野生型阻断PCR联合直接测序作为一种高灵敏度检测低频体细胞突变的方法

摘要

野生型阻断PCR结合直接测序法是一种高灵敏度的检测方法，可用于多种样本类型中低频体细胞突变的检测。

摘要

在评估治疗后残留病灶、治疗期间筛查新出现的耐药突变，或患者循环肿瘤细胞数量较少的情况下，准确检测和鉴定低频突变可能具有挑战性。野生型阻断PCR联合测序分析作为一种检测低频突变的方法，具有高灵敏度、灵活性和操作简便的优势。通过在新建立或已有的常规基于PCR的测序检测中加入定制设计的锁核酸（LNA）寡核苷酸，可实现约每1,000个野生型等位基因背景中检出1个突变等位基因的灵敏度（1:1,000）。在提取过程中使用尿嘧啶DNA糖基化酶，可在一定程度上缓解福尔马林固定石蜡包埋组织中常见的脱氨事件所导致的测序假象。本文优化的实验方案专用于检测MYD88突变，但也可作为设计任何野生型阻断PCR（WTB-PCR）检测的模板。相较于等位基因特异性PCR和实时定量PCR等其他常用于低频突变检测的方法，WTB-PCR检测具有更少的假阳性结果、更高的灵活性和更简便的操作性，并且能够同时检测已知和未知的突变。

引言

Sanger 测序传统上一直是检测已知和未知体细胞突变的金标准。Sanger 测序的一个局限性在于其检测下限（在野生型背景下约 10 - 20% 的突变等位基因）¹。这一灵敏度水平不适合检测前恶性组织样本、循环肿瘤细胞较少的患者样本，或骨髓（BM）分布不均时存在的低水平体细胞突变。这也使得仅通过传统测序方法难以评估治疗后的残留病灶，或在治疗过程中检测新出现的耐药突变²。在 Sanger 测序中，若以锁核酸（LNA）介导的野生型阻断 PCR（WTB-PCR）替代传统 PCR，可将检测灵敏度提高至在野生型背景下低至 0.1% 的突变等位基因^2,3,4。在 WTB-PCR 中，通过加入一段短的（约 10 - 14 nt）阻断型（LNA）寡核苷酸，优先结合野生型 DNA，从而抑制野生型 DNA 的扩增，实现对突变等位基因的富集。随后可对富集突变的 WTB-PCR 产物进行测序。由于 WTB-PCR 是通过阻断野生型 DNA 而非特异性选择特定突变，因此能够富集存在于极小细胞比例中的已知和未知突变。

目前有多种方法用于检测小细胞群体中的突变，包括等位基因特异性PCR、扩增阻滞突变系统（ARMS）、变性高效液相色谱法（DHPLC）、微珠-乳液-扩增-磁性法（BEAMing）、电场诱导释放与检测技术（EFIRM）、高分辨率熔解曲线分析及其他方法。然而，这些方法大多存在假阳性问题，且只能检测实验设计所针对的单一突变⁴。相比之下，WTB-PCR 允许用户直接观察测序峰图，从而能够识别多种类型的突变，并有助于排除因实验假象或脱氨事件导致的假阳性结果。下一代测序（NGS）可能作为传统测序的一种可行替代方案，但其较高的成本、复杂性以及较长的检测周期，使其在分子标志物较少的疾病类型中，或在监测治疗过程中出现耐药突变的患者时显得不必要。此外，在检测突变等位基因频率低于5%的变异时，基于扩增子的NGS可能出现较高的假阳性率^5,6。

本文展示了WTB-PCR在筛查髓样分化因子88基因（MYD88）突变时所实现的灵敏度提升，该方法由Albitar et al.³描述。MYD88突变在华氏巨球蛋白血症（Waldenström's Macroglobulinemia, WM）、意义未明的IgM单克隆丙种球蛋白病（IgM-MGUS）、脾边缘区淋巴瘤（SMZL）以及弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）中具有重要的诊断和预后意义。几乎所有的WM病例以及约50%的分泌免疫球蛋白M（IgM）的MGUS患者中均可检测到MYD88突变。相比之下，仅在0–6%的SMZL患者中发现MYD88突变，而在多发性骨髓瘤中则未见报道^7,8。由于WM与SMZL或IgM型多发性骨髓瘤在形态学、免疫表型、细胞遗传学及临床特征方面存在重叠，常导致鉴别诊断困难，因此MYD88突变的存在可作为一项有用的鉴别指标⁹。此外，MYD88突变还与DLBCL患者更高的肿瘤负荷以及治疗后总体生存率较差相关^7,10。另外，由于MYD88突变更常见于活化B细胞样（ABC）型DLBCL，而较少见于生发中心B细胞样（GCB）型DLBCL或原发性纵隔B细胞淋巴瘤（PMBL），因此MYD88突变状态可作为ABC亚型的替代标志物^11,12。

本文提供的详细实验方案可作为模板，用于开发新的检测方法，或轻松改造大多数现有的测序检测方法，以准确检测各类样本中低频突变。该方法还可用于监测和检测肿瘤甚至细菌在患者接受靶向治疗或抗生素治疗过程中可能产生的耐药突变。此外，该方法解决了与突变富集相关联的诸多问题，特别是在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织中的应用。

方案

伦理声明：所有人体样本的检测均在获得机构审查委员会（IRB）批准后进行。

1. 从福尔马林固定石蜡包埋组织、外周血和骨髓穿刺液中提取DNA

1. 对于骨髓FFPE组织使用DNA FFPE提取试剂盒
   1. 从未经染色的切片开始（5–10张切片，厚度为5–10 µm）。
      注意：若起始材料为组织碎屑，则使用3–6张切片（厚度为5–10 µm），并直接跳至步骤1.1.6。
   2. 将切片放入切片篮中，并准备四个洗涤槽（两个用于二甲苯，两个用于100%乙醇）。每个篮中加入至少600 mL溶液。
   3. 在第一个托盘中用二甲苯洗涤5分钟以脱蜡。将切片转移至第二个二甲苯洗涤槽中，再洗涤5分钟。
   4. 脱蜡后，用100%乙醇洗涤切片5分钟。再将切片转移至第二个乙醇洗涤槽中，继续洗涤5分钟。
   5. 在通风橱下使切片完全干燥，然后用刀片刮下组织并转移至微量离心管中。
      注意：若有标注肿瘤区域的H&E染色切片，可对齐切片并仅刮取肿瘤区域。
   6. 按照试剂盒中所附制造商说明书的指导继续操作。
2. 对于骨髓穿刺液及外周血
   1. 根据试剂盒说明书中的以下具体参数进行DNA提取。
      注意：目前市面上有多种可用于FFPE组织和细胞DNA提取的试剂盒和方法。实际上，大多数方法均可使用。请选用实验室已建立的标准方法。
      1. 使用200 µL外周血（PB）或100 µL骨髓液加100 µL PBS。
      2. 使用4 µL RNase A储存液。
      3. 用100 µL洗脱缓冲液进行洗脱。
3. DNA定量
   1. 使用分光光度计测定DNA浓度，确保260 nm/280 nm比值约为1.8（纯DNA）。若比值明显偏低，可能提示存在蛋白质、苯酚或其他可能干扰后续实验的污染物。
   2. 用适当的洗脱缓冲液将DNA浓度调整至约50–100 ng/µL。

2. 野生型阻断PCR

1. 引物设计
   1. 根据先前描述的PCR引物设计通用指南设计并获取目标基因的引物¹³。在PCR引物中包含M13正向和反向通用测序引物。
      注：MYD88检测旨在扩增MYD88的第5外显子（G259 - N291）以及位于5'内含子区域的110个核苷酸，以覆盖剪接位点和部分内含子4。正向和反向引物在5'端设计有M13序列（M13-forward: tgt aaa acg acg gcc agt；M13-reverse: cag gaa aca gct atg acc），以便互补测序引物的退火（见材料表）。
2. 锁核酸寡核苷酸设计
   1. 设计阻断寡核苷酸，长度约为10 - 15个碱基，并与希望实现突变富集的野生型模板互补。
      注：较短的寡核苷酸可提高错配识别能力。为实现高靶标特异性，应避免使用过多的阻断核苷酸，否则可能导致寡核苷酸过于"粘滞"。阻断核苷酸的组成、长度和数量应根据需要阻断的具体核苷酸进行优化。重要的是在不破坏二级结构和避免自互补风险的前提下，实现高结合特异性。
   2. 设计阻断寡核苷酸，使其在热循环延伸温度下的T_m比延伸温度高10 - 15 °C。通过添加或去除阻断碱基，或用DNA碱基替换部分阻断碱基来调节T_m，同时避免出现较长的（3 - 4个碱基）阻断G或C碱基连续序列。
      1. 访问寡核苷酸工具网站（见材料表），选择"阻断寡核苷酸Tm预测"工具。
      2. 将希望被阻断的野生型模板序列粘贴至"寡核苷酸序列"框中。在碱基前添加"+"以表示阻断碱基。
      3. 点击"计算"按钮，以确定DNA-阻断剂杂合体的近似T_m。
   3. 设计阻断寡核苷酸时应避免形成二级结构或自二聚体。
      1. 访问寡核苷酸工具网站（见材料表），选择"阻断寡核苷酸优化器"工具。
      2. 将希望被阻断的野生型模板序列粘贴至输入框中。在碱基前添加"+"以表示阻断碱基。
      3. 选中"二级结构"和"仅自配对"两个选项，点击分析按钮，检查寡核苷酸是否存在潜在问题的二级结构或自二聚体。
         注：得分是对二级结构和自二聚体T_m的粗略估计，因此较低得分为佳，可通过限制阻断剂-阻断剂配对来实现。MYD88的阻断寡核苷酸[MYD88blocker (TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/)]设计用于覆盖氨基酸Q262-I266，并在3'端带有倒置dT，以抑制DNA聚合酶的延伸和3'-外切酶的降解。该特定阻断寡核苷酸为17聚体，包含10个阻断碱基，以"+N"表示，其余7个碱基为普通DNA核苷酸。
3. WTB-PCR设置与热循环
   1. 配制WTB-PCR主混合液（MMX），每反应使用2.5 µL 10倍PCR反应缓冲液（含20 mM MgCl₂）、250 µM dNTPs、0.2 µM正向和反向引物、1.2 µM MYD88blocker，并用无DNA酶、无RNA酶的超纯H₂O补足至终体积21.75 µL。
      注：工作浓度基于最终反应体积25 µL（加入DNA模板和聚合酶后）。常规PCR MMX只需省略阻断剂即可配制。WTB-PCR与常规PCR的所有操作步骤均相同，可用于验证并确定添加阻断剂所实现的富集效果。
      1. 计算所需MMX总量时，需额外计入3个反应（阳性对照、阴性对照和无模板对照以检测污染）以及至少1个反应以补偿移液误差。
   2. 充分涡旋混匀MMX。MMX可在-80 °C保存长达一年。
   3. 每反应加入0.25 µL Taq DNA聚合酶至MMX中，轻柔颠倒混匀。加入聚合酶后，MMX应始终置于冰上。
   4. 将新的96孔PCR板置于预冷板上，每孔加入22 µL含聚合酶的MMX。
   5. 向每孔含MMX和聚合酶的反应体系中加入3 µL基因组DNA（50 - 100 ng/µL）。
   6. 密封PCR板并短暂离心，确保溶液沉至各孔底部。
   7. 将PCR板放入热循环仪。
      1. 设定WTB-PCR反应的热循环条件如下：95 °C初始变性6分钟；40个循环，每循环包括95 °C变性30秒、56 °C引物退火30秒、72 °C延伸1分20秒；最后72 °C终延伸10分钟。
         注：最佳操作实践建议在物理上独立的区域完成后续步骤，以避免扩增子对后续实验的污染。
4. 按照先前描述的方案进行凝胶电泳¹⁴，以判断WTB-PCR是否成功，并确认无模板对照中无扩增产物。
5. 磁珠法纯化PCR产物
   1. 将磁珠从4 °C取出，恢复至室温。
   2. 将10 µL PCR产物转移至新的PCR板中。
   3. 剧烈涡旋磁珠，充分重悬磁性颗粒。
   4. 向新板的每孔中加入18 µL磁珠，用移液器吹打混匀10次。
   5. 室温孵育5分钟。
   6. 将PCR板置于侧边带磁架的磁力板上2分钟，使磁珠与溶液分离。
   7. 用多通道移液器吸除上清液，避免接触磁珠沉淀。
   8. 向每孔加入150 µL 70%乙醇，室温孵育至少30秒。用多通道移液器吸除乙醇并丢弃吸头。重复此洗涤步骤一次。
   9. 使用20 µL多通道移液器吸除每孔中残留的乙醇，并丢弃吸头。
   10. 待孔内完全干燥（约10分钟）后，从磁力板上取下PCR板，向每孔加入40 µL无核酸酶水，吹打混匀15次或轻柔涡旋。
   11. 室温孵育2分钟。
   12. 将PCR板放回磁力板上1分钟，使磁珠与溶液分离。
   13. 将35 µL纯化产物转移至新的PCR板中。此纯化后的PCR产物可直接用于双向测序，或在-20 °C保存待用。
       注：在开发新检测方法时，可能需要对纯化后的PCR产物进行定量。双向测序的最佳扩增子DNA浓度为1 - 3 ng/µL。若浓度持续偏低，可按比例（1:1.8）增加PCR产物和磁珠用量；若浓度持续偏高，可用更大体积的水进行洗脱。

3. WTB-PCR 产物的测序

1. 双向测序
   注意：以下方案是对制造商说明书的修改版本，已优化为使用更少的试剂。
   1. 配制正向和反向测序反应混合液：每份反应中加入 0.25 µL Ready Reaction 混合液、1.88 µL 测序缓冲液、1.78 µM M13-F 或 M13-R 测序引物，并加入无 DNA 酶、无 RNA 酶的超纯 H₂O，使每份反应的终体积为 9 µL。该测序反应混合液可在 -20 °C 下保存长达一年。
   2. 将 9 µL 正向测序反应混合液加入新的 96 孔 PCR 板的每个孔中，用于正向测序反应。另取一块独立的 PCR 板重复上述操作，用于反向测序反应。
   3. 向正向和反向测序板的每个孔中分别加入 1 µL 纯化的 WTB-PCR 产物。
   4. 密封反应板并短暂离心，确保溶液沉降至各孔底部。
   5. 将 PCR 板放入热循环仪中。
      1. 设置测序反应的热循环条件如下：96 °C 预变性 1 分钟；进行 30 个循环（96 °C 变性 10 秒，50 °C 退火 5 秒，60 °C 延伸 4 分钟）；最后在 4 °C 保存直至进行纯化。
2. 纯化测序产物
   1. 新鲜配制 3 M 醋酸钠（pH 5.2）与 100% 乙醇按 1:25 比例混合的溶液。
   2. 新鲜配制 70% 乙醇溶液。
   3. 向正向和反向测序板的每个孔中加入 30 µL 醋酸钠/100% 乙醇混合液，并用移液器吹打混匀 5 次。
   4. 重新密封反应板，在室温避光条件下孵育 20 分钟。
   5. 以 2,250 × g 离心 15 分钟。
   6. 移除板封膜，将反应板倒置于废液容器上方。
      注意：仅倒置一次，以免沉淀从孔底脱落。
   7. 将倒置的反应板置于干净的纸巾上，以 150 × g 离心 1 分钟。
   8. 向每个孔中加入 150 µL 70% 乙醇。
   9. 重新密封反应板，以 2,250 × g 离心 5 分钟。
   10. 重复步骤 3.2.6 和 3.2.7。
   11. 若孔内未完全干燥，可在室温下静置晾干。干燥过程中应确保样品避光。
   12. 向每个孔中加入 10 µL 甲酰胺，并用移液器吹打混匀 10 次。重新密封反应板。
   13. 在热循环仪中于 95 °C 变性 3 分钟，随后 4 °C 保持 5 分钟。
   14. 变性完成后，将板封膜更换为隔垫，按照制造商说明书在测序平台上进行测序¹⁵。

4. 测序结果分析

1. 根据制造商说明，使用测序数据分析软件可视化测序痕迹¹⁶ 并与相应的参考序列比对。将 MYD88 与 NCBI 参考序列比对 "NM_002468".

结果

扩增过程中WTB-PCR的原理概述见图1。由于阻断探针与DNA杂交体中单个核苷酸的错配会显著降低其熔解温度（ΔT_m=20 - 30 °C），野生型等位基因的扩增被抑制，而突变型模板DNA则可自由完成延伸¹⁷。通过这种方式，突变型DNA呈指数级扩增，而野生型DNA则呈线性扩增。

WTB-PCR 实现的突变富集效果如图2所示。分别采用常规PCR和WTB-PCR对携带突变和不携带突变患者的基因组DNA进行检测，随后进行测序，以展示WTB-PCR通常可达到的突变富集水平，并证明在野生型DNA中不会产生假阳性结果。WTB-PCR MMX中阻断剂的工作浓度应通过滴定实验确定，需在实现理想突变富集水平的同时，避免出现假阳性，或完全抑制野生型DNA的扩增。对WTB-PCR产物进行测序分析表明，在野生型背景中，突变等位基因的富集效果显...

讨论

本文所述的WTB-PCR检测采用一组通用引物，并设计了一条阻断寡核苷酸，用于在延伸过程中抑制野生型（WT）DNA的扩增（图1）。随后对WTB-PCR产物进行测序以开展突变分析。WTB-PCR联合Sanger测序的优势在于其操作简便、灵敏度高且通量大。根据本文所述的指导原则，大多数现有的基于Sanger测序的检测方法均可通过添加一条阻断寡核苷酸进行简单改造，从而显著提高检测灵敏度。在本示例检测中，在PCR反应中添加单条阻断寡核苷酸后，检测限由传统方法在野生型背景下的约16%突变等位基因比例显著降低至WTB-PCR检测中的>0.5%³。这一改进使临床检测中假阴性结果减少了64%³。确认MYD88基因突变的存在具有重要的诊断和预后意义；若将阳性病例错误报告为阴性，可能对整体治疗方案和患者管理造成严重后果。因此，采用WTB-PCR进行检测尤为重要，特别是在异常细胞比例相对较低的患者中。

WTB-PCR 技术存在较大差异，有时会与 LNA、BNA 或 PN...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 或 2 mL 安全锁扣微量离心管	Eppendorf	05-402-25
100% 酒精	VWR	89370-084	组织学级别；含 91.5% 乙醇、5% 异丙醇、4.5% 甲醇
3730XL 测序仪	ABI		或同等性能设备
Agencourt AMPure XP 磁珠纯化试剂	Beckman Coulter	A63881	用于磁珠法 PCR 纯化
铝制密封箔	GeneMate	T-2451-1	用于 PCR 及低温储存
BigDye Terminator v3.1 循环测序试剂盒	Life Technologies	4337455	用于双向测序，含 5× 测序缓冲液
Centrifuge 5804 系列离心机	Eppendorf		配备 A-2-DWP 转子（适用于 PCR 板）
96 孔板用冷板	Eppendorf	Z606634
无 DNA 酶、无 RNA 酶、超纯水
dNTPs（100 mM）	Invitrogen	10297-117
DynaMag-96 侧裙磁架	Thermo Fisher Scientific	12027	用于 PCR 纯化
无水乙醇	Sigma	E7023	200 proof，分子生物学级别
Exiqon 网站 Oligo Tools 工具			www.exiqon.com/oligo-tools
FastStart Taq DNA 聚合酶（5 U/µL）	Roche	12032937001	含 10× 浓缩 PCR 反应缓冲液，含 20 mM MgCl2
凝胶电泳装置			2% 琼脂糖凝胶
GeneRead DNA FFPE 提取试剂盒	Qiagen	180134	含减少测序假象所必需的尿嘧啶 DNA 糖基化酶
Hi-Di 甲酰胺	ABI	4311320	用于测序
LNA 寡核苷酸	Exiqon	500100	5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/（+N = LNA 碱基）
M13-F 测序引物	ABI		5'-tgt aaa acg acg gcc agt
M13-R 测序引物	ABI		5'-cag gaa aca gct atg acc
Mastercycler Pro S 梯度 PCR 仪	Eppendorf	E950030020
Microcentrifuge Model 5430 微型离心机	Eppendorf		配备 FA-45-30-11 转子（适用于 1.5/2 mL 微量离心管）
NanoDrop 2000 分光光度计	Thermo Fisher Scientific
PCR 正向引物	IDT		5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG
PCR 反向引物	IDT		5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA
PCR 板	GeneMate	T-3107-1
移液器			20、200、1,000 µL
96 孔板用密封垫	ABI	4315933
QIAamp DNA Mini 试剂盒	Qiagen	51304	用于骨髓穿刺液和外周血
SeqScape 软件 v3.0	ABI	4474978	用于测序分析
切片篮
乙酸钠（3 M，pH 5.2）	Sigma	S7899
无菌过滤吸头			20、200、1,000 µL
Thermomixer C	Eppendorf	5382000023
Vortex Genie 涡旋振荡器	Scientific Industries	SI-0236
洗涤储液槽			约 1,000 mL
二甲苯	VWR	89370-088	组织学级别