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基于形态学指标的大规模重建及无偏独立聚类以分类特定神经元群体

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DOI：

10.3791/55133

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2017年2月15日

 , 
1Physiology & Neurobiology, Geisel School of Medicine at Dartmouth

本文内容

摘要

本方案描述了通过表达荧光标记物的改良型狂犬病毒进行逆向感染标记后，对特定神经元群体进行的大规模重构，以及独立且无偏倚的聚类分析，从而实现对不同神经元亚类之间形态学参数的全面表征。

摘要

本方案概述了结合大规模神经元重建与独立且无偏倚的聚类分析方法，以对特定神经元群体中观察到的形态学特征进行全面系统的研究。这些技术的结合构成了一种收集和分析神经解剖学数据的新方法。这些技术共同实现了对特定神经元群体的大规模、因而更全面的采样，并建立了无偏倚的定量方法，用于描述群体中形态学上独特的神经元类别。

该方案概述了使用改造的狂犬病毒选择性标记神经元的方法。将缺失G蛋白的狂犬病毒通过立体定位注射至目标脑区后，其可作为逆行示踪剂，并作为载体将EGFP递送至神经元并实现表达。利用该技术可感染大量神经元，使其在整个树突中表达GFP，从而产生 "高尔基体样" 单个神经元的完整填充。因此，病毒介导的逆向示踪方法通过实现完整的细胞内填充，改进了传统的染料基逆向示踪技术。

为了获得具有代表性的神经元样本，需在所研究的脑区各个区域中选择单个分离良好的神经元进行重建。本方案概述了对跨越多个组织切片的标记神经元的胞体及完整树突分支模式进行重建的操作步骤。提取每个神经元在脑结构中的位置等形态学数据，用于后续分析。采用标准编程函数，基于形态学指标进行独立的聚类分析及聚类评估。为验证这些分析方法的有效性，对在猕猴丘脑网状核（TRN）中重建的160个神经元所进行的聚类分析进行了统计学评估。原始聚类分析及本研究中的统计评估结果均表明，TRN神经元可分为三个亚群，每个亚群具有独特的形态学特征。

引言

神经解剖学是神经科学的基础之一1，近年来对"连接组学"的兴趣重新激发了人们理解神经元群体形态多样性以及特定神经元之间连接关系的热情2。随着新技术的发展，包括基于遗传学和病毒介导的环路示踪方法在内的神经元标记与重建技术已显著改进3,4，使得对神经元群体进行更全面的形态学研究成为可能5。除了单个神经元标记技术的进步，还涌现出一系列定量数据分析方法，能够基于形态学数据对神经元进行独立且无偏倚的分类，将其划分为不同的亚群5,6。这些无偏倚方法相较于传统定性分类方法是一大进步，后者在过去一个多世纪中一直是该领域的标准。本研究旨在逐步阐述一种综合方法：针对特定神经元群体，采用病毒介导的标记技术，对其中大量神经元进行系统性重建，并基于独立聚类分析和统计评估进行定量数据分析。通过整合这些方法，我们提出了一种新颖的神经解剖学数据采集与分析策略，以促进对特定神经元群体中形态独特神经元类型的全面取样和无偏倚分类。

作为这些方法的一个示例，我们描述了对猕猴丘脑网状核（TRN）单个区域中大量神经元群体的分析。这些数据来自之前的一项研究7。文中概述了通过手术注射编码EGFP的改良狂犬病毒，以特异性标记投射至丘脑背外侧膝状体核（dLGN）的TRN神经元的方法4,8（见特定材料/设备列表第2行）。这种改良的狂犬病毒缺失编码关键衣壳蛋白的基因，从而阻断了病毒的跨突触传播。当病毒进入注射部位的轴突末梢后，其行为类似于传统的逆行示踪剂，但具有一个重要的优势：可在被感染神经元的完整树突分支中驱动EGFP的表达5,9,10。因此，这种G基因缺失型狂犬病毒可在注射并经逆行运输后，用于特异性感染和标记任意神经元群体。

为了对特定神经元群体进行综合分析，重要的是要从该群体内广泛分布的神经元中进行取样。由于病毒介导的标记技术可实现完整的细胞内标记， "高尔基体样" 在病毒注射位点处，许多神经元的轴突被填充，从而可以在脑结构的整个范围内重建大量神经元样本。此外，由于改良的狂犬病毒在感染和标记大量神经元方面效果显著，每只动物可实现数百个神经元的重建。在整个丘脑网状核视觉区采样160个神经元的操作流程11 为获得投射至背外侧膝状体（dLGN）的丘脑网状核（TRN）神经元的全面样本，本文概述了相关流程。描述了使用神经元重建系统（包括显微镜、相机和重建软件）对单个神经元进行重建的过程。同时介绍了确定单个神经元在脑结构内位置（本例中为TRN内）的方法，以及利用体积轮廓重建技术验证病毒注射位点在结构内（本例中为dLGN内）的位置与体积的方法。本文还概述了导出形态学数据并基于每个神经元测量的形态学参数进行独立聚类分析的步骤。聚类方法存在局限性，且存在多种不同的聚类算法。因此，文中阐述了这些可选方案以及若干常用算法的优势。聚类分析本身无法提供对聚类独特性的统计学验证，故本文进一步概述了验证最优聚类结果以及簇内与簇间形态学数据关系的附加步骤。最后，描述了针对TRN数据集的统计学方法，以确认TRN神经元可根据10项独立的形态学参数被划分为三个独特的聚类群。

因此，通过概述对特定神经元群体的选择性标记、形态数据重建与分析步骤，我们描述了量化同一群体内神经元之间形态学差异的方法。通过对猕猴丘脑网状核视觉区中不同神经元类型的先前发现进行独立的统计学评估，进一步验证了这些结果。我们希望，这些技术可广泛应用于神经解剖学数据集，并有助于建立全脑范围内神经元群体多样性的定量分类体系。

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方案

注意：本研究中所检测的组织是作为另一项研究5的一部分制备的。因此，涉及动物使用的全部实验方法已在Briggs et al.（2016）的实验方法部分进行了详细描述。先前研究中所有涉及动物的操作均经机构动物护理和使用委员会批准。向背外侧膝状体（dLGN）注射病毒以及脑组织进行组织学处理的步骤在下文第1-2节中简要描述。

1. 立体定位注射

  1. 在无菌环境中使用无菌技术进行所有外科手术操作。将所有金属外科器械、纱布和手术单材料通过高压蒸汽灭菌器进行蒸汽灭菌。对可能因蒸汽而受损的所有材料，采用化学灭菌法进行灭菌。例如 环氧乙烷
  2. 根据动物种类和实验方案的具体要求诱导并维持麻醉。
    1. 对猴子进行病毒注射时，使用氯胺酮（10 mg/kg）诱导麻醉，并通过吸入式异氟烷（1–3%溶于氧气）维持全身外科麻醉，同时监测呼出二氧化碳水平2持续监测心电图（EKG）、呼吸频率和体温，并定期检查下颌张力以确保适当的麻醉深度。
  3. 将动物置于立体定位仪框架中，以固定头部位置，并利用立体定位坐标确定目标注射脑区的位置例如 dLGN）。若需记录视觉反应，请在双眼滴入眼药水（如需散瞳则使用1%阿托品眼药水，否则使用生理盐水眼药水），随后佩戴隐形眼镜以防止角膜干燥。若不记录视觉反应，则在双眼涂抹眼用软膏。
  4. 沿头皮中线做切口，并牵开皮肤和肌肉。
  5. 根据目标结构（dLGN）在单侧半球的立体定位坐标，制作一个小的颅骨开窗。
  6. 逐渐降低记录电极（例如 钨或铂/铱电极（参见 特定材料/设备列表，第3行）夹在显微操作器上，通过颅骨开孔手动插入脑内。较低的阻抗（< 1 MΩ）且稍粗（直径约 250 µm）的电极可根据需要用于穿透硬脑膜。
  7. 记录操纵器在皮层表面以及视觉反应测量点的位置。视觉反应是可听的、与闪光刺激时间同步的神经元反应，通过检眼镜或小型LED/手电筒向眼睛内闪烁光刺激诱发。
  8. 通过记录视觉反应起始、中间和结束时的操纵器位置，并从这些数值中减去皮层表面位置，确定dLGN的位置和厚度。记录dLGN内每个预定注射位点的深度。
    注意：通过使用适当的感觉刺激，类似的方法也可用于定位非视觉结构。此外，还可使用耦合的记录/注射系统来靶向小的脑结构。
  9. 记录下最佳注射位点后，移除记录电极，将注射移液管（玻璃移液管或注射针筒）置于相同的立体定位坐标位置，并依次从最深的注射位点开始，逐步移动至最浅的位点，每次注射后至少等待1分钟再改变注射位置。与针头尖端（直径约200 µm）相比，外径约50 µm的玻璃移液管可能减少病毒的回流。
  10. 使用注射系统（参见 特定材料/设备清单t，第4行）、微量喷射器（picospritzer）或注射泵，在目标结构（dLGN）内多个（3–10个）深度位置，以约100 nL/min的速度注射少量改良型狂犬病毒（1–5 μL；具体注射操作请参照制造商说明书）。注意：在较大的目标结构中可进行多次独立的注射穿刺例如 猴dLGN）。根据目标结构的大小调整总注射体积。
  11. 在撤回注射移液管之前至少暂停 5 分钟。移除注射移液管后，用保护性材料填充颅骨开孔（将骨片用胶固定到位，或使用骨蜡或明胶海绵），然后缝合肌肉和皮肤。
  12. 给予镇痛剂（例如 酮洛芬）以及抗生素，并在手术结束前给药，在动物恢复行走能力前持续监测。
  13. 术后至少3天至最多10天内，每天监测动物状况，确保缝线清洁、干燥且完整，动物无疼痛或不适表现。根据需要每日给予镇痛剂和抗生素。待动物完全从手术中恢复后，开始进行群养。 

2. 组织采集、切片与染色

  1. 给予 7 - 14 天时间使病毒完成逆向运输，然后通过过量的安乐死溶液处死动物（例如 使用 Euthasol 处死动物，随后经心脏灌注 0.1 M 磷酸盐缓冲盐水、4% 多聚甲醛，再灌注含 10% 蔗糖的 4% 多聚甲醛。
  2. 取出脑组织（参见12 将样本置于含4%多聚甲醛的20-30%蔗糖溶液（溶于0.1 M磷酸盐缓冲液）中，4℃冷藏1-2天（适用于啮齿类动物模型的类似步骤）。
  3. 当脑组织沉降至容器底部时，取出脑组织并将其切成包含逆行标记神经元的脑区组织块例如 视觉皮层）和注射靶向结构（例如 外侧膝状体核（dLGN）。从未注射的半球切取相同部位的组织块，作为对照切片。为获得最佳结果，应立即对新鲜切片的组织进行组织学处理。
  4. 使用冷冻切片机将组织进行冠状面切片，每片厚度为50 μm（参见 特定材料/设备列表，第5行）。
  5. 对所有切片进行细胞色素氧化酶活性染色（参见 特定材料/设备清单，第5-8行）以可视化皮层各层及皮下结构13注意：在细胞色素氧化酶染色的最后漂洗步骤后，切片可于冰箱中保存过夜。
  6. 用绿色荧光蛋白（GFP）的一抗（1:1,000 稀释，约 12 小时孵育；参见 特定材料/设备列表，第9行）随后加入与一抗宿主匹配的生物素标记二抗5 （1:500 稀释，2–4 小时孵育；参见 特定材料/设备清单，第10行）。建议将切片在二抗中孵育过夜。
  7. 使用亲和素-生物素复合物标记切片，然后与DAB和过氧化物反应，以永久性染色所有标记的神经元5.
  8. 将切片贴附于载玻片上，室温干燥过夜。
  9. 使用一系列酒精和二甲苯冲洗进行脱脂，然后加盖盖玻片14.

3. 神经元重建

注意：所有原始实验的重建均使用神经元重建系统完成，该系统由显微镜（见特定材料/设备表第14行）、连接的摄像头（见特定材料/设备表第13行）和重建软件包（见特定材料/设备表第11–12行）组成。借助软件的神经元重建技术可实现组织切片与基于计算机绘制的神经元突起图像的叠加可视化。重要的是，该软件能够以三维形式对形态学重建数据进行数字化，从而提取特定位置的形态学信息。配套的数据提取程序（见特定材料/设备表第12行）可从每次保存的重建结果中提取丰富的形态学数据。

  1. 将一张载玻片放入显微镜载物台夹持器中，使用低倍物镜对焦于感兴趣的单个区域例如 2倍或10倍）。通过正确调整相机快门位置，确保软件界面中可见相机图像。
  2. 选择目标脑结构中标记的神经元（例如 TRN）进行合理分离，以便尽可能明确地重建出树突分支的大部分结构。优先选择细胞体完全位于单个切片内的神经元，以最大程度地获取每个细胞体的完整形态，并准确估算其面积和圆度。使用10倍显微镜物镜在原位切片中识别细胞体。
  3. 一旦确定了一个染色良好且孤立的神经元，加入 "首页" 通过点击将包含细胞体的区域发送至区段管理器 "新章节" 按钮。 输入要包含的切片数量（建议初始设置为 2 - 3 个部分）。当系统提示时，设定切片厚度为 50 μm（参见步骤 2.3）。
  4. 在含有细胞体的脑区部分，勾画出相关脑结构的轮廓。使用2倍物镜/放大倍数进行轮廓勾画。
    1. 首先，选择 "轮廓" 从顶部工具栏的下拉菜单中选择，然后从下拉菜单中选择轮廓类型（例如 "LGN" 或 "TRN").
    2. 勾画目标结构的轮廓（例如 TRN）以及相邻结构（如需要），方法是使用鼠标作为绘图工具，沿轮廓点击各个点。
    3. 选择 "闭合轮廓" 通过单击鼠标右键并从菜单中选择此选项，以完成并闭合每个 traced contour。
  5. 在右侧工具栏中点击所需的标记符号，然后在重建图像中点击目标位置，将标记放置于目标结构的中心。在所有重建图像中，均使用相同类型的标记来标注目标结构的中心。
  6. 轮廓绘制完成后，使用 40 - 60X 物镜/放大倍数追踪细胞体的轮廓。操作时，首先选择 "神经元" 从顶部工具栏的下拉菜单中选择要追踪的神经元结构，在本例中 "细胞体"接着按照3.4步骤描记细胞体。
  7. 在细胞体中心放置一个不同样式的标记，具体步骤参照3.5。
  8. 从细胞体开始追踪所有树突。
    1. 首先，选择 "树突" 从下拉菜单中选择，然后从细胞体开始，使用鼠标作为绘图工具追踪每一条树突。在追踪过程中，务必调整z轴深度，以准确捕捉树突的角度和走向。
    2. 在树突的每个分支点处，通过右键单击鼠标并从下拉菜单中选择“分叉节点”或“三分叉节点”来放置节点。所有树突重建均需使用 40 - 60X 的物镜/放大倍数。
    3. 在每根树突的末端，右键单击鼠标，然后从下拉菜单中选择“Ending”。
  9. 识别可能延伸至相邻切片的树突末端，并将显微图像中相应z轴深度的结构调至清晰对焦。在显微图像中包含附近的显著解剖标志，例如血管或易于辨认的树突形态或束状结构。
    1. 将显微镜放大倍数调低至20X或10X（选择能够最清晰显示解剖标志的放大倍数），并使用数码相机拍摄显微镜图像例如 手机、平板电脑）手持设备对准计算机屏幕。
  10. 移动到切片的相邻区域，将先前描记部分的轮廓与新区域中dLGN和TRN的边界对齐。
  11. 将视野返回至细胞体的一般区域（根据轮廓和主要解剖标志），并将放大倍数恢复至10 - 20倍。
  12. 利用先前已追踪部分的树突末端照片，帮助将新部分中树突的起始端与前一切片中的末端对齐。
    1. 要旋转描迹并移动以对齐树突，请使用箭头工具选择重建结构，右键单击并选择 "移动" 从下拉菜单中。
    2. 或者，使用 "匹配" 使用匹配工具将树突末端与起始点连接。从顶部工具栏中选择“匹配”工具，系统提示时，单击重建图中的末端及其在图像中对应的延续点。对3个或更多末端重复此操作。
  13. 将上一节的追踪结果与新切片中的树突对齐后，通过单击当前切片，在切片管理器中确保已选中相应的新切片。或者，如3.3节所述，在切片管理器中添加一个新切片，相应地调整每个新切片相对于基准切片的z轴深度和位置，并将每个切片的厚度设置为50 mm（参见步骤2.3）。
  14. 将放大倍数增加至 40 - 60X，然后通过在重建图像中树突末端处右键点击鼠标并选择来追踪树突的延续部分 "添加到结尾" 从下拉菜单中选择，然后使用鼠标作为绘图工具描记树突。根据提示指定延续部分是否位于新切片中。
  15. 至少追踪3个相邻切片（主切片两侧各一个）中的树突，按照步骤3.8 - 3.15进行。持续添加至重建结果中，直至该神经元至少有3个连续切片被追踪完成，或直至树突无法继续追踪或定位为止。如需，可按照上述步骤在邻近切片中继续勾画轮廓。

4. 独立聚类

注意：独立聚类分析能够对大型多维数据集进行无偏分析，这些数据集可能难以直接可视化，更重要的是，可对形态多样性提供定量评估。基于矩阵的编程平台对于多维数据集的分析非常有用，能够实现复杂的数据操作和统计分析。步骤 4 至 6 中列出的函数在特定材料/设备表第 15 行所列的编程平台中定义。

  1. 使用与神经元重建系统相关的提取程序，从每个神经元重建个体中提取形态学数据（参见 特定材料/设备列表，第11-12行。
    1. 首先，选择每次重建所需的形态学数据，包括：轮廓信息、标记物信息、细胞体的形态学数据以及树突分支的形态学数据， 等等.
    2. 从顶部工具栏的“编辑”下拉菜单中选择“全选对象”。然后从顶部工具栏的“分析”下拉菜单中选择“分支结构分析”，并依次点击各个选项卡，在每个选项卡中选择所需的分析选项。
    3. 单击以提取所有所需数据 "好的" 分析窗口中的按钮，通过右键单击输出窗口并选择以电子表格格式保存 "导出至 Excel".
  2. 编制主电子表格（参见 特定材料/设备清单，第16行），其中每个形态学变量/度量指标由每个神经元的一个数值观测值表示。在此主电子表格中，需记录每个神经元的行标识符。
  3. 验证聚类分析中包含的所有变量（例如 形态学指标彼此相互独立。例如，树突或轴突分支结构中的节点数量将与分支数量存在相关性。因此，在聚类分析中，这两个变量应仅选取其一。
  4. 确保每次测量都包含每个变量的观测值， 即 每个神经元（测量单位）必须对应每个形态学指标（变量）的数据点（观测值）。如果部分神经元缺失某一特定变量（例如轴突长度）的观测值，则该变量（轴突长度）不能用于聚类分析。
  5. 将主电子表格中的数据整理成一个单一矩阵，其中每一行代表一个神经元，每一列包含各形态学参数的数值数据图1例如，一个包含100个神经元且每个神经元有5个自变量观测值的数据集，可用一个100 × 5（行×列）的矩阵表示。矩阵中无需包含每个神经元的额外标识信息——行索引即可作为各神经元的唯一标识符。矩阵中也不应存在任何空白或缺失值 "NaN"矩阵中的 s。将矩阵保存为单个变量（例如 数据 = [100 × 5 矩阵]；参见 补充代码文件 示例代码）。
  6. 选择一种算法来计算在n维空间中表示单个神经元的点之间的距离，其中n由变量数量定义。“pdist”函数提供了计算神经元间距离的灵活性。默认的距离计算方法为欧几里得距离，此前已用于神经元形态数据的类似分析。5,6.
  7. 利用 'pdist' 函数输出的神经元间距离，使用 'linkage' 函数进行聚类。同样，存在多种聚类方法可供选择。在形态学数据集的分析中，Ward 法和质心距离法所得结果相似。5,6.
  8. 如有需要，可使用“kmeans”函数作为“pdist”和“linkage”函数的替代聚类方法。“kmeans”采用平方欧氏距离计算神经元间的距离，然后基于质心距离进行聚类分配。
  9. 要可视化层次聚类树，可对“linkage”操作的结果使用“dendrogram”函数。该函数默认将可视化限制为30个测量值，但可通过指定测量值数量来覆盖此默认设置（例如 神经元）显示。树状图的 y 轴表示各神经元之间的连接距离，x 轴上的行索引用于标识每个神经元。
    注意：“linkage”和“dendrogram”的输出结果并不能确定最佳聚类数量。“kmeans”的输出结果虽可将测量值分配至各个聚类，但无法检验这些聚类是否为最优。可另行进行统计比较与最优聚类的验证（见下文）。

5. 聚类结果的验证

注意：如上所述，聚类分析本身并不能直接提供统计学评估，以判断聚类树状图中所示的聚类是否具有独特性并能代表样本。已有研究提出验证树状图中聚类的方法15，但这些方法并不能提供对最优聚类的统计学验证。目前存在多种用于验证最优聚类的方法。

  1. 方法1：评估聚类
    1. 使用 'evalclusters' 函数并指定用于计算聚类的方法，例如 'kmeans' 或 'linkage'。也可评估高斯混合模型的输出结果（见下文步骤 5.2；见 补充代码文件 用于样本代码）。
    2. 从多个选项中指定评估标准（例如 'CalinskiHarabasz' — 有关准则选项的说明，请参阅帮助菜单中的相关内容，搜索 "评估聚类").
    3. 指定要测试的最佳聚类数范围（例如 [1:6] 以检验1、2、3、4、5或6个聚类是否最优。
      注意：“evalclusters”的输出结果是在指定聚类算法和准则下的最优聚类数目。
  2. 方法2：高斯混合模型聚类
    注意：高斯混合模型聚类算法（GMMs）假设每个变量的观测值来自定义每个假定簇的高斯分布混合，每个分布具有自身的均值和协方差。随后，GMM 使用期望最大化算法为每次测量分配后验概率，表示其属于特定簇的概率16.
    1. 使用“fitgmdist”函数输入数据中可观察到的潜在聚类数量，以实现高斯混合模型（GMM）。或者，为避免 先验的 聚类数量的确定，使用主成分分析（PCA），并依据此处所述步骤，采用一系列不同的最优聚类数量进行分析（参见 补充代码文件 示例代码）。
    2. 对原始数据矩阵使用“pca”函数，并将主成分得分作为输出保存。
    3. 从1开始循环至某个预设的最佳聚类数，对主成分得分使用'fitgmdist'函数，为每个预设的最佳聚类数生成高斯混合模型（GMM）。
    4. 通过检查负对数似然、赤池信息准则和贝叶斯信息准则来评估每个高斯混合模型。具有最低准则值的高斯混合模型为最优模型。
    5. 如有需要，可在聚类数最优时检验各聚类均值是否存在显著差异（各聚类的均值存储在 "μ" 每个高斯混合模型的输出。

6. 聚类数据的统计分析

  1. 使用层次聚类确定并评估最优簇数后，返回原始数据，将神经元划分为不同簇，并确定哪些形态学指标促使神经元聚类为独特的类别。
  2. 对原始的形态学指标数据进行排序，使神经元根据簇分配结果进行分组。
  3. 为分析神经元间形态学数据之间的关系（针对所有神经元或按簇划分的神经元），对形态学指标观测值进行两两或三者之间的线性回归拟合。这些拟合可使用 'fit' 函数进行估计，并通过 'fitlm' 函数进行评估，其拟合优度输出包括 R2 和回归拟合的 p 值。
  4. 为检验各簇内神经元之间的统计学关系，根据簇的数量，采用非参数双样本（Wilcoxon 秩和检验）或多样本比较检验（ANOVA）。重要的是，使用多样本 ANOVA 可确保 p 值已对多重比较进行校正。

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结果

我们先前已证明，在向dLGN注射改良的狂犬病毒后，可实现对特定神经元群体的大规模重建5最近，同一组织被用于重建丘脑网状核视觉区的160个神经元（Bragg 等，正在审稿中； 图2A-B) 按照上述详细的方法步骤进行。在丘脑网状核（TRN）研究中，基于10项形态学指标的独立聚类分析，鉴定出三类独特的TRN神经元集群：胞体面积、胞体圆度、相对于TRN中心的内外侧位置、TRN内的背腹侧位置、树突树的数量、到树突节点的平均距离、3级树突的平均长度rd 以及高级树突，平均角度为1st 一级树突、总树突分支的平均相位角以及总树突分支的角度偏差。TRN神经元在这三个聚类中分布相当。图2C）。对三个聚类中神经元的全部10项形态学指标进行独立的统计学比较，结果显示，除原始聚类分析中包含的两项形态学指标外，其余各项指标在各聚类间的差异均具有统计学显著性。因此，基于聚类分析生成的层次聚类树状图（图 2C根据形态...

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讨论

神经解剖学研究一直是神经科学的支柱，近年来人们对连接组学及结构-功能关系的兴趣重新激发了对特定神经元群体进行精细形态学表征的热情。传统上，神经解剖学研究依赖于专家级神经解剖学家对神经元进行定性分类，将其划分为形态上不同的神经元类别。随着神经元重建技术和形态数据提取方法的进步，现在可以采用更复杂且定量的数据分析方法，以无偏倚的方式对形态上不同的神经元类别进行分类。本研究逐步介绍了以下方法：1）利用病毒介导的逆行标记方法选择性地标记数百个单个神经元；2）系统地重建数百个单个神经元，以形成特定神经元群体内全面且具有代表性的样本；3）进行独立的聚类分析并结合统计评估，基于形态学指标确定特定神经元群体内的最优聚类。通过将不同的聚类方法应用于已有的丘脑网状核（TRN）神经元数据集，验证了这些分析方法的有效性。我们基于三种独立的评估方法证明，TRN神经元最优地聚类为三个形态上 distinct 的亚群。

本研究所述方案的一个主要优势在于其灵活性。缺失G蛋白的狂犬病毒在注入目标结构后，已证明可有效驱动数百个逆向标记神经元中的EGFP表达。相同的狂犬病毒株在多种物种中同样有效，包括猕猴

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢Ed Callaway博士和Marty Usrey博士允许我们使用先前研究中制备的组织，感谢Libby Fairless和Shiyuan Liu在神经元重建方面的帮助。本工作由美国国立卫生研究院（NEI：EY018683）和Whitehall基金会资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
SADΔG-EGFPE.M. Callaway 实验室，索尔克研究所由 F. Osakada 博士制备。经索尔克研究所病毒核心实验室提供缺失 G 蛋白的狂犬病病毒
记录电极：铂/铱或钨FHCUEPSGGSE1N2M访问网站（www.fh-co.com）了解其他订购规格
Nanoject IIDrummod Scientific3-000-204，110 V替代方案：picospritzer、Hamilton 注射器
冷冻切片机赛默飞世尔科技
DABSigma AldrichD5905-50TAB3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐，片剂，每片含10 mg底物。注意：致癌物——废弃前必须漂白处理
细胞色素CSigma AldrichC2037-100MG
过氧化氢酶Sigma-AldrichC9322-5G
兔抗GFPLife Technologies/Thermo Fisher#A-11122 一抗
生物素标记的山羊抗兔Vector Laboratories#BA-1000二抗
Neurolucida 系统 MicroBrightField用于神经元追踪与分析的软件。http://www.mbfbioscience.com/neurolucida
Neurolucida ExplorerMicroBrightField数据导出软件
Microfire 相机 奥普特罗尼克斯200万像素真彩显微镜相机。http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf
尼康E800显微镜尼康仪器公司生物研究显微镜。http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html
MatlabThe MathWorks Inc. 基于矩阵的计算数学软件。http://www.mathworks.com
Microsoft Office Excel微软电子表格程序

参考文献

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