使用硝酸纤维素结合实验定量细菌组氨酸激酶自磷酸化

摘要

我们报道并演示了一种优化的硝酸纤维素结合实验方法，可用于定量纯化的细菌组氨酸激酶的自磷酸化水平。与传统的基于SDS-PAGE的技术相比，该方法具有多项优势，为表征这些重要蛋白质提供了有价值的替代方案。

摘要

我们展示了一种用于定量纯化细菌组氨酸激酶自磷酸化水平的有效方法。组氨酸激酶因其在双组分信号转导中的作用而广为人知，这是一种普遍存在的系统，细菌借此感知并响应环境刺激。双组分信号转导过程包括组氨酸激酶的自磷酸化，随后将磷酸基团转移至反应调节蛋白的接收结构域，最终引发输出响应。组氨酸激酶的自磷酸化可响应相应环境刺激的存在，从而赋予细菌检测和响应环境变化的能力。尽管组氨酸激酶在细菌生物学中具有重要意义，但由于磷酸组氨酸本身固有的不稳定性，这类激酶仍缺乏充分研究。研究这些蛋白的传统方法（如SDS-PAGE放射自显影）存在明显局限性。我们开发了一种硝酸纤维素结合实验方法，可用于表征组氨酸激酶。该实验方案操作简单、易于实施。与SDS-PAGE放射自显影相比，我们的方法通量更高、耗时更短，并具有更宽的动态范围。

引言

适应性反应对细菌的生存至关重要。为了检测并响应环境变化，细菌采用一种称为双组分信号转导的刺激-反应系统^1,2。在典型的双组分系统中，组氨酸激酶识别相应的刺激信号，对其保守的组氨酸残基进行自磷酸化，随后将磷酸基团转移至反应调节蛋白的接收结构域上保守的天冬氨酸残基³。这一事件会触发反应调节蛋白活性的改变，从而启动下游效应^4,5。因此，细菌能够感知并适应局部环境的变化。某些双组分信号系统偏离了这一典型模式。在某些情况下，组氨酸激酶的感受结构域是一个独立存在的蛋白质，它可直接感知输入信号，并通过蛋白质-蛋白质相互作用调节激酶活性^6-8。然而，该系统的基本过程及其总体功能保持不变。双组分信号转导是一种普遍存在的刺激-反应系统，对细菌的生存至关重要，而组氨酸激酶在信号转导过程中发挥着关键作用⁹。

尽管组氨酸激酶在细菌生物学中具有重要意义，但其特性仍不明确。这主要是由于磷酸组氨酸本身不稳定，且缺乏一种可用于检测自磷酸化的实用方法。磷酸组氨酸比磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸和磷酸酪氨酸更不稳定¹⁰。因此，常用于分析丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶的技术并不适用于组氨酸激酶¹¹。体外研究组氨酸激酶的方法在很大程度上局限于SDS-PAGE放射自显影技术^12,13。该方法将[γ....

方案

注意：本实验方案要求操作人员具备放射性物质使用和操作的适当培训。进行本检测时，请务必使用必要的个人防护装备，包括β射线屏蔽装置。实验洗涤阶段会产生大量放射性废物，必须谨慎处理。确保将废物储存于直立容器中（如大桶或大瓶），以防容器被轻易碰倒或溢出。实验结束后，应小心地将所有液体废物转移至贴有适当标签的放射性废物容器中。操作所有材料时均需谨慎，并在附近放置盖革计数器，以监测工作区域是否受到污染。

注意：本实验方案是我们课题组先前报道的一种检测方法的修订版本¹⁵。在使用本方法前，应对任何尚未表征的组氨酸激酶检测其磷酸化组氨酸在 H₃PO₄ 中的稳定性。磷酸化组氨酸稳定性检测方法此前已有描述¹⁵。必须设置不含激酶的阴性对照，以扣除各样本的背景信号，并确保[γ-³²P]-ATP 已被充分洗脱出膜。

1. 试剂与材料的准备

1. 在使用本检测方法之前，需从细菌培养物中纯化组氨酸激酶。
   1. 纯化组氨酸激酶（基因ID 1189383） 副溶血性弧菌 （EB101，ATCC 17802）用于本检测方法的开发。使用 NdeI 和 XhoI 限制性酶切位点将激酶克隆至表达载体 pET-23aHis-TEV 中，并进行定点突变以获得突变体构建体 Vp1876 D499A。
   2. 将质粒转化至 E. coli BL21 (DE3) ....

结果

生成了一组代表性数据，包括使用磷屏成像仪捕获的图像（图1）、硝酸纤维素膜的Ponceau S染色结果（图2）以及闪烁计数数据（图3）。图3A展示了以Lineweaver-Burk作图法表示的酶动力学常数。这些结果是使用一种来自革兰氏阴性菌Vibrio parahaemolyticus的纯化组氨酸激酶（基因编号 1189383）获得的。该激酶的纯化方案见第1.1节。反应中激酶的终浓度为7.5 µM，ATP的终浓度范围为0 µM至1.28 mM。[γ-³²P]-ATP溶液的比活性为171.97 CPM/pmol ATP。采用本研究所描述的方法，可在一天内完成全部数据的采集。

讨论

我们所描述的硝酸纤维素结合实验在表征组氨酸激酶方面相较于先前使用的方法具有诸多优势。与传统的基于SDS/PAGE的放射自显影技术相比，本方法通量更高且更节省时间。硝酸纤维素膜比SDS凝胶更易于操作，且无需固定步骤。通过丽春红染色可使硝酸纤维素膜上的蛋白质点可见，从而便于准确切割各个蛋白点进行液体闪烁计数，并确认所有蛋白点的上样量一致。对每个蛋白点进行液体闪烁计数可获得精确的结果，结合图3B所示标准曲线的斜率，可轻松将结果转换为反应速率。

尽管将硝酸纤维素膜暴露于存储磷屏会延长实验的总时长，但该步骤有助于评估转膜是否成功。闪烁计数数据中出现的任何差异，均可能通过相应的磷屏图像得到解释。例如，如果膜未充分洗涤，磷屏图像将揭示这一情况。建议所有计划使用该检测方法的研究人员进行膜的荧光放射自显影，因为此步骤的结果可提供有价值的补充信息。

该检测方法的另一个显著优势在于能够通过闪烁计数获得数据。与通常基于聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）的检测方法中使用图像处理软件来定量条带强度不同，将每个单独的斑点剪下进.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷酸	VWR	AAAA18067-AP	用于终止反应及洗涤硝酸纤维素膜
Tris碱	RPI	T60040-5000.0	用于配制pH 8.0的激酶反应缓冲液
氯化钾	RPI	P41000-2500.0	用于激酶反应缓冲液
氯化镁	RPI	M24000-500.0	用于激酶反应缓冲液
甘油	RPI	G22020-4000.0	用于激酶反应缓冲液
5'-ATP	Promega	E6011	激酶底物
[γ-32P]-5'-ATP	Perkin Elmer	NEG002Z250UC	6,000 Ci/mmol
96孔点印迹装置	Bio-rad	1706545	用于点样反应
硝酸纤维素膜	Whatman	32-10401396-PK	用于点样反应
丽春红S	Sigma aldrich	P3504-50G	用于硝酸纤维素膜染色