基于形态学指标的大规模重建及无偏独立聚类以分类特定神经元群体

摘要

本方案描述了通过表达荧光标记物的改良型狂犬病毒进行逆向感染标记后，对特定神经元群体进行的大规模重构，以及独立且无偏倚的聚类分析，从而实现对不同神经元亚类之间形态学参数的全面表征。

摘要

本方案概述了结合大规模神经元重建与独立且无偏倚的聚类分析方法，以对特定神经元群体中观察到的形态学特征进行全面系统的研究。这些技术的结合构成了一种收集和分析神经解剖学数据的新方法。这些技术共同实现了对特定神经元群体的大规模、因而更全面的采样，并建立了无偏倚的定量方法，用于描述群体中形态学上独特的神经元类别。

该方案概述了使用改造的狂犬病毒选择性标记神经元的方法。将缺失G蛋白的狂犬病毒通过立体定位注射至目标脑区后，其可作为逆行示踪剂，并作为载体将EGFP递送至神经元并实现表达。利用该技术可感染大量神经元，使其在整个树突中表达GFP，从而产生 "高尔基体样" 单个神经元的完整填充。因此，病毒介导的逆向示踪方法通过实现完整的细胞内填充，改进了传统的染料基逆向示踪技术。

为了获得具有代表性的神经元样本，需在所研究的脑区各个区域中选择单个分离良好的神经元进行重建。本方案概述了对跨越多个组织切片的标记神经元的胞体及完整树突分支模式进行重建的操作步骤。提取每个神经元在脑结构中的位置等形态学数据，用于后续分析。采用标准编程函数，基于形态学指标进行独立的聚类分析及聚类评估。为验证这些分析方法的有效性，对在猕猴丘脑网状核（TRN）中重建的160个神经元所进行的聚类分析进行了统计学评估。原始聚类分析及本研究中的统计评估结果均表明，TRN神经元可分为三个亚群，每个亚群具有独特的形态学特征。

引言

神经解剖学是神经科学的基础之一¹，近年来对"连接组学"的兴趣重新激发了人们理解神经元群体形态多样性以及特定神经元之间连接关系的热情²。随着新技术的发展，包括基于遗传学和病毒介导的环路示踪方法在内的神经元标记与重建技术已显著改进^3,4，使得对神经元群体进行更全面的形态学研究成为可能⁵。除了单个神经元标记技术的进步，还涌现出一系列定量数据分析方法，能够基于形态学数据对神经元进行独立且无偏倚的分类，将其划分为不同的亚群^5,6。这些无偏倚方法相较于传统定性分类方法是一大进步，后者在过去一个多世纪中一直是该领域的标准。本研究旨在逐步阐述一种综合方法：针对特定神经元群体，采用病毒介导的标记技术，对其中大量神经元进行系统性重建，并基于独立聚类分析和统计评估进行定量数据分析。通过整合这些方法，我们提出了一种新颖的神经解剖学数据采集与分析策略，以促进对特定神经元群体中形态独特神经元类型的全面取样和无偏倚分类。

作为这些方法的一个示例，我们描述了对猕猴丘脑网状核（TRN）单个区域中大量神经元群体的分析。这些....

方案

注意：本研究中所检测的组织是作为另一项研究⁵的一部分制备的。因此，涉及动物使用的全部实验方法已在Briggs et al.（2016）的实验方法部分进行了详细描述。先前研究中所有涉及动物的操作均经机构动物护理和使用委员会批准。向背外侧膝状体（dLGN）注射病毒以及脑组织进行组织学处理的步骤在下文第1-2节中简要描述。

1. 立体定位注射

1. 在无菌环境中使用无菌技术进行所有外科手术操作。将所有金属外科器械、纱布和手术单材料通过高压蒸汽灭菌器进行蒸汽灭菌。对可能因蒸汽而受损的所有材料，采用化学灭菌法进行灭菌。例如 环氧乙烷
2. 根据动物种类和实验方案的具体要求诱导并维持麻醉。
   1. 对猴子进行病毒注射时，使用氯胺酮（10 mg/kg）诱导麻醉，并通过吸入式异氟烷（1–3%溶于氧气）维持全身外科麻醉，同时监测呼出二氧化碳水平₂持续监测心电图（EKG）、呼吸频率和体温，并定期检查下颌张力以确保适当的麻醉深度。
3. 将动物置于立体定位仪框架中，以固定头部位置，并利用立体定位坐标确定目标注射脑区的位置例如 dLGN）。若需记录视觉反应，请在双眼滴入眼药水（如需散瞳则使用1%阿托品眼药水，否则使用生理盐水眼药水），随后佩戴隐形眼镜以防止角膜干燥。若不记录视觉反应，则在双....

结果

我们先前已证实，在向dLGN注射改良的狂犬病毒后，可实现对特定神经元群体中神经元的大规模重建⁵最近，利用相同的组织重建了TRN视觉区域中的160个神经元（Bragg 等，正在审稿中； 图2A-B) 按照上述详细的方法步骤进行。在丘脑网状核（TRN）研究中，基于10项形态学指标的独立聚类分析，鉴定出三类独特的TRN神经元集群：胞体面积、胞体圆度、相对于TRN中心的内外侧位置、TRN内的背腹侧位置、树突树的数量、树突到节点的平均距离、3级树突的平均长度^rd 以及高级树突，平均角度为1^st 一级树突、总树突分支的平均相位角以及总树突分支的角度偏差。TRN神经元在这三个聚类中呈等量分布。图 2C）。对三个聚类中所有10项形态学指标进行独立的统计学比较，结果显示，除原始聚类分析中包含的两项形态学指标外，其余各项指标在各聚类间的差异均具有统计学意义。因此，基于聚类分析生成的层次聚类树状图（图2C）以及.......

讨论

神经解剖学研究一直是神经科学的支柱，近年来人们对连接组学及结构-功能关系的兴趣重新激发了对特定神经元群体进行精细形态学表征的热情。传统上，神经解剖学研究依赖于专家级神经解剖学家对神经元进行定性分类，将其划分为形态上不同的神经元类别。随着神经元重建技术和形态数据提取方法的进步，现在可以采用更复杂且定量的数据分析方法，以无偏倚的方式对形态上不同的神经元类别进行分类。本研究逐步介绍了以下方法：1）利用病毒介导的逆行标记方法选择性地标记数百个单个神经元；2）系统地重建数百个单个神经元，以形成特定神经元群体内全面且具有代表性的样本；3）进行独立的聚类分析并结合统计评估，基于形态学指标确定特定神经元群体内的最优聚类。通过将不同的聚类方法应用于已有的丘脑网状核（TRN）神经元数据集，验证了这些分析方法的有效性。我们基于三种独立的评估方法证明，TRN神经元最优地聚类为三个形态上 distinct 的亚群。

本研究所述方案的一个主要优势在于其灵活性。缺失G蛋白的狂犬病毒在注入目标结构后，已证明可有效驱动数百个逆向标记神经元中的EGFP表达。相同的狂犬病毒株在多种物种中同样有效，包括猕猴

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SADΔG-EGFP	E.M. Callaway 实验室，索尔克研究所		由 F. Osakada 博士制备。经索尔克研究所病毒核心实验室提供缺失 G 蛋白的狂犬病病毒
记录电极：铂/铱或钨	FHC	UEPSGGSE1N2M	访问网站（www.fh-co.com）了解其他订购规格
Nanoject II	Drummod Scientific	3-000-204，110 V	替代方案：picospritzer、Hamilton 注射器
冷冻切片机	赛默飞世尔科技
DAB	Sigma Aldrich	D5905-50TAB	3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐，片剂，每片含10 mg底物。注意：致癌物——废弃前必须漂白处理
细胞色素C	Sigma Aldrich	C2037-100MG
过氧化氢酶	Sigma-Aldrich	C9322-5G
兔抗GFP	Life Technologies/Thermo Fisher	#A-11122	一抗
生物素标记的山羊抗兔	Vector Laboratories	#BA-1000	二抗
Neurolucida 系统	MicroBrightField		用于神经元追踪与分析的软件。http://www.mbfbioscience.com/neurolucida
Neurolucida Explorer	MicroBrightField		数据导出软件
Microfire 相机	奥普特罗尼克斯		200万像素真彩显微镜相机。http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf
尼康E800显微镜	尼康仪器公司		生物研究显微镜。http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html
Matlab	The MathWorks Inc.		基于矩阵的计算数学软件。http://www.mathworks.com
Microsoft Office Excel	微软		电子表格程序