使用单细胞测序检测拷贝数变异

摘要

单细胞测序是一种日益流行且易于获取的工具，可用于高分辨率地研究基因组变化。我们提供了一种利用单细胞测序在单个细胞中鉴定拷贝数变异的实验方案。

摘要

在单细胞水平上检测基因组变化对于表征正常组织、癌症及微生物群体中的遗传异质性和进化过程具有重要意义。传统的遗传异质性评估方法受限于分辨率低、灵敏度低和/或特异性差。单细胞测序已成为一种强大工具，能够以高分辨率、高灵敏度以及在适当分析条件下实现高特异性地检测遗传异质性。本文提供了一套针对单细胞的分离、全基因组扩增、测序及数据分析的实验方案。该方法可稳定识别单细胞中兆碱基尺度的拷贝数变异。然而，本方案的部分步骤也可应用于研究单细胞中其他类型的遗传改变。

引言

DNA拷贝数的改变其大小范围可从数个碱基对（拷贝数变异）（CNVs）到整条染色体（非整倍性）。影响基因组大片区域的拷贝数改变可通过调控多达数千个基因的表达而产生显著的表型效应^1,2。存在于群体所有细胞中的拷贝数变异可通过群体测序或基于微阵列的方法检测到^3,4。然而，群体也可能具有遗传异质性，其中拷贝数变异仅存在于部分细胞亚群甚至单个细胞中。遗传异质性在癌症中十分常见，可驱动肿瘤的演化，同时也存在于正常组织中，但其影响尚不明确^5,6,7,8,9,10。

传统上，遗传异质性通过细胞学方法或群体测序进行评估。细胞学方法，如荧光原位杂交（FISH）、染色体铺展和光谱核型分析（SKY），能够识别单个细胞中存在的变异，具有优势，但由于杂交和铺展过程中的人工假象，其错误率较高¹¹。这些方法的分辨率也有限，仅能揭示跨度达数兆碱基的拷贝数变化。尽管群体DNA的测序或微阵列分析在准确性和分辨率方面更高，但其灵敏度较低。为了通过基于群体的方法检测遗传异质性，变异必须在群体中相当比例的细胞中存在。单细胞基因组DNA扩增技术的出现使得对单个细胞的基因组进行测序成为可能。单细胞测序具有高分辨率、高灵敏度的优点，并且在应用适当的质量控制方法时，还具有高准确性¹²。

本文介绍了一种在单细胞中检测兆碱基尺度拷贝数变异的方法。我们通过显微吸吮法分离单细胞，利用连接子-接头PCR扩增基因组DNA，构建用于下一代测序的文库，并通过隐马尔可夫模型和循环二元分割法检测拷贝数变异。

方案

1. 分离单个细胞

1. 准备显微吸管
   1. 取下吸管组件的透明塑料端，将细端插入一段长1英尺、内径为3/16"的PVC管一端。
   2. 将一个0.2 µm注射式滤器的出口插入另一段长1英尺、内径为3/6"的PVC管的一端。
   3. 将该0.2 µm注射式滤器的入口插入一段长6英寸、内径为5/16"的PVC管的一端。
   4. 可选步骤：将这段长6英寸、内径为5/16"的PVC管从中间切断，并在两段之间接入一个在线水阱。
   5. 将一支5 mL塑料刻度移液管在1 mL刻度处折断，并将折断端插入内径为5/16"的PVC管的开口端。
   6. 将5 mL塑料刻度移液管的出口端插入吸管组件的柔性端（即之前取下透明塑料端的位置）。
   7. 储存时，用无菌塑料管盖住吸管组件的红色吹嘴。
   8. 通过将玻璃毛细管的中部靠近本生灯火焰并对其两端施加张力，将其拉制成内径为10–30 µm的细管。在拉制后的管子中间折断，得到两根潜在的吸管针。重复此步骤多次，因为只有部分毛细管最终能获得适合单细胞捕获的内径。
   9. 储存时，在一个15 cm的培养皿中放置两条油灰状黏土条，并将吸管针横跨固定在黏土条上。
2. 挑选细胞
   1. 根据细胞类型和实验需求制备单细胞悬液。例如，对于贴壁细胞（如人成纤维细胞系），可通过胰酶消化法收集细胞，并将细胞转移至含有适当培养基的锥形管中。
   2. 在制备单细胞悬液之前、期间或之后（取决于制备所需时间），准备用于全基因组扩增的操作台。
      1. 用10%次氯酸钠溶液喷洒超净台表面、移液器吸头盒及吸头，再用纸巾擦拭；随后用70%乙醇重复此步骤。
      2. 从全基因组扩增（WGA）试剂盒中取出8 µL水，加入96孔PCR板的各个孔中，每个待测序细胞对应一孔。用96孔细胞培养板的盖子盖住PCR板，并置于冰上。
   3. 将1000个细胞加入盛有10 mL培养基或磷酸盐缓冲液（PBS）的15 cm培养皿中，并将培养皿置于冰上，以防止细胞贴壁。
   4. 将含有细胞的培养皿以及加盖并置于冰上的96孔PCR板转移至配备10倍物镜的光学显微镜下。
   5. 通过轻轻敲击拉制好的吸管针末端于硬物表面，使尖端断裂，从而增大吸管针的开口。将吸管针的宽端插入显微吸管的透明端。
   6. 将含有细胞的培养皿置于显微镜载物台上，将吸管的红色吹嘴含入口中。一手操控吸管针，另一手移动含细胞的培养皿，识别出待测序的单个细胞。
   7. 通过口吸方式，将单个细胞连同约1–2 µL的培养基或PBS吸入吸管针中，然后将其转移至96孔PCR板某一孔内的8 µL水中。转移过程中应避免产生气泡。
   8. 重复步骤1.2.7，直至获得所需数量的细胞。在挑取细胞过程中，始终保持PCR板加盖并置于冰上，并标记已加入细胞的孔。
      1. 在挑取单细胞的同时，解冻全基因组扩增试剂盒中的10X单细胞裂解与片段化缓冲液。完成目标数量细胞的挑取后，立即进行全基因组扩增。

2. 全基因组扩增

1. 为防止全基因组扩增过程中发生污染，所有试剂应在生物安全柜内添加，使用带滤芯的移液器吸头，并在不同孔之间更换移液器吸头。
2. 从全基因组扩增（WGA）试剂盒中配制工作用裂解与片段化缓冲液。每处理最多32个细胞，取32 µL 10x单细胞裂解与片段化缓冲液和2 µL蛋白酶K溶液，加入微量离心管中混合。涡旋振荡管体以充分混匀溶液。
3. 向每个孔中加入 1 µL 工作裂解和片段化缓冲液溶液，用移液器上下吹打混匀。
4. 用塑料膜覆盖板子并密封所有孔。在微型板旋转离心机中短暂离心。
5. 热循环程序如下：50 °C，1 小时；99 °C，4 分钟。
6. 将培养板置于冰上冷却，并使用小型板式离心机短暂离心。
7. 从全基因组扩增试剂盒中配制工作用文库制备缓冲液。每细胞在微量离心管中加入2 µL 1x单细胞文库制备缓冲液和1 µL文库稳定化溶液。在同一微量离心管中配制多个细胞的工作溶液。
8. 移除塑料封膜，向每孔加入 3 µL 工作浓度的文库制备缓冲液。用移液器将孔内液体上下吹打混匀。重新盖上塑料封膜。
   注意：塑料封膜可在全基因组扩增过程中重复使用，直至孔板开始在膜上穿孔。一旦发生穿孔，应更换新的塑料封膜。
9. 短暂离心反应板（使用小型板式离心机），然后在95 °C下孵育2分钟。
10. 将培养板置于冰上冷却，并使用小型板式离心机短暂离心。
11. 移除塑料封膜，向每孔中加入1 µL文库制备酶，用移液器吹打孔内液体以混匀。此步骤中须始终将文库制备酶置于冰上或冷块中。重新盖上塑料封膜。
12. 短暂离心微孔板后，按以下条件进行热循环：16 °C 20 分钟，24 °C 20 分钟，37 °C 20 分钟，75 °C 5 分钟，最后在 4 °C 保存。
13. 将培养板置于冰上冷却，并使用小型板式离心机短暂离心。
14. 从全基因组扩增试剂盒中配制工作扩增混合液。每细胞加入48.5 µL水、7.5 µL 10x扩增主混合液和5 µL WGA DNA聚合酶至微量离心管中。将多个细胞所需的工作混合液在同一个微量离心管中配制。工作混合液置于冰上保存。
15. 移除塑料封膜，向每孔加入 61 µL 工作扩增混合液，用移液器轻轻吹打混匀。此步骤中应始终将工作扩增混合液置于冰上或冷块中。重新盖上塑料封膜。
16. 短暂离心微孔板后，使用小型离心机离心，然后进行以下热循环程序：95 °C 预变性 3 分钟，25 个循环（94 °C 变性 30 秒，65 °C 延伸 5 分钟），最后于 4 °C 保存。
17. 将每种样品各60 µL转移至不同的微量离心管中，于-20 °C保存，用于步骤3。
18. 向每个样本的剩余体积中加入DNA上样染料（即 将3 µL 6x DNA上样染料加入15 µL样品中，每种反应取5 µL在1%琼脂糖凝胶上电泳。
    注意：成功扩增的样本将呈现250至1,000 bp范围的弥散条带。未出现弥散条带或仅出现微弱弥散条带的样本不太可能获得可用的测序数据。

3. 测序

1. 使用磁性 beads 纯化样品。
   1. 将 DNA 样品置于冰上解冻。涡旋振荡磁性 beads，直至溶液均匀，并在室温下孵育 beads 至少 30 分钟。
   2. 将每个 DNA 样品中的 20 µL 转移至洁净的微量离心管中。剩余样品可储存于 -20 °C。
   3. 向每个 DNA 样品中加入 30 µL（1.5 倍体积）磁性 beads，并涡旋混匀。在室温下孵育样品 10 分钟。将 beads 储存液保留在室温，用于步骤 3.4。
   4. 将离心管置于磁力架上 2 分钟，或直至 beads 形成沉淀且上清液澄清。
   5. 使用 P200 移液器尽可能吸除上清液，避免扰动 beads。
   6. 向 DNA-beads 混合物中加入 180 µL 80% 乙醇。多次旋转离心管，使其相对于磁铁移动，以在乙醇溶液中对 beads 进行"冲洗"。
   7. 使用 P200 移液器尽可能吸除乙醇洗涤液，避免扰动 beads。
   8. 重复步骤 3.1.6 和 3.1.7。
   9. 将 beads 在空气中干燥约 10 分钟，或直至不再可见乙醇。当 beads 出现裂纹或从管壁脱落时，进行下一步操作。
   10. 将样品从磁力架上取下。加入 40 µL 10 mM Tris pH 8.0 以洗脱 DNA，并涡旋振荡样品使 beads 重新悬浮。在室温下孵育 2 分钟。
   11. 短暂离心样品，使液体聚集于管底，然后将离心管置于磁力架上至少 2 分钟。将洗脱液转移至洁净的微量离心管中，避免扰动 beads。
2. 样品归一化
   1. 使用分光光度计测定每个样品的浓度。浓度应在 10 至 30 ng/µL 范围内。
   2. 使用 10 mM Tris pH 8.0 将每个样品稀释至 0.2 ng/µL。后续步骤需从此稀释液中至少取 5 µL 作为输入。
3. 文库制备
   1. 按照文库制备试剂盒说明书操作制备测序文库¹³。
4. 最终纯化
   1. 按照步骤 3.1 对样品进行纯化。对于 50 bp、75 bp 或 150 bp 的读长，分别使用 1.5x、1x 或 0.6x 的 beads 与样品体积比。使用 15 µL 10 mM Tris pH 8.0 进行洗脱。
   2. 使用片段分析仪检测样品，以评估文库的片段大小分布¹⁴。片段大小分布应均匀分布在 150 至 900 bp 范围内。
5. 使用 qPCR 定量样品
   1. 使用文库定量试剂盒，按照试剂盒说明书设置 qPCR 反应¹⁵。留出一列用于添加阳性标准品（试剂盒中的 DNA 标准品）和阴性标准品（水或其他空白溶液）。
   2. 热循环程序如下：95 °C 预变性 5 分钟（升降温速率为 4.8 °C/秒），随后进行 35 个循环：95 °C 变性 30 秒（升降温速率为 4.8 °C/秒），60 °C 退火延伸 45 秒（升降温速率为 2.5 °C/秒）。
6. 文库合并
   1. 确定测序芯片（flowcell）上所需的通道数，并将样品分组，每组对应一个通道。
   2. 针对每组样品，根据步骤 3.5.2 的 qPCR 数据选择浓度最低的样品，并使用 10 mM Tris pH 8.0 将该组内所有样品归一化至该浓度。
   3. 将每组内的样品混合合并。
7. 测序
   1. 按照标准操作流程将合并后的文库加载至高通量测序仪上进行测序¹⁶。

4. 数据分析

注意：运行本节中的程序和脚本需要基于 Unix 的环境。请根据各软件的安装指南安装本方案中提到的软件。所有脚本均可在 https://sourceforge.net/projects/singlecellseqcnv/ 获取。

1. 使用 FASTX-Toolkit 0.0.13 版本中的 fastx_trimmer 将读段截剪至 40-nt¹⁷.
   fastx_trimmer -Q33 -i example.fastq -l 40 -o example.trim.fastq
2. 使用 BWA 0.6.1 版本及默认参数将测序读段比对至相应的参考基因组（小鼠为 mm9，人类为 hg19）¹⁸.
   bwa aln mm9.fa example.trim.fastq >example.sai
   bwa samse mm9.fa example.sai example.trim.fastq >example.sam
3. 去除与 chrM 和随机染色体的比对结果，然后使用 SAMTools 0.1.19 版本对生成的 BAM 文件进行排序和索引¹⁹.
   grep -v -w chrM example.sam | grep -v random >example.filtered.sam
   samtools view -uSh example.filtered.sam | samtools sort - example.filtered
   samtools index example.filtered.bam
4. 运行 HMMcopy 以检测 CNV²⁰
   1. 使用 HMMcopy 中的 gcCounter 为基因组生成 GC 百分比参考文件。使用选项 "- w 500000" 指定窗口大小。使用与步骤4.2中相同的fasta参考基因组文件版本，但需确保从fasta文件中移除chrM和随机染色体。
      gcCounter -w 500000 mm9.fa >mm9_gc.wig
   2. 使用 HMMcopy 中的 generateMap.pl 生成用于可映射性的 wiggle 文件。使用选项 "-w 40" 指定读长。使用步骤 4.4.1 中所用的同一 fasta 参考文件。
      generateMap.pl -b mm9.fa
      generateMap.pl -w 40 -i mm9.fa mm9.fa -o mm9.bigwig
   3. 使用 HMMcopy 中的 mapCounter 为基因组生成可比对性参考文件。使用选项 "-w 500000" 指定窗口大小。
      mapCounter -w 500000 mm9.bigwig >mm9_map.wig
   4. 使用 HMMcopy 中的 readCounter 为每个 BAM 文件生成 wiggle 文件。
      readCounter -w 500000 example.filtered.bam >input.wig
   5. 修改 R 脚本（run_hmmcopy.mm9.r 或 run_hmmcopy.hg19.r）中参考文件的路径，使用上文 4.4.1 步骤中生成的文件例如，mm9_gc.wig）和 4.4.3（例如，mm9_map.wig）分别赋值给变量 gfile 和 mfile，其中 gfile 指代 GC 含量参考文件，mfile 指代可比对性参考文件。然后运行提供的 R 脚本 "run_hmmcopy.mm9.r" 或 "run_hmmcopy.hg19.r".
      R CMD BATCH run_hmmcopy.mm9.r
      或
      R CMD BATCH run_hmmcopy.hg19.r
   6. 对于一组 BAM 文件的批量处理，将 BAM 文件放入同一个文件夹中，并运行提供的脚本 "HMMpipe.pl" 在软件包中调用片段并计算变异分数（VS）。遵循以下格式：
      perl HMMpipe.pl BAM文件所在文件夹 mm9
5. 运行 DNAcopy 以检测拷贝数变异（CNVs）²¹.
   1. 使用 SAMtools 0.1.19 版本从每个 BAM 文件中提取唯一比对的 reads。
      samtools view -h -F 0x0004 example.filtered.bam | egrep -i "^@|XT:A:U" |samtools view -Shu - >example.mapped.bam
   2. 使用 Picard 1.94 版本中的 MarkDuplicates 工具对标记 PCR 重复序列的 BAM 文件进行处理²².
      java -jar MarkDuplicates.jar INPUT=example.mapped.bam OUTPUT=example.nondup.bam METRICS_FILE=example.dup REMOVE_DUPLICATES=true
   3. 使用 bedtools 2.17.0 版本中的 coverageBed 工具，统计所提供 BED 文件中每个预定义的动态 500 kb 可比对窗口内的比对读段数量 "mm9.500k.dynamic.win.bed" 或 "hg19.500k.dynamic.win.bed"²³.
      coverageBed -abam example.nondup.bam -b mm9.500k.dynamic.win.bed -counts | sort -k1,1 -k2,2n >example.nondup.counts
   4. 使用提供的 Perl 脚本 "normalizeGC.pl" 根据提供的GC含量参考文件对读段数进行标准化 "mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt" 或 "hg19.500k.dynamic.win.fa.gc.txt".
      perl normalizeGC.pl mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt example.nondup.counts >example.bam.norm.counts
   5. 使用提供的 R 脚本 "dnacopy.r" 以标记这些片段。
      R CMD BATCH dnacopy.r
6. 识别CNVs
   1. 排除在4.4.6步骤中计算的VS值超过0.26的细胞。
   2. 过滤 HMMcopy 在 4.4.6 中调用的片段，仅保留中位数 log 满足条件的那些片段₂ 比值大于0.4（推测为扩增）或小于-0.35（推测为缺失）。
   3. 将4.5.5节中由DNAcopy识别出的片段进行筛选，仅保留片段均值大于1.32或小于0.6的片段。
   4. 将 4.6.2 和 4.6.3 步骤中的片段重叠，仅在 HMMcopy 与 DNAcopy 均识别出潜在扩增或潜在缺失的区域调用 CNV。

结果

组装好的吸管应与图1A中的吸管相似。针头的口径应足够宽，以容纳单个细胞，但又不能过宽，以免吸入过多液体伴随单个细胞。当在10倍物镜视野中存在1至5个细胞时（图1B），吸取单个细胞最为容易。

如果全基因组扩增成功，样品在琼脂糖凝胶上会呈现弥散条带（图2，泳道1、2、4、5、6和7）。条带微弱或缺失表明扩增反应失败，该样品不应进行测序（图2，泳道3和8）。

文库构建完成后，应使用片段分析仪通过毛细管电泳检测样品的片段大小分布。成功构建的文库在150至900 bp范围内应呈现相对均匀的片段大小分布（图3，A、B）。文库构建失败则会导致片段大小分布偏移，此类文库不应进行测序（图3C）。

通过隐马尔可夫模型（HMMcopy）和循环二进制分割（DNAcopy）处理测序数据，可将每个细胞的基因组划分为若干估计拷贝数的片段。随后可对这些片段进行筛选，以鉴定出估计拷贝数符合单个细胞中拷贝数增加或减少的片段（表1）。然后应将HMMcopy和DNAcopy获得的筛选后片段进行重叠分析，以识别高置信度的拷贝数变异（CNVs）。

图1. 单细胞分离。（A）组装好的微吸管装置。（B）10倍视野下显示解离的细胞（箭头所示）和微吸管针头（右下角）。当10倍视野中存在1至5个细胞时，最便于进行单细胞吸样。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2. 全基因组扩增。 对 5 µl 全基因组扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。成功扩增的样本会呈现从 100 bp 到 1 kb 的明亮涂布条带（第 1、2、4、5、6 和 7 泳道），可用于测序。扩增不成功的样本则产生微弱涂布条带或无条带（第 3 和 8 泳道），不应进行测序。请点击此处查看此图的放大版本。

图3. 文库制备。 片段分析仪的代表性结果。图中X轴表示片段大小（以bp为单位），Y轴表示相对荧光单位（RFU）。每个图右侧为模拟的凝胶泳道。（A）理想样本的结果，片段大小在150至900 bp之间分布均匀，无明显尖锐峰或偏向一侧的现象。该样本适用于测序。（B）可接受样本的结果，片段大小分布偏向较小片段。虽然并非最佳，但仍可用于测序。（C）失败样本的结果，主要为小片段。这可能是由于文库制备过程中片段化（tagmentation）步骤孵育时间过长所致。该样本不应进行测序。请点击此处查看该图的放大版本。

HMMcopy
样本	区段	染色体	起始位置	终止位置	状态	中位数
D15-4998	23	chr8	144,500,001	146,500,000	6	0.5008794
D15-4998	29	chr10	67,000,001	134,500,000	6	0.4031945
D15-4998	52	chr19	1	20,000,000	6	0.4616884
D15-4998	57	chrY	1	59,500,000	2	-1.506532
DNAcopy
样本	染色体	起始bin	终止bin	起始位置	终止位置	区段均值	区段中位数
D15-4998	chr10	88	197	62,612,945	129,971,511	1.4688	0.157
D15-4998	chr19	0	31	0	28,416,392	1.4141	0.1674
D15-4998	chrX	77	126	51,659,160	95,343,369	1.3548	0.1874
D15-4998	chrY	0	14	0	23,805,358	-2.7004	0.3591

表1. 数据分析。 由 HMMcopy 和 DNAcopy 从单个细胞生成的过滤片段。将这两个结果重叠后，显示出在染色体10上从67至130 Mb区域的扩增，以及染色体19上从0至20 Mb区域的扩增。我们发现，染色体19近端区域的扩增是单细胞测序的一种技术假象¹²。

讨论

传统上，在单细胞水平鉴定拷贝数变异（CNV）和非整倍性需要采用细胞学方法，例如荧光原位杂交（FISH）和光谱核型分析（SKY）。如今，单细胞测序已成为回答此类问题的替代方法。与FISH和SKY相比，单细胞测序具有全基因组覆盖和高分辨率的优势。此外，当应用适当的质控方法时，单细胞测序能够更可靠地评估CNV和非整倍性，因为它不受FISH和SKY固有的杂交效率和制片伪影的影响。然而，许多近期的单细胞测序应用尚未经过对方法和分析的敏感性与特异性进行充分评估。事实上，其他研究中使用的某些分析方法与较高的假阳性CNV检出率相关（>50%）¹²。我们所描述的方法已通过已知CNV负荷的细胞进行了严格验证，以确定真实发现率和假发现率，并优化CNV检测的敏感性和特异性¹²。采用本方案中所述的质控和分析方法，大约可检测到20%的5 Mb扩增、75%的5 Mb缺失，以及所有大于10 Mb的CNV。尽管确定单细胞测序假发现率较为困难，但我们估计其低于25%。本方案适用于多种来源的细胞，相关脚本可修改以调整CNV检测的分辨率，并且该方案也可进一步优化用于识别其他类型的基因组变异。

将新鲜组织解离为单细胞的方法有多种，许多文献描述了针对特定组织（如皮肤²⁴和脑组织²⁵）优化的实验流程。我们倾向于通过显微吸管法分离单细胞，因为该方法可对每颗待测序的细胞进行可视化评估。然而，也可采用荧光激活细胞分选（FACS）²⁶和微流控装置²⁷来分离单细胞。若手动进行单细胞分离与全基因组扩增，单次操作分离并扩增多达四十个细胞是可行的。为了获得高质量的单细胞测序数据，单细胞基因组的扩增必须均匀且完整。我们发现，所分离单细胞的质量以及裂解和扩增的效率对测序数据质量具有显著影响。因此，细胞应在分离前立即从其原始环境中获取，且在细胞分离后应立即开始全基因组扩增。此外，裂解与片段化步骤应严格依照步骤2.3–2.6中所述进行。

可以通过调整算法来改变拷贝数变异（CNV）检测的分辨率，但这会对灵敏度和特异性产生相反的影响¹²。还可以调整阈值，以在四倍体背景下检测全染色体非整倍性¹¹。然而，我们发现本方法仅能检测大于5 Mb的CNV，因为在全基因组扩增过程中引入的噪声使得较小变异的检测变得复杂¹²。未来全基因组扩增技术的改进将最终提升单细胞测序在拷贝数变异检测中的分辨率。

单细胞测序不仅可用于研究拷贝数变异，还可用于分析单核苷酸变异^28,29和结构变异³⁰。本研究中所述的单细胞分离方案也可应用于回答这些其他科学问题。然而，全基因组扩增方法的选择取决于具体的应用需求。本方案所描述的方法基于聚合酶链式反应，最适合用于检测拷贝数变异，因其扩增偏差水平较低³²。而对于其他类型的基因组变异（如单核苷酸多态性）的研究，则认为采用其他全基因组扩增方法更为合适^31,32。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
用于校准微毛细移液管的吸管组件	Sigma	A5177
PVC 管（内径 3/16"，外径 5/16"，约 1 英尺）	VWR	89068-500
PVC 管（内径 5/16"，外径 7/16"，约 6 英寸）	VWR	89068-508
带 HT Tuffryn 膜的 Acrodisc 注射器滤器（直径 25 mm，孔径 0.2 µm）	VWR	28144-040
血清移液管（5 mL）	BioExpress	P-2837-5	任何塑料 5 mL 移液管均可使用
用于氧气的在线水捕集器	Amazon.com	700220210813
毛细管熔点测定管（内径 0.8–1.1 mm，长度 100 mm）	VWR	34502-99
模型黏土	VWR	470156-850
培养皿（直径 150 mm）	VWR	25384-326	表面应为非粘附性，以利于单细胞的吸取
Hard-Shell 全高半裙边 96 孔 PCR 板	Bio-Rad	HSS9601	任何 96 孔 PCR 板均可使用
96 孔组织培养板	VWR	62406-081	任何 96 孔组织培养板均可使用
GenomePlex 单细胞全基因组扩增试剂盒	Sigma	WGA4
Microseal 'A' 密封膜	Bio-Rad	MSA5001
微型板旋转器	Thomas Scientific	1225Z37
热循环仪	Bio-Rad	1861096	只要能容纳 96 孔 PCR 板，任何热循环仪均可使用
Agencourt Ampure 磁珠	Beckman Coulter	A63880
Dynamag-2 磁力架	Thermo Fisher Scientific	12321D	任何类似的磁力管条均可使用
Nextera XT DNA 文库制备试剂盒	Illumina	FC-131-1096
Nextera XT Index 试剂盒	Illumina	FC-121-1012
完整试剂盒（优化用于 Roche LightCycler 480）	Kapa Biosystems	KK4845	该试剂盒针对 Roche LightCycler 480 实时 PCR 仪进行了优化。若使用其他仪器，请选用适用于该仪器的相应优化试剂盒。