方法文章

一个简单的一步解剖协议成人全安装准备果蝇脑

DOI：

10.3791/55128

⸱

2016年12月1日

 ,  ,  , 
1Center for Metabolic and Degenerative Diseases, The Brown Foundation Institute of Molecular Medicine, Programs in Human and Molecular Genetics and Neuroscience, The Graduate School of Biomedical Sciences at Houston, The University of Texas Health Science Center at Houston, 2Department of Natural Sciences, University of Houston - Downtown, 3Department of Neurobiology and Anatomy, McGovern Medical School, The University of Texas Health Science Center at Houston

本文内容

摘要

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成年果蝇大脑是研究神经回路，大脑高级功能和复杂性疾病的宝贵制度。一种有效的方法来剖析来自小苍蝇头全脑组织将促进脑为基础的研究。在这里，我们描述了一个简单的一步解剖成人的大脑保存完好的形态协议。

摘要

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有在使用果蝇到人脑退行性疾病的模型，在成人大脑映射神经设计电路，和研究的高级脑功能的分子和细胞基础的兴趣日益增加。成人大脑的整体卡口制剂保存完好的形态是这样的全脑为基础的研究关键的，但也可以是技术挑战性和耗时。这个协议描述了成年果蝇头部在不到10秒的一个易于了解，一步法解剖的方法，同时保持附连到身体的其他部分的完整的脑，以方便后续处理步骤。该过程有助于消除最通常与可以与稍后成像步骤干涉大脑相关的眼睛和气管组织的，并且也对所述解剖钳的质量需求较少。此外，我们描述一个简单的方法，可用于在盖玻片安装的脑样品的方便翻转，这是用于成像的B的两侧重要降雨具有类似信号强度和质量。作为协议的一个例子，我们在野生成年大脑多巴胺能呈现（DA）神经元的分析（ 附1118）苍蝇。解剖方法的疗效高，使其成为在果蝇中大型为主脑的成人研究特别有用。

引言

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模式生物果蝇 ，俗称实蝇，长期以来一直重视其优雅的基因工具，短生育时间和高度保守的分子和细胞通路。果蝇已成功地用于解剖基本信号通路，多细胞生物体的图案化的机制，以及神经元发育，功能的基本机制，和疾病1,2-。在细胞标记和成像技术的最新进展，果蝇大脑已经成为神经回路的精细定位，并在解剖的高级脑功能，例如学习，记忆，和昼夜节律1,3的分子和细胞基础特别强大， 4,5,6,7,8。

果蝇系统的一个特别的优点是它的相对小的尺寸，允许使用常规化合物或共焦显微镜的大脑整个安装制备和检查。氏取值特征使神经元电路的详细解剖和功能分析，或甚至一个单一的神经元，在细胞和亚细胞水平，在全脑组织的范围内，从而在整个内提供所研究的受试者的两个整体视图及其精确几何脑。然而，考虑到大脑的相当小尺寸，它也呈现在一个成年果蝇有效解剖一个完整的脑组织从保护外骨骼头壳体的技术挑战。各种有效和相对简单的解剖的方法已详细描述，其通常涉及仔细和分步除去头部壳体的和相关的组织，包括眼睛，气管，和脂肪从大脑适当9,10，这些显微解剖的方法经常放置在解剖钳的质量相当严格的要求，依托细以及对齐提示，可以很容易损坏钳。此外，作为解剖大脑往往分隔符从身体的其余编，大脑可以容易地期间，因为它们的小尺寸和它们在处理缓冲器透明度的后续染色和洗涤过程丢失。在这里，我们描述了，保持连接到躯干的解剖大脑成人大脑相对简单....

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方案

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1.解决方案用于脑解剖和免疫荧光染色

  1. 解剖成人飞脑在人造脑脊髓液（ACSF）:119 mM氯化钠，26.2毫碳酸氢钠 ，2.5mM的氯化钾，1mM的的NaH 2 PO 4，1.3毫氯化镁 ，和10mM葡萄糖。在使用前，气体用5％ 的 CO 2/95％O 2，10的脑脊液- 15分钟，穗带的2.5mM的CaCl 2。通过一个0.22微米的膜过滤器灭菌脑脊液溶液。
    注:储存脑脊液在4℃，以防止细菌污染。飞大脑也可以在磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液解剖，虽然对解剖大脑的最终成像质量两个夹层溶液的作用详细的比较没有被执行。
  2. 使用在1×PBS中制备的固定剂溶液，其通常等分并储存在-20℃的4％多聚甲醛（PFA）。
    CautioN:PFA是有毒和腐蚀性，应小心处理。
  3. 使用1X PBS从大脑和最后的清洗步骤后冲洗PFA，解剖大脑的免疫荧光染色过程中。从10倍的PBS原液制备1×PBS中（1.37 M氯化钠，27毫米氯化钾，100mM的磷酸氢二钠，和18毫KH 2 PO 4）。
  4. 解剖脑的免疫荧光染色期间在1×PBS中（1×....

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结果

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图1示出了用于成人脑解剖主程序中，如上所述图2和3是3日龄WT代表性图像（基因型:W 1118）成人飞大脑，其被costained用抗酪氨酸羟化酶的抗体（TH ，用红色的图2和白色图3），一个标记通常用于标记多巴胺神经元11中，除了将DNA染料DAPI标记所有所有分化的神经元细胞的细胞核和针对ELAV蛋白的抗体，标记物在飞（着色为绿色），它们一起显示了大脑的整体结构。

对于在图2和3中的第一抗体，我们使用兔抗TH抗体以1:200的稀释和大鼠抗ELAV抗体以1:100稀释，WHI通道分别在1×PBT制备含5％正常山羊血清阻断非特异性结合。对于二级抗体，我们使.......

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讨论

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在使用成年果蝇脑研究人类脑疾病，神经元的电路，和更高的脑功能的兴趣日益增加，需要开发简单和快速的方法，以获得完整的飞大脑对于整个贴装分析，这是适用于大尤其重要比例基于大脑的屏幕。我们的方法提供了一个简单，易于学习的方法来剖析出一只苍蝇头（通常在不到10秒的经验）有保存完好的形态被清除大部分相关的组织。作为解剖大脑仍附着到飞体的其余部分，它们通常下沉快速样品管的底部，很容易在洗涤和染色步骤，以识别和收集。这显著减少样品损失，可以是一个突出的问题在加工微小的物理尺寸的脑样品。这个问题可以是大规模的研究尤其重要。大脑可以从主体容易脱落在完成染色过程中，安装前后。

在夹层中，以正确地定位飞，从蝇头拆除外骨骼时保持适当的角度，并轻轻在执行每个步骤施加适当的力是非常重要的。建议在钳子被垂直地放置于彼此，以便防止所述飞（ 图1B）的断头。如图中的代表图像在图2中，使用该方案制备的脑中产生令人满意的结果。在这个例子中，我们集中在成人脑的PAM集群中的多巴胺神经元。 果蝇的大脑中有平均每总额约pr.......

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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我们承认埃内斯穆罕默德先生，伽罗安德拉德女士，Pilar Rodriguez女士，克里斯国和丹娜Ghafir女士对项目的巨大支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
w*; 公园Δ21/TM3， P{GAL4-Kr.C}DC2， P{UAS-GFP.S65T}DC10， Sb1布卢明顿果蝇库存中心51652平衡器已切换到 TM6B
PBac{WH}parkf01950Exelixis 哈佛医学院f01950平衡器已切换到 TM6C
NaCl Fisher ScientificS640-500
碳酸氢钠 （NaHCO3） Fisher Scientific02-003-990
氯化钾 （KCl）Fisher ScientificBP366-500
磷酸钠，一氢二氢物 （NaHCO3）Fisher Scientific02-004-198
氯化镁 （MgCl2）Fisher Scientific02-003-265
D-山梨糖醇Sigma-AldrichS1876-500G替代葡萄糖
二水氯化钙 （CaCl2）Sigma-AldrichC5670-500G
EMD Millipore Durapore PVDF 膜过滤器：亲水性：0.22 µm 孔径Fisher ScientificGVWP14250
福尔马林溶液，10%（组织学）Fisher ScientificSF98-20
磷酸钾，氢二元，粉末，超纯生物试剂Fisher Scientific02-003-823
吐温-20Fisher ScientificBP337-500
Excelta 精密镊子，带非常细的点Fisher Scientific17-456-055协议不需要非常精细的要点。
抗酪氨酸羟化酶抗体Pel-Freez BiologicalsP40101
大鼠-Elav-7E8A10 抗 elav发育研究杂交瘤细胞库克隆 7E8A10
山羊抗大鼠 IgG （H+L） 二抗，Alexa Fluor 647 偶联物 ThermoFisherScientificA-21247
山羊抗兔 IgG （H+L） 二抗，Alexa Fluor 594 偶联物ThermoFisher科学A-11037
DAPI 溶液 （1 mg/mL）ThermoFisher Scientific62248
没食子酸丙酯粉末Sigma-AldrichP3130-100G
甘油 ACS 试剂，≥99.5%Sigma-AldrichG7893-500ML
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参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit flies in biomedical research. Genetics. 199, 639-653 (2015).
  2. Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan's legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163, 12-14 (2015).
  3. Aso, Y., et al.

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