成年Drosophila 大脑是研究神经回路、高级脑功能及复杂疾病的重要模型系统。一种高效地从小型果蝇头部解剖出完整脑组织的方法将有助于基于大脑的研究。本文介绍一种操作简便的单步解剖法，可获得形态完整保留的成年果蝇大脑。
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摘要
摘要
人们日益关注利用Drosophila来建立人类脑退行性疾病的模型，绘制成年果蝇大脑中的神经回路图谱，并研究高级脑功能的分子与细胞基础。对于此类全脑研究而言，制备形态保存良好的成年果蝇全脑整体标本至关重要，但该过程在技术上具有挑战性且耗时。本实验方案介绍了一种易于掌握的、在10秒内完成的成年果蝇头部单步解剖方法，该方法在解剖过程中保持脑组织完整并连接于身体其余部分，从而有利于后续处理步骤。该操作有助于去除通常附着在脑组织上的大部分眼组织和气管组织，这些组织可能干扰后续成像步骤，同时对解剖镊的质量要求较低。此外，我们还描述了一种简便的方法，可方便地在盖玻片上翻转已封片的脑样本，这对于以相似的信号强度和成像质量对脑组织的两面进行成像尤为重要。作为该方案的应用示例，我们展示了对野生型（WT）（w1118）果蝇成年脑中多巴胺能（DA）神经元的分析。该解剖方法的高效性使其特别适用于大规模的Drosophila成年脑相关研究。
引言
模式生物Drosophila（俗称果蝇）因其成熟的遗传学工具、较短的繁殖周期以及高度保守的分子和细胞通路而长期受到重视。果蝇已被成功用于解析基本的信号转导通路、多细胞生物的图式形成机制，以及神经元发育、功能和相关疾病的机制1,2。随着细胞标记和成像技术的最新进展，果蝇大脑在神经环路的精细定位以及高级脑功能（如学习与记忆、昼夜节律）的分子和细胞基础研究方面展现出尤为强大的优势1,3,4,5,6,7,8.
一个特别的优势是 黑腹果蝇 其系统的一个显著特点是相对较小的体积，使得能够利用常规的复式显微镜或共聚焦显微镜对完整脑组织进行整体装片制备与观察。这一特性可在全脑组织背景下，在细胞及亚细胞水平上对神经回路乃至单个神经元进行详细的解剖学与功能分析，从而既提供所研究对象的整体视角，又揭示其在全脑中的精确几何定位。然而，由于果蝇脑体积微小，如何从成年果蝇的保护性外骨骼头壳中高效地分离出完整无损的脑组织，仍是一项技术挑战。目前已详细描述了多种有效且相对简便的解剖方法，通常包括逐步而细致地去除头壳以及与脑组织相连的眼、气管和脂肪等附属组织。9, 10这些显微解剖方法通常对解剖镊的质量要求较高，依赖于尖端精细且对齐良好的镊子，而这类镊子容易损坏。此外，由于解剖出的脑组织通常与身体其他部分分离，在后续染色和洗涤过程中，因其体积小且在处理缓冲液中透明，容易丢失。本文介绍一种相对简单且易于掌握的成年果蝇脑组织一步解剖方案，该方法在解剖过程中保持脑组织与躯干相连。此方法通常可轻松去除大部分与脑组织相连的附属组织（如复眼和气管），同时降低了对高质量解剖镊的需求。
此外，在荧光化合物显微镜或共聚焦显微镜下对脑组织成像时，由于整体脑样本较厚，远离荧光光源的一侧往往产生较弱的信号和更不清晰的图像。本文还描述了一种简单的封片方法，可方便地翻转脑样本，从而能够便捷地对脑组织的两侧进行成像，并获得相似信号强度和质量的图像。
为了验证该方法在研究成年大脑中的应用概念，我们进一步检测了w1118果蝇大脑中多巴胺能神经元的存在情况；该基因型常被用作构建转基因果蝇的亲本品系，并在许多黑腹果蝇（Drosophila）研究中作为野生型对照。
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方案
1. 大脑解剖和免疫荧光染色所用溶液
- 在人工脑脊液（aCSF）中解剖成年果蝇大脑：aCSF 含有 119 mM NaCl、26.2 mM NaHCO3、2.5 mM KCl、1 mM NaH2PO4、1.3 mM MgCl2 和 10 mM 葡萄糖。使用前，用 5% CO2/95% O2 混合气体通气 10–15 分钟，并加入 2.5 mM CaCl2。通过 0.22 µm 微孔滤膜过滤，对 aCSF 溶液进行灭菌。
注意：aCSF 应储存于 4 °C，以防止细菌污染。果蝇大脑也可在磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液中解剖，但目前尚未对这两种解剖液对解剖后大脑成像质量的影响进行详细比较。 - 使用以 1x PBS 配制的 4% 多聚甲醛（PFA）作为固定液，通常分装后储存于 -20 °C。
注意：PFA 具有毒性和腐蚀性，操作时应谨慎。 - 在解剖后大脑的免疫荧光染色过程中，使用 1x PBS 冲洗去除大脑中的 PFA，并在最后一次洗涤步骤中使用。1x PBS 需由 10x PBS 储存液（1.37 M NaCl、27 mM KCl、100 mM Na2HPO4 和 18 mM KH2PO4）稀释配制。
- 在解剖后大脑的免疫荧光染色过程中，所有后续洗涤步骤均使用含 0.3% Tween-20 的 1x PBS（即 1x PBT）。
2. 成年果蝇头部的显微外科解剖
注意： 解剖步骤如图1所示。
- 用CO₂麻醉成年果蝇2使用镊子夹取一只果蝇，将其浸入70%乙醇中3至5秒以短暂去除体表蜡质。此步骤可确保果蝇体壁在浸入aCSF或1×PBS解剖液时无气泡附着。
- 在体视显微镜下，调整光源角度使其不被操作者的手遮挡，设置物镜以获得清晰的果蝇图像（1.2倍放大倍数）。用非优势手持镊子固定果蝇，将其浸入冷解剖液中，使腹部朝上，如图所示 图1A.
- 保持镊子呈160°角 - 与解剖板呈170°角，同时对果蝇腹部施加轻微的力（图中以箭头表示） 图1A）。此步骤将固定果蝇，并迫使其头部向后移动15 - 25° 同时将喙向上伸展。在此过程中，喙下方角质层下应出现一个柔软且半透明的区域。增加放大倍数，并将焦平面调整至该区域。
注意： 不要过紧地握住镊子，而应以刚好稳定果蝇的力度夹持。用力过大将导致果蝇内部器官破裂并溢出至溶液中。 - 用惯用手按压解剖镊子，使其尖端闭合，从而在镊尖产生轻微的阻力，当持镊手松开压力时，镊子便会弹开。将镊子垂直于夹持果蝇的镊子放置，如图所示。 图1B.
- 用解剖镊的闭合尖端刺穿喙下方角质层柔软且半透明的区域，如图中红色箭头所示 图1B切勿将镊子插入过深，以免触碰到脑组织，应使脑部本身清晰可见。用非惯用手稳定夹住果蝇。
- 快速地 但要平稳地依靠解剖镊自身的力量松开镊尖，并利用松开时产生的动量撕开环绕果蝇头部的外骨骼。此时应可见完整的大脑本体（位于下方镊尖正上方的白色组织）。 图1C) 沿一条假想线引导释放的镊子尖端的受力方向（如图中向外的红色箭头所示） 图1C）。这将轻柔地去除脑组织相关的外骨骼、眼睛和气管。打开外骨骼所需的时间和力度取决于操作者的经验。
注意： 这是解剖过程中最关键的一步。必须依靠镊子张开时产生的自然动量来去除外骨骼，同时确保暴露的大脑仍与身体其余部分相连。 - 用惯用手持镊子小心去除残留的附属组织，例如呈白色纤维状结构并仍附着在脑组织上的气管组织。注意避免牵拉或损伤脑实质。
3. 脑组织的免疫荧光染色
- 用约 1 mL 的 4% 多聚甲醛（PFA）固定带有相应躯干的解剖脑样本，固定时间为 40 - 60 分钟。
注意：在此步骤及后续步骤中，将装有样本的管子或培养板置于摇床上，以确保样本在溶液中充分混合。 - 用 1 mL 的 1× PBS 溶液吹打洗涤 3 次。注意不要吸走脑组织。
- 用 1× PBT 溶液洗涤 5 次，每次 5 分钟。孵育期间保持样本在摇床上。
- 在 4 °C 条件下，用适当稀释倍数的一抗孵育过夜（O/N）。
- 次日，移除一抗，并用 1× PBT 溶液洗涤样本 5 次，每次洗涤间隔在 1× PBT 溶液中孵育 5 - 10 分钟。孵育期间保持样本在摇床上。
- 将洗涤后的样本在适当的二抗中孵育，使用推荐的稀释比例和孵育时间。
- 用 1× PBT 溶液洗涤 6 次，每次孵育 10 分钟。
此步骤对于去除样本中非特异性结合的二抗至关重要。 - 在 1× PBT 溶液中加入 1 mg/mL 的 4',6'-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液，稀释至 1:10,000，孵育 30 分钟。DAPI 是一种 DNA 染料，可结合 DNA 的 AT 区域，用于显示脑组织的整体形态。
- 用 1× PBS 溶液冲洗 3 次。
- 将样本转移至解剖皿中，使用镊子在解剖皿中将脑组织与身体分离。
- 完成染色和洗涤步骤后，将脑组织夹在两片盖玻片之间封片，并将盖玻片置于载片上。通过这种方式，可轻松翻转样本，使脑组织的两侧均能以相似的信号强度成像。
注意：将脑组织封片于盖玻片之间而非直接置于载片上，可自由翻转样本方向。封片过程将在下文详细说明。- 将一片 18 × 18 mm 的盖玻片置于载片上。用刀片扩大移液枪头的开口，用于将脑组织连同 1× PBS 溶液转移至 18 × 18 mm 的盖玻片上。
- 将脑组织置于盖玻片中央，用细移液枪头吸除脑组织周围的液体，然后在脑组织上方加入 20 - 40 µL 抗荧光淬灭封片剂（含 0.2% (w/v) 没食子酸丙酯的 99.5% ACS 级甘油）。
注意：所加封片剂的体积取决于待检测脑组织的数量。 - 在向外推动黏稠封片剂的同时，轻柔地将脑组织摊开。将第二片 18 × 18 mm 的盖玻片覆盖在脑组织上，先从一侧缓慢放下，使其接触封片表面，再缓慢放下另一侧，以尽量减少脑组织与气泡的接触。
注意：两片盖玻片之间无需使用间隔垫片，因为封片剂和脑组织的体积已足以形成适当间隙，使两片盖玻片分离。 - 让载片静置沉降。用实验室纸巾吸除从盖玻片边缘溢出的多余液体。
- 为防止运输过程中带有封片脑组织的盖玻片从载片上脱落，可用一小段胶带将盖玻片固定在载片上。
注意：夹在盖玻片之间的脑组织可立即成像，或在 4 °C 保存长达一周，期间荧光信号无明显损失，且无需使用任何封片剂密封。如需长期保存染色脑组织，可用指甲油密封盖玻片边缘并存于 -20 °C 冰箱，但染色脑组织的信号可能随时间减弱。此方法不推荐使用。
- 使用合适的复合荧光显微镜或共聚焦显微镜对脑组织进行成像。
- 首先获取靠近物镜一侧脑组织的图像，然后小心翻转盖玻片，使样本位于中间夹层。此步骤有助于获取同一脑组织另一侧的图像。
- 使用正置复合荧光显微镜配合 20× 物镜对全脑进行成像（示例见图 2），使用 40× 物镜对脑组织较小区域进行成像，例如成对前内侧（Paired Anterior Medial, PAM）簇区域的多巴胺能神经元（示例见图 3）。
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结果
图1展示了上述成年果蝇脑组织解剖的主要步骤。图2和图3为3日龄野生型（基因型：w1118）成年果蝇脑组织的代表性图像，样品经酪氨酸羟化酶（TH）抗体染色（在图2中显示为红色，在图3中显示为白色）；TH是常用于标记多巴胺能神经元的标志物11。此外，还使用DNA染料DAPI标记所有细胞核，以及Elav蛋白抗体（绿色显示）标记果蝇中所有已分化的神经元，以上染色共同揭示了脑组织的整体结构。
对于图2和图3中的初级抗体，我们使用了1:200稀释的兔抗TH抗体和1:100稀释的大鼠抗Elav抗体，抗体用含5%正常山羊血清的1×PBT配制，以阻断非特异性结合。对于二抗，我...
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讨论
随着人们对利用成年Drosophila（果蝇）大脑研究人类脑疾病、神经环路及高级脑功能的兴趣日益增加，有必要开发简单快速的方法以获取完整的果蝇大脑用于整体装片分析，这对于大规模基于大脑的筛选尤为重要。本方法提供了一种简单且易于掌握的技术，可用于解剖果蝇头部（通常在有经验的情况下不到10秒 即可完成），获得形态保持良好且大部分附属组织已被清除的样本。由于解剖后的大脑仍附着在果蝇身体其余部分上，通常能迅速沉降至样品管底部，在洗涤和染色步骤中易于识别和收集。这显著减少了因样本物理尺寸微小而在处理过程中可能出现的样本丢失问题，该问题在大规模研究中尤为突出。在完成染色过程后、封片前，大脑可轻松从身体分离。
在解剖过程中，正确固定果蝇体位、去除头部外骨骼时保持适当角度，并在每一步操作中轻柔施加适当力度至关重要。建议将镊子相互垂直放置，以防止果蝇头部被切断图1B）。如代表性图像所示 图2，采用本方案制备的脑组织可获得满意的结果。在本示例中，我们重点关注成年果蝇脑中PAM簇的多巴胺能神经元。A ...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Enes Mehmet 先生、Kiara Andrade 女士、Pilar Rodriguez 女士、Chris Kwok 和 Danna Ghafir 女士对本项目的大力支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| w*； parkΔ21/TM3， P{GAL4-Kr.C}DC2， P{UAS-GFP.S65T}DC10， Sb1 | 布卢明顿果蝇品系中心 | 51652 | 平衡染色体已更换为 TM6B |
| PBac{WH}parkf01950 | 哈佛医学院 Exelixis 公司 | f01950 | 平衡染色体已更换为 TM6C |
| NaCl | 费舍尔科技公司 | S640-500 | |
| 碳酸氢钠 (NaHCO3) | 费舍尔科技公司 | 02-003-990 | |
| 氯化钾 (KCl) | 费舍尔科技公司 | BP366-500 | |
| 磷酸二氢钠一水合物 (NaHCO3) | 费舍尔科技公司 | 02-004-198 | |
| 氯化镁 (MgCl2) | 费舍尔科技公司 | 02-003-265 | |
| D-山梨醇 | Sigma-Aldrich 公司 | S1876-500G | 用于替代葡萄糖 |
| 二水合氯化钙 (CaCl2) | Sigma-Aldrich 公司 | C5670-500G | |
| EMD Millipore Durapore PVDF 膜滤器：亲水性：0.22 µm 孔径 | 费舍尔科技公司 | GVWP14250 | |
| 10% 甲醛溶液（组织学用） | 费舍尔科技公司 | SF98-20 | |
| 磷酸氢二钾粉末，超纯生物试剂 | 费舍尔科技公司 | 02-003-823 | |
| Tween-20 | 费舍尔科技公司 | BP337-500 | |
| Excelta 精密镊子，超细尖端 | 费舍尔科技公司 | 17-456-055 | 本实验方案不要求使用超细尖端。 |
| 抗酪氨酸羟化酶抗体 | Pel-Freez 生物制品公司 | P40101 | |
| 大鼠抗-elav 单克隆抗体 7E8A10 | 发育研究杂交瘤库 | 克隆号 7E8A10 | |
| 山羊抗大鼠 IgG (H+L) 二抗，Alexa Fluor 647 标记 | 赛默飞世尔科技公司 | A-21247 | |
| 山羊抗兔 IgG (H+L) 二抗，Alexa Fluor 594 标记 | 赛默飞世尔科技公司 | A-11037 | |
| DAPI 溶液 (1 mg/mL) | 赛默飞世尔科技公司 | 62248 | |
| 没食子酸丙酯粉末 | Sigma-Aldrich 公司 | P3130-100G | |
| 甘油 ACS 级试剂，≥99.5% | Sigma-Aldrich 公司 | G7893-500ML | |
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