 °C水浴中孵育2分钟。
5. 使用5 ml移液管将冻存管内容物转移至培养皿中，并用培养皿中的1-2 ml CCM反复冲洗冻存管数次，以回收残留细胞。将培养皿置于适宜培养箱中过夜培养。
6. 用室温磷酸盐缓冲液（PBS）小心洗涤细胞两次，随后加入3 ml预热的0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）溶....

结果

在本研究中，采用悬滴培养法在无血清条件下生成活化的间充质干细胞（MSCs）致密球形微组织或“类球体”。研究路线图如下 图1 表明当间充质干细胞（MSCs）在悬滴中悬浮培养72小时后，可促进其自发组装成球状体，随后可收集这些球状体，或收集含有球体来源治疗因子的条件培养基（CM），并可用于科研及临床应用。通过以低密度（通常为每平方厘米100–200个细胞）接种MSCs，可在一周内获得球体生成所需的大量细胞。²，然后将细胞扩增6-7天，直至汇合度达到约80%（图2）。通过每日计数活细胞确定的细胞生长动力学显示，短暂的迟滞期（1-2天）之后为一个显著的扩增期（第3-7天）。图2C). 使用 CCM 培养时，第2或第3代间充质干细胞通常可从一支含100万冻存细胞的冻存管中获得5000万至1亿细胞。

扩增并收获后，将间充质干细胞以高细胞浓度悬.......

讨论

在某些研究和临床应用中，最佳的间充质干细胞（MSC）应处于高度活化状态，以最大化其治疗效益，并优先在化学成分明确的无血清（XF）条件下制备，以减少来自异种培养基成分（如胎牛血清FBS）的潜在抗原递送。在本文所述的实验方案中，我们展示了以下方法：1）通过形成球状体在三维（3D）培养中活化MSC；2）在无血清（XF）条件下实现MSC的三维（3D）活化；3）评估球状体MSC在抗炎、免疫调节及抗肿瘤潜能方面的活化水平；4）将活化的MSC以完整球状体形式递送至小鼠体内。

间充质干细胞（MSCs）是一类多能干细胞，可通过贴壁法从多种成体组织（包括骨髓和脂肪组织）中分离获得。MSCs在组织培养塑料表面易于扩增，通常在相对较高浓度（10–20%）胎牛血清（FBS）条件下培养，表达一组特异性的表面标志物，并至少可向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞谱系分化。^1,16,17,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MEM-α α-最低必需培养基	赛默飞世尔科技 / 吉布科	12561049; 12561056; 12561072	用于制备间充质干细胞生长培养基（CCM）的最低必需培养基
FBS（胎牛血清），优质精选	Atlanta Biologicals	S11595；S11510；S11550；S11595-24	各类细胞完全培养基的组分
L-谷氨酰胺	赛默飞世尔科技/吉布科	25030081; 25030149; 25030164	各类细胞完全培养基的组分
青霉素/链霉素	赛默飞世尔科技/吉布科	15070063	各类细胞完全培养基的组分
0.22 微米无菌过滤装置 µm PES 膜	MilliporeSigma	SCGPU01RE；SCGPU02RE；SCGPU05RE；SCGPU10RE；SCGPU11RE	培养基灭菌
150 mm 细胞培养皿	Nunc	D8554 SIGMA	细胞培养
Thermo Forma 水套式 CO₂ 培养箱2 湿润培养箱	赛默飞世尔科技	Model 3110	培养细胞的孵育
早期传代的多细胞球体	德克萨斯A&M大学成人干细胞制备与分发中心&M健康科学中心医学院斯科特再生医学研究所 &和 白色	NA	间充质干细胞二维和三维培养的制备
水浴锅	VWR	89501-468	将培养基预热至37℃ °C
移液器	Eppendorf	492000904	手动液体处理
Pipete-Aid	Drummond Scientific Company	4-000-300	处理血清学移液管
康宁无菌血清移液管（5、10、25 和 50 ml）	康宁	4487; 4101; 4251; 4490	液体处理
PBS（磷酸盐缓冲液），pH 7.4	赛默飞世尔科技/Gibco	10010023; 10010072; 10010031; 10010049	细胞培养处理
0.25% 胰蛋白酶/EDTA 溶液	赛默飞世尔科技/吉布科	25200056; 25200072; 25200114	消化贴壁细胞并分散细胞团块
15 ml 离心管	Corning/BD Falcon	352097	细胞离心
50 ml 离心管	Corning/BD Falcon	352098	细胞离心
Eppendor 冷冻离心机	Eppendorf/Fisher Scientific	Model 5810R	细胞离心
血细胞计数板	Fisher Scientific	26716	细胞计数
台盼蓝	Sigma-Aldrich	T8154 SIGMA	血细胞计数板细胞计数过程中的死细胞排除
成分明确的无异源间充质干细胞培养基-1（XFM-1）	赛默飞世尔科技/Gibco	A1067501	无异源成分培养基，专为人类间充质干细胞的生长与扩增而设计
成分明确的无异源间充质干细胞培养基-2（XFM-2）	干细胞技术	5420	无明确异种成分的人类间充质干细胞培养基
HSA（人血清白蛋白）	双子座	800-120	无异源成分MSC培养基组分
重组人血清白蛋白（rHSA）	Sigma-Aldrich	A9731 SIGMA	无异源成分MSC培养基组分
总RNA提取小量试剂盒	Qiagen	74104	总RNA提取
Qiashredder	Qiagen	79654	总RNA提取前的样品匀浆化
RNase-free DNase 试剂盒	Qiagen	79254	总RNA提取过程中柱上DNA的去除
β-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M6250 ALDRICH	RLT缓冲液中RNase的抑制
涡旋混合	VWR	97043-562	混合样品
分光光度计	伯乐（Bio-Rad）	NA	RNA 浓度与质量
高容量 cDNA 反转录试剂盒	赛默飞世尔科技/应用生物系统	4368814	总RNA转录为cDNA
基因表达检测	赛默飞世尔科技/应用生物系统	有所不同	实时荧光定量PCR引物/探针组合
快速通用PCR预混液	赛默飞世尔科技/应用生物系统	4352042; 4364103; 4366073; 4367846	实时荧光定量 PCR 反应用预混液
实时荧光定量PCR系统（ABI Prism 7900 HT序列检测系统）	ABI Prizm	NA	实时荧光定量PCR
1.5 ml 离心管	Eppendorf	22364111	细胞离心、样品采集与保存
(-80 °C) 冷冻机	赛默飞世尔科技	赛默飞 Forma 8695 型	样品储存
PGE2（前列腺素 E2）ELISA 试剂盒	R&D Systems	KGE004B	样本中细胞因子浓度的测定
DMEM（Dulbecco）’s 改良伊格尔培养基)	赛默飞世尔科技/吉布科	10566-016; 10566-024;10566-032	巨噬细胞培养基
J774 小鼠巨噬细胞	ATCC	TIB-67	小鼠巨噬细胞系
12孔板	康宁	3513	体外 巨噬细胞刺激
LPS（脂多糖）	Sigma-aldrich	L4130	体外 巨噬细胞刺激
小鼠 TNF-α ELISA 试剂盒	R&D Systems	MTA00B	样本中细胞因子浓度的测定
小鼠IL-10（白细胞介素10）ELISA试剂盒	R&D Systems	M1000B	样本中细胞因子浓度的测定
RPMI-1640 培养基	赛默飞世尔科技 / 吉布科	11875-085	脾细胞培养基
BALB/c 小鼠	杰克逊实验室	651	体内 球状体递送；脾细胞制备
抗小鼠 CD3e 功能级纯化抗体	eBioscience	145-2C11	体外 脾细胞刺激
70 μm 细胞筛	康宁	352350	脾细胞制备
红细胞裂解液（1x）	Affymetrix eBioscience	00-4333	脾细胞分离过程中红细胞的去除
小鼠 IFN-γ （γ-干扰素）ELISA 试剂盒	R&D Systems	MIF 00	样本中细胞因子浓度的测定
LNCaP 前列腺癌细胞	ATCC	CRL-1740	研究三维培养的间充质干细胞对癌细胞系的影响 体外
基于DNA的细胞增殖检测试剂盒	赛默飞世尔科技	C7026	基于DNA含量的细胞数量测定
NaCl	Sigma-Aldrich	S5150	裂解试剂组分
EDTA（乙二胺四乙酸）	赛默飞世尔科技	FERR1021	钙螯合剂，裂解试剂组分
Rnase A	Qiagen	19101	用于DNA测量的RNA降解
基于滤光片的多功能微孔板读板仪	BMG 技术	NA	微量滴定板检测（ELISA、细胞定量、 等等。)
HBSS（Hank平衡盐溶液），无钙，无镁，无酚红	赛默飞世尔科技/吉布科	14175079	MSC 球体在重新悬浮前的处理 体内 注射
异氟烷	MWI 动物保健供应公司	502017	麻醉用于 体内 注射
氧气，压缩气体	普莱克斯	NA	用于异氟烷
Thermo Forma BSL-2 生物安全柜	赛默飞世尔科技	Model 1385	无菌细胞培养
安全型静脉导管/针芯，20 G，1 英寸	Terumo	SR*FNP2025	将类球体递送至腹腔
无菌微量移液器吸头	Eppendorf	有所不同	液体/细胞处理