一种简单的单步解剖方案用于成年个体整体装片制备 果蝇 大脑

摘要

成年Drosophila 大脑是研究神经回路、高级脑功能及复杂疾病的重要模型系统。一种高效地从小型果蝇头部解剖出完整脑组织的方法将有助于基于大脑的研究。本文介绍一种操作简便的单步解剖法，可获得形态完整保留的成年果蝇大脑。

摘要

人们日益关注利用Drosophila来建立人类脑退行性疾病的模型，绘制成年果蝇大脑中的神经回路图谱，并研究高级脑功能的分子与细胞基础。对于此类全脑研究而言，制备形态保存良好的成年果蝇全脑整体标本至关重要，但该过程在技术上具有挑战性且耗时。本实验方案介绍了一种易于掌握的、在10秒内完成的成年果蝇头部单步解剖方法，该方法在解剖过程中保持脑组织完整并连接于身体其余部分，从而有利于后续处理步骤。该操作有助于去除通常附着在脑组织上的大部分眼组织和气管组织，这些组织可能干扰后续成像步骤，同时对解剖镊的质量要求较低。此外，我们还描述了一种简便的方法，可方便地在盖玻片上翻转已封片的脑样本，这对于以相似的信号强度和成像质量对脑组织的两面进行成像尤为重要。作为该方案的应用示例，我们展示了对野生型（WT）（w¹¹¹⁸）果蝇成年脑中多巴胺能（DA）神经元的分析。该解剖方法的高效性使其特别适用于大规模的Drosophila成年脑相关研究。

引言

模式生物Drosophila（俗称果蝇）因其成熟的遗传学工具、较短的繁殖周期以及高度保守的分子和细胞通路而长期受到重视。果蝇已被成功用于解析基本的信号转导通路、多细胞生物的图式形成机制，以及神经元发育、功能和相关疾病的机制^1,2。随着细胞标记和成像技术的最新进展，果蝇大脑在神经环路的精细定位以及高级脑功能（如学习与记忆、昼夜节律）的分子和细胞基础研究方面展现出尤为强大的优势^{1,3,4,5,6,7,8.}

一个特别的优势是 黑腹果蝇 其系统的一个显著特点是相对较小的体积，使得能够利用常规的复式显微镜或共聚焦显微镜对完整脑组织进行整体装片制备与观察。这一特性可在全脑组织背景下，在细胞及亚细胞水平上对神经回路乃至单个神经元进行详细的解剖学与功能分析，从而既提供所研究对象的整体视角，又揭示其在全脑中的精确几何定位。然而，由于果蝇脑体积微小，如何从成年果蝇的保护性外骨骼头壳中高效地分离出完整无损的脑组织，仍是一项技术挑战。目前已详细描述了多种有效且相对简便的解剖方法，通常包括逐步而细致地去除头壳以及与脑组织相连的眼、气管和脂肪等附属组织。^{9, 10}这些显微解剖方法通常对解剖镊的质量要求较高，依赖于尖端精细且对齐良好的镊子，而这类镊子容易损坏。此外，由于解剖出的脑组织通常与身体其他部分分离，在后续染色和洗涤过程中，因其体积小且在处理缓冲液中透明，容易丢失。本文介绍一种相对简单且易于掌握的成....

方案

1. 大脑解剖和免疫荧光染色所用溶液

1. 在人工脑脊液（aCSF）中解剖成年果蝇大脑：aCSF 含有 119 mM NaCl、26.2 mM NaHCO₃、2.5 mM KCl、1 mM NaH₂PO₄、1.3 mM MgCl₂ 和 10 mM 葡萄糖。使用前，用 5% CO₂/95% O₂ 混合气体通气 10–15 分钟，并加入 2.5 mM CaCl₂。通过 0.22 µm 微孔滤膜过滤，对 aCSF 溶液进行灭菌。
   注意：aCSF 应储存于 4 °C，以防止细菌污染。果蝇大脑也可在磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液中解剖，但目前尚未对这两种解剖液对解剖后大脑成像质量的影响进行详细比较。
2. 使用以 1x PBS 配制的 4% 多聚甲醛（PFA）作为固定液，通常分装后储存于 -20 °C。
   注意：PFA 具有毒性和腐蚀性，操作时应谨慎。
3. 在解剖后大脑的免疫荧光染色过程中，使用 1x PBS 冲洗去除大脑中的 PFA，并在最后一次洗涤步骤中使用。1x PBS 需由 10x PBS 储存液（1.37 M NaCl、27 mM KCl、100 mM Na₂HPO₄ 和 18 mM KH....

结果

图1展示了上述成年果蝇脑组织解剖的主要步骤。图2和图3为3日龄野生型（基因型：w¹¹¹⁸）成年果蝇脑组织的代表性图像，样品经酪氨酸羟化酶（TH）抗体染色（在图2中显示为红色，在图3中显示为白色）；TH是标记多巴胺能神经元的常用标志物¹¹。此外，还使用DNA染料DAPI标记所有细胞核，并使用Elav蛋白抗体标记果蝇中所有已分化的神经元（显示为绿色），以上染色共同揭示了脑组织的整体结构。

对于图2和图3中的初级抗体，我们使用了1:200稀释的兔抗TH抗体和1:100稀释的鼠抗Elav抗体，抗体用含5%正常山羊血清的1×PBT配制，以阻断非特异性结合。对于二抗，我.......

讨论

随着人们对利用成年Drosophila（果蝇）大脑研究人类脑疾病、神经环路及高级脑功能的兴趣日益增加，有必要开发简单快速的方法以获取完整的果蝇大脑用于整体装片分析，这对于大规模基于大脑的筛选尤为重要。本方法提供了一种简单且易于掌握的技术，可用于解剖果蝇头部（通常在有经验的情况下不到10秒 即可完成），获得形态保持良好且大部分附属组织已被清除的样本。由于解剖后的大脑仍附着在果蝇身体其余部分上，通常能迅速沉降至样品管底部，在洗涤和染色步骤中易于识别和收集。这显著减少了因样本物理尺寸微小而在处理过程中可能出现的样本丢失问题，该问题在大规模研究中尤为突出。在完成染色过程后、封片前，大脑可轻松从身体分离。

在解剖过程中，正确固定果蝇体位、去除头部外骨骼时保持适当角度，并在每一步操作中轻柔施加适当力度至关重要。建议将镊子相互垂直放置，以防止果蝇头部被切断图1B）。如代表性图像所示 图2，采用本方案制备的脑组织可获得满意的结果。在本示例中，我们重点关注成年果蝇脑中PAM簇的多巴胺能神经元。A .......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
w*； parkΔ21/TM3， P{GAL4-Kr.C}DC2， P{UAS-GFP.S65T}DC10， Sb1	布卢明顿果蝇品系中心	51652	平衡染色体已更换为 TM6B
PBac{WH}parkf01950	哈佛医学院 Exelixis 公司	f01950	平衡染色体已更换为 TM6C
NaCl	费舍尔科技公司	S640-500
碳酸氢钠 (NaHCO3)	费舍尔科技公司	02-003-990
氯化钾 (KCl)	费舍尔科技公司	BP366-500
磷酸二氢钠一水合物 (NaHCO3)	费舍尔科技公司	02-004-198
氯化镁 (MgCl2)	费舍尔科技公司	02-003-265
D-山梨醇	Sigma-Aldrich 公司	S1876-500G	用于替代葡萄糖
二水合氯化钙 (CaCl2)	Sigma-Aldrich 公司	C5670-500G
EMD Millipore Durapore PVDF 膜滤器：亲水性：0.22 µm 孔径	费舍尔科技公司	GVWP14250
10% 甲醛溶液（组织学用）	费舍尔科技公司	SF98-20
磷酸氢二钾粉末，超纯生物试剂	费舍尔科技公司	02-003-823
Tween-20	费舍尔科技公司	BP337-500
Excelta 精密镊子，超细尖端	费舍尔科技公司	17-456-055	本实验方案不要求使用超细尖端。
抗酪氨酸羟化酶抗体	Pel-Freez 生物制品公司	P40101
大鼠抗-elav 单克隆抗体 7E8A10	发育研究杂交瘤库	克隆号 7E8A10
山羊抗大鼠 IgG (H+L) 二抗，Alexa Fluor 647 标记	赛默飞世尔科技公司	A-21247
山羊抗兔 IgG (H+L) 二抗，Alexa Fluor 594 标记	赛默飞世尔科技公司	A-11037
DAPI 溶液 (1 mg/mL)	赛默飞世尔科技公司	62248
没食子酸丙酯粉末	Sigma-Aldrich 公司	P3130-100G
甘油 ACS 级试剂，≥99.5%	Sigma-Aldrich 公司	G7893-500ML
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