我们报道并演示了一种优化的硝酸纤维素结合实验方法，可用于定量纯化的细菌组氨酸激酶的自磷酸化水平。与传统的基于SDS-PAGE的技术相比，该方法具有多项优势，为表征这些重要蛋白质提供了有价值的替代方案。
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摘要
摘要
我们展示了一种用于定量纯化细菌组氨酸激酶自磷酸化水平的有效方法。组氨酸激酶因其在双组分信号转导中的作用而广为人知，这是一种普遍存在的系统，细菌借此感知并响应环境刺激。双组分信号转导过程包括组氨酸激酶的自磷酸化，随后将磷酸基团转移至反应调节蛋白的接收结构域，最终引发输出响应。组氨酸激酶的自磷酸化可响应相应环境刺激的存在，从而赋予细菌检测和响应环境变化的能力。尽管组氨酸激酶在细菌生物学中具有重要意义，但由于磷酸组氨酸本身固有的不稳定性，这类激酶仍缺乏充分研究。研究这些蛋白的传统方法（如SDS-PAGE放射自显影）存在明显局限性。我们开发了一种硝酸纤维素结合实验方法，可用于表征组氨酸激酶。该实验方案操作简单、易于实施。与SDS-PAGE放射自显影相比，我们的方法通量更高、耗时更短，并具有更宽的动态范围。
引言
适应性反应对细菌的生存至关重要。为了检测并响应环境变化，细菌采用一种称为双组分信号转导的刺激-反应系统1,2。在典型的双组分系统中，组氨酸激酶识别相应的刺激信号，对其保守的组氨酸残基进行自磷酸化，随后将磷酸基团转移至反应调节蛋白的接收结构域上保守的天冬氨酸残基3。这一事件会触发反应调节蛋白活性的改变，从而启动下游效应4,5。因此，细菌能够感知并适应局部环境的变化。某些双组分信号系统偏离了这一典型模式。在某些情况下，组氨酸激酶的感受结构域是一个独立存在的蛋白质，它可直接感知输入信号，并通过蛋白质-蛋白质相互作用调节激酶活性6-8。然而，该系统的基本过程及其总体功能保持不变。双组分信号转导是一种普遍存在的刺激-反应系统，对细菌的生存至关重要，而组氨酸激酶在信号转导过程中发挥着关键作用9。
尽管组氨酸激酶在细菌生物学中具有重要意义，但其特性仍不明确。这主要是由于磷酸组氨酸本身不稳定，且缺乏一种可用于检测自磷酸化的实用方法。磷酸组氨酸比磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸和磷酸酪氨酸更不稳定10。因此，常用于分析丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶的技术并不适用于组氨酸激酶11。体外研究组氨酸激酶的方法在很大程度上局限于SDS-PAGE放射自显影技术12,13。该方法将[γ-32P]-ATP与激酶共同孵育，然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离，并对凝胶进行放射自显影以分析激酶的磷酸化情况。该方法可用于监测激酶的自磷酸化，以及激酶向反应调节蛋白的磷酸转移。然而，该方法存在明显缺陷。基于PAGE的检测通量低且耗时。这些局限性不利于对蛋白质进行表征及其动力学参数的确定。最近发表的一种研究组氨酸激酶的替代方法利用磷酸组氨酸抗体来检测自磷酸化14。尽管该方法可根据所用检测仪器区分1-磷酸组氨酸和3-磷酸组氨酸，但其检测动态范围可能较小，检测上限也可能较低。因此，亟需一种更快捷、更省力且更灵敏的检测方法，用于研究这些重要的蛋白质。
此处，我们描述并演示了一种精心设计的硝酸纤维素结合实验方法，可用于定量检测纯化的细菌组氨酸激酶的自磷酸化水平 体外该检测方法比基于聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）的检测具有更高的通量且更省时。该方法利用切伦科夫辐射进行磷酸化组氨酸的定量，具有较高的检测上限和宽广的动态范围。该检测可用于测定组氨酸激酶的动力学参数。
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方案
注意：本实验方案要求操作人员具备放射性物质使用和操作的适当培训。进行本检测时，请务必使用必要的个人防护装备，包括β射线屏蔽装置。实验洗涤阶段会产生大量放射性废物，必须谨慎处理。确保将废物储存于直立容器中（如大桶或大瓶），以防容器被轻易碰倒或溢出。实验结束后，应小心地将所有液体废物转移至贴有适当标签的放射性废物容器中。操作所有材料时均需谨慎，并在附近放置盖革计数器，以监测工作区域是否受到污染。
注意：本实验方案是我们课题组先前报道的一种检测方法的修订版本15。在使用本方法前，应对任何尚未表征的组氨酸激酶检测其磷酸化组氨酸在 H3PO4 中的稳定性。磷酸化组氨酸稳定性检测方法此前已有描述15。必须设置不含激酶的阴性对照，以扣除各样本的背景信号，并确保[γ-32P]-ATP 已被充分洗脱出膜。
1. 试剂与材料的准备
- 在使用本检测方法之前，需从细菌培养物中纯化组氨酸激酶。
- 纯化组氨酸激酶（基因ID 1189383） 副溶血性弧菌 （EB101，ATCC 17802）用于本检测方法的开发。使用 NdeI 和 XhoI 限制性酶切位点将激酶克隆至表达载体 pET-23aHis-TEV 中，并进行定点突变以获得突变体构建体 Vp1876 D499A。
- 将质粒转化至 E. coli BL21 (DE3) pLysS，并在TB培养基中于37 °C培养细胞。在培养体系中添加氨苄青霉素（100 µg/mL）和氯霉素（34 µg/mL），并在振荡条件下（250 rpm）培养至OD600 0.6
- 用IPTG诱导蛋白表达，终浓度为25 µM，于16 °C过夜培养。离心收集细胞（5,000 x g），超声破碎细胞，再次离心去除细胞碎片（18,000 x g）。
- 使用 Ni-NTA 琼脂糖纯化 His 标签激酶。通过 SDS-PAGE 确认纯度。针对每种蛋白优化纯化条件，并在使用本检测前确认其纯度。
- 制备 25 mM H3PO4 洗涤液。向 1 L 去离子蒸馏水中加入 H3PO4 至终浓度为 25 mM。该溶液的 pH 值约为 2.0。将 25 mM H3PO4 置于冰上。
- 配制13倍浓缩的325 mM H3PO4，用于终止激酶反应。该溶液的pH值约为1.5。将325 mM H3PO4 置于冰上。
注意：H3PO4 在终浓度为25 mM时，可充分淬灭反应，同时有助于阻止未结合至组氨酸的放射性标记磷酸盐与硝酸纤维素膜结合。 - 配制4×反应缓冲液储备液，含160 mM Tris-HCl（pH 8.0）、600 mM KCl、16 mM MgCl₂2，以及40%甘油。
- 通过已建立的蛋白质浓度测定方法（Bradford法、紫外-可见光谱法）定量组氨酸激酶浓度 等。).16,17 配制浓度为所需终浓度4倍的组氨酸激酶溶液。为获得足够的信号，反应体系中蛋白质的终浓度最好至少为5 µM。
- 制备4x放射性标记的[γ-32将[P]-ATP溶液与适当浓度的4倍未标记ATP混合，配制成实验所需的标记ATP与未标记ATP比例。
注意：[γ-32P]-ATP 的用量应根据 [γ-32每个反应最终都将点样[P]-ATP。我们发现每反应终浓度在0.1 - 5 µCi范围内可获得足够的信号。在同一次实验中，所有反应的标记ATP与未标记ATP比例必须保持恒定。当需要多个ATP浓度时，应通过连续稀释法配制，以确保所有浓度下的标记ATP与未标记ATP比例保持一致。ATP终浓度通常范围为10 µM至至少1 mM，每个浓度应设三个重复，以获得可靠的动力学数据。 - 96孔点印迹装置
- 裁剪一块 8 cm × 12 cm 的硝酸纤维素膜（孔径 0.2 µm）。
- 将硝酸纤维素膜置于点印迹装置中，确保膜的位置使装置密封，且所有孔均被膜完全覆盖。若组装正确，施加真空时应无空气泄漏。
- 为收集滤液，将装置连接至一个辅助侧管烧瓶。从阀门 stem 处连接足够长度的 tubing，确保装置使用时不会使辅助烧瓶倾倒。
- 将侧臂烧瓶的次级端连接至抽吸器/真空源。
- 通过向装置施加真空来测试其是否完全密封。如果装置组装正确，所有孔中均会产生较强的真空。所有管路连接处可用帕拉膜（Parafilm）或保鲜膜包裹，以确保密封紧密。
- 可选：为检测真空度，向一个孔中加入100 µL反应缓冲液。真空应足够强，以将所有液体抽过孔并转移至膜上。
- 关闭真空，直到所有样品均准备好点样至膜上。
2. 反应启动与终止
- 反应组分的混合
- 在启动反应前，将所有四种反应组分分别配制成4倍浓度的储备液：反应缓冲液（见第1.4节）、组氨酸激酶（1.5）、[γ-32P]-ATP（1.6）和ddH2O。
- 取等体积的反应缓冲液、组氨酸激酶和ddH2O混合。将这些反应组分在室温下短暂平衡一段时间（10分钟）。
注：最终反应体积取决于实验是时间依赖性、酶依赖性还是底物依赖性的。时间依赖性反应需要较大的体积，因为需从同一反应体系中多次取样，并在预定时间点终止反应。反应体积取决于所需的时间点数量。本检测方法优化后，每点硝酸纤维素膜上的反应液体积为30 µL。因此，若需检测10个时间点，则反应总体积至少应为300 µL（为避免移液误差，建议使用稍大体积，如330 µL）。酶依赖性和底物依赖性实验所需的反应体积较小，可低至30 µL，因为该体积即为最终点样至硝酸纤维素膜上的体积。 - 通过加入一体积的[γ-32P]-ATP溶液启动反应，并用移液器反复吹打混匀。使用计时器记录反应进行时间，使反应持续至所需时长。
- 为终止反应，向反应体系中加入总体积1/13的预冷至冰浴温度的325 mM H3PO4，并通过移液器反复吹打混匀。或者，也可将一份反应液加入至325 mM H3PO4中。
注：H3PO4的终浓度应为25 mM，以充分终止反应。例如，向30 µL反应体系中加入2.5 µL 325 mM H3PO4，或向2.5 µL 325 mM H3PO4中加入30 µL反应液。反应终止后的pH值约为4.0。该浓度的H3PO4已在本缓冲体系中验证可有效终止激酶反应，且不会降解磷酸化组氨酸。- 例如，混合7.5 µL 4倍浓度反应缓冲液、7.5 µL 4倍浓度组氨酸激酶和7.5 µL ddH2O。加入7.5 µL [γ-32P]-ATP启动反应，并加入2.5 µL 325 mM H3PO4终止反应。
- 立即将终止后的反应液置于冰上，直至所有反应均被终止。
注：为提高效率，建议每隔15或20秒启动一个反应，直至所有反应均开始；待达到预定反应时间后，再每隔15或20秒终止一个反应，直至全部完成。对于首次使用该检测方法的操作者，可采用更长的时间间隔以便操作。
3. 将淬灭反应产物点样到硝酸纤维素膜上
- 启动96孔点印迹装置的真空
- 将预组装的96孔点印迹装置（第1.7节）放入一个次级容器中。该容器应足够大，以便在其中轻松拆卸装置，因为使用后的装置和膜具有放射性。
- 对96孔点印迹装置施加真空。
- 当装置处于真空状态时，小心地将淬灭后的反应液直接用移液器加到每个孔中的硝酸纤维素膜上。重复此操作，直到所有反应液均已被加载至膜上。由于硝酸纤维素膜的结合能力（75 - 110 µg/cm2）大于所点样的组氨酸激酶的量，因此可认为只要正确加载，几乎所有激酶都会结合到膜上。
注意：根据所用装置的不同，需小心避免刺穿硝酸纤维素膜。应观察确认所有反应液均已接触到硝酸纤维素膜。部分或全部反应液容易粘附在孔壁上而未能到达膜表面。 - 用100 µL冰浴的25 mM H3PO4洗涤各孔。此步骤可使可能滞留在孔中的反应液体积充分接触膜，确保所有反应完全加载。让全部液体通过膜。
- 装置拆卸与硝酸纤维素膜转移
- 在关闭真空之前，小心地拆卸装置。请注意，此时装置和硝酸纤维素膜均具有放射性。此时切勿将任何装置组件从次级容器中取出。
- 使用镊子小心地将硝酸纤维素膜从装置转移至含有约200 mL冰浴的25 mM H3PO4的容器中。为该容器盖上盖子，因为洗涤液具有放射性。此时可以关闭真空。
4. 硝酸纤维素处理
- 硝酸纤维素膜洗涤
- 将装有洗涤膜的容器置于摇床上，使膜轻轻摇动 20 分钟。
- 20 分钟后，小心地将用过的洗涤液倾倒至大桶中，用于临时废液储存。向膜中加入 200 mL 冰冷的 25 mM H3PO4，重复上述步骤。
注意：至少需要进行三次 20 分钟的洗涤，以去除膜上的背景 [γ-32P]-ATP 信号。第三次洗涤后，使用盖革计数器检测废液中的放射性。按照上述方法继续洗涤膜，直至洗涤液中无信号为止。
- 硝酸纤维素膜干燥
- 膜充分洗涤后，使其短暂空气干燥。通常需要 5 分钟或更短时间。
5. 暴露于存储磷屏
注意：本步骤为可选步骤。将膜暴露于磷屏具有优势，可实现对膜上各点中放射性标记激酶强度的可视化。这些点的相对强度与各点中磷酸化组氨酸激酶的量成正比。可使用图像处理软件对强度进行定量，并将这些结果与第7部分获得的结果进行比较。此外，此步骤可用于质量控制。在此扫描中观察到的异常可能解释液体闪烁计数中获得的不规则结果。
- 磷屏制备
- 在将膜暴露于存储磷屏之前，先将磷屏暴露于白光下至少 5 分钟，以确保擦除磷屏上可能存在的任何残留图像。
- 确保磷屏清洁且干燥。如有必要，使用磷屏制造商认可的磷屏清洁液轻轻擦拭，并用布擦干。
- 硝酸纤维素膜制备
- 小心地将干燥的硝酸纤维素膜用一层薄塑料膜包裹，以防止残留湿气损坏磷屏。确保膜表面无皱褶或气泡。
- 与磷屏接触曝光
- 将包裹好的硝酸纤维素膜放入存储磷屏暗盒中，将磷屏面向下放置于膜上，并关闭暗盒。在准备扫描磷屏之前，不得打开暗盒或移动膜，因为在曝光过程中若膜发生位移，会导致成像出现重影或模糊。
- 曝光至少 4 小时，或按照磷屏制造商建议的时间进行曝光。
- 曝光完成后，使用磷屏成像仪扫描磷屏并获取图像。
6. 准备硝酸纤维素膜以进行闪烁计数
- 丽春红S染色与脱色
- 将硝酸纤维素膜短暂浸入丽春红S染色液（0.1% 丽春红S (w/v) 溶于5%乙酸）中1–2分钟。在脱色前需确保染色液完全润湿整张膜。
- 倾去膜上多余的丽春红S染色液。
- 用ddH2O冲洗膜，直至仅组氨酸激酶所在的位置保留染色斑点。注意：此步骤仅在所有斑点均含有可检测量的蛋白质时有效。
注：此步骤用于确认激酶已结合至硝酸纤维素膜，并验证各斑点间蛋白上样量均匀一致。此外，该步骤也有助于将点样的激酶斑点从膜上准确切割下来。
- 切割斑点
- 使用剪刀将硝酸纤维素膜上的每个斑点逐一剪下。无需精确沿染色斑点边缘切割；若膜已充分洗涤，则因剪取斑点大小差异导致的背景差异可忽略不计。关键在于确保每个反应的完整斑点均被剪下。
- 使用镊子小心地将每个斑点转移至闪烁计数瓶中。由于32P可通过切伦科夫辐射直接检测，因此无需添加闪烁液。
注：也可使用经磨锐的打孔器切割斑点。用打孔器将各斑点从硝酸纤维素膜上取出后，用细针将其推入闪烁计数瓶中。此方法可避免直接接触膜，进一步减少辐射暴露。
- 测定[γ-32P]-ATP溶液的CPM/pmol值
- 将[γ-32P]-ATP溶液（第1.5节）的多个稀释液点样于1 cm × 1 cm的硝酸纤维素小方片上。短暂空气干燥。
- 使用镊子小心地将每块小方片转移至闪烁计数瓶中。无需添加闪烁液。这些样品将用于生成标准曲线，以确定ATP溶液的CPM/pmol值。
7. 闪烁计数
- 将所有闪烁计数小瓶装入闪烁计数器样品架中，再将样品架装入闪烁计数器。
- 运行闪烁计数程序，测定每个小瓶的每分钟计数（CPM）。这些数据结合放射性标记ATP混合物的CPM/pmol值（来自第6.3节），可用于计算每个点中磷酸化组氨酸激酶的含量，从而确定自磷酸化的速率。18,19
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结果
生成了一组代表性数据，包括使用磷屏成像仪捕获的图像（图1）、硝酸纤维素膜的Ponceau S染色结果（图2）以及闪烁计数数据（图3）。图3A展示了以Lineweaver-Burk作图法表示的酶动力学常数。这些结果是使用一种来自革兰氏阴性菌Vibrio parahaemolyticus的纯化组氨酸激酶（基因编号 1189383）获得的。该激酶的纯化方案见第1.1节。反应中激酶的终浓度为7.5 µM，ATP的终浓度范围为0 µM至1.28 mM。[γ-32P]-ATP溶液的比活性为171.97 CPM/pmol ATP。采用本研究所描述的方法，可在一天内完成全部数据的采集。
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讨论
我们所描述的硝酸纤维素结合实验在表征组氨酸激酶方面相较于先前使用的方法具有诸多优势。与传统的基于SDS/PAGE的放射自显影技术相比，本方法通量更高且更节省时间。硝酸纤维素膜比SDS凝胶更易于操作，且无需固定步骤。通过丽春红染色可使硝酸纤维素膜上的蛋白质点可见，从而便于准确切割各个蛋白点进行液体闪烁计数，并确认所有蛋白点的上样量一致。对每个蛋白点进行液体闪烁计数可获得精确的结果，结合图3B所示标准曲线的斜率，可轻松将结果转换为反应速率。
尽管将硝酸纤维素膜暴露于存储磷屏会延长实验的总时长，但该步骤有助于评估转膜是否成功。闪烁计数数据中出现的任何差异，均可能通过相应的磷屏图像得到解释。例如，如果膜未充分洗涤，磷屏图像将揭示这一情况。建议所有计划使用该检测方法的研究人员进行膜的荧光放射自显影，因为此步骤的结果可提供有价值的补充信息。
该检测方法的另一个显著优势在于能够通过闪烁计数获得数据。与通常基于聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）的检测方法中使用图像处理软件来定量条带强度不同，将每个单独的斑点剪下进...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由教育部通过国家急需领域研究生资助计划（P200A100044）提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 磷酸 | VWR | AAAA18067-AP | 用于终止反应及洗涤硝酸纤维素膜 |
| Tris碱 | RPI | T60040-5000.0 | 用于配制pH 8.0的激酶反应缓冲液 |
| 氯化钾 | RPI | P41000-2500.0 | 用于激酶反应缓冲液 |
| 氯化镁 | RPI | M24000-500.0 | 用于激酶反应缓冲液 |
| 甘油 | RPI | G22020-4000.0 | 用于激酶反应缓冲液 |
| 5'-ATP | Promega | E6011 | 激酶底物 |
| [γ-32P]-5'-ATP | Perkin Elmer | NEG002Z250UC | 6,000 Ci/mmol |
| 96孔点印迹装置 | Bio-rad | 1706545 | 用于点样反应 |
| 硝酸纤维素膜 | Whatman | 32-10401396-PK | 用于点样反应 |
| 丽春红S | Sigma aldrich | P3504-50G | 用于硝酸纤维素膜染色 |
参考文献
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