通过透射电子显微镜可视化与分析膜相互作用蛋白的方法

摘要

许多蛋白质在结合到膜表面时发挥其功能。通过透射电子显微镜可间接观察外周蛋白与纳米盘膜的结合。我们发现，负染剂磷钨酸钠诱导纳米盘形成特征性堆叠（缗钱状结构）的现象，会因外周蛋白的结合而受到抑制。

摘要

单次跨膜蛋白在结合到膜表面时发挥其功能，此类相互作用依赖于特定的脂质组成以及具有足够空间以执行功能。纳米盘（nanodiscs）可用于提供具有可控尺寸和脂质成分的膜表面。在没有结合外周蛋白的情况下，经磷钨酸钠染色的纳米盘在透射电子显微镜（TEM）下从侧面观察时呈现为类似硬币堆叠的形态。因此，本实验方案旨在有意促进这种堆叠现象；相应地，若观察到堆叠被抑制，则可解释为膜结合蛋白已结合至纳米盘上。进一步地，可通过标准的单颗粒分析方法对蛋白-纳米盘复合物的TEM图像进行处理，获得低分辨率结构，为后续高分辨率冷冻电镜（cryoEM）研究提供基础。此外，纳米盘所提供的样品适用于透射电镜分析或非变性凝胶电泳。为演示该方法，本文展示了钙离子（Ca²⁺）诱导的5-脂氧合酶在纳米盘上的结合过程。

引言

在医学研究中，人们广泛关注参与多种脂质相互作用的膜蛋白，无论是内在膜蛋白还是外在膜蛋白。研究脂质相互作用蛋白时，通常需要选择脂质的替代物，例如去垢剂、两亲聚合物（amphipols）¹ 或小分子蛋白²，或者寻找能够保持蛋白可溶性和活性的膜替代系统。脂质膜替代物包括脂质体和纳米盘（nanodiscs, ND）^3,4。

Nanodiscs 是通过改造天然存在于血液中的高密度脂蛋白（HDL）的蛋白质组分 ApoA-1 而构建的近天然膜平台。ApoA-1 是一条由多个短两亲性 α-螺旋组成的 243 个残基长的肽链，具有无脂状态下的可溶性构象。体外条件下，当存在脂质时，两分子 ApoA-1 蛋白会自发重排，环绕在脂双层片段的疏水酰基链区域⁵。经过工程化改造的 ApoA-1 通常被称为膜支架蛋白（MSP），目前已有多种不同类型的 MSP 以质粒或纯化蛋白的形式商业化供应。通过在 ApoA-1 中重复或删除 α-螺旋结构，可以获得更长⁶或更短⁷的膜支架蛋白，从而能够形成直径约 6 nm

方案

1. 纳米盘的制备

1. 膜支架蛋白的表达与纯化^8,35
   1. 表达带有 His 标签的 MSP1E3D1 蛋白 E. coli BL21 (DE3) T1R pRARE2 菌株培养于锥形瓶中。使用添加50 µg/mL 卡那霉素的LB培养基，于37 °C培养50 mL过夜种子液。将过夜种子液接种至2 L添加50 µg/mL卡那霉素的优质肉汤（terrific broth）培养基中进行稀释培养。
   2. 在37 °C下培养细胞，直至600 nm处的光密度（OD₆₀₀）达到约3时，在18 °C下用0.5 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白表达3小时。
   3. 制备裂解缓冲液（100 mM Tris-HCl，pH 8.0；100 mM NaCl；10% 甘油）。使用前立即加入 1 mM TCEP。
   4. 在18 °C诱导3小时后，于4,500 × g离心10分钟（4 °C）收集细胞。弃上清液，称量收集的细胞，并按每克细胞加入2 mL裂解缓冲液的比例将细胞重悬于裂解缓冲液中。
   5. 采用脉冲超声处理裂解细胞（工作周期：开启4秒，关闭4秒），在80%振幅下持续3分钟。
   6. 在 49,000 × g 和 4 °C 条件下离心裂解液 20 分钟，弃去离心沉淀。....

结果

我们提出的方法依赖于制备纳米盘，以提供用于单向膜蛋白结合的膜表面。由于纳米盘的脂双层中未嵌入跨膜蛋白，因此此处将这些纳米盘称为“空纳米盘”（图2A）。该结构由两个MSP1E3D1支架蛋白和约260个POPC分子组成，其计算分子量为256 kDa⁸。采用此蛋白:脂质比例进行重组后，凝胶过滤过程中仅洗脱出一个主峰（图2A）。对洗脱体积约为9 mL的峰组分（图2A）进行蓝色天然凝胶电泳分析⁴⁹，结果显示仅有一条条带（图2B，泳道1）。尽管该条带对应的分子大小略大于计算值256 kDa，但在透射电镜图像中测得的纳米盘直径与预期的13 nm ± 0.5 nm相符。

单次跨膜蛋白5-脂氧合酶（5LO）的纯化步骤如上文（方案步骤2）及先前.......

讨论

该方法可分为三个部分：空纳米盘的重建、蛋白质-纳米盘复合物的制备，以及这些复合物用于透射电子显微镜观察的负染色。以下将分别针对该技术的局限性、关键步骤和有用的改进方法进行阐述。

空纳米盘的重建。纳米盘制备与使用过程中的关键步骤及局限性。

在制备空纳米盘时，优化膜支架蛋白（MSP）与脂质的比例至关重要。对于最常见的MSP和脂质（使用胆酸盐作为去垢剂），文献中已有针对最佳比例的建议例如， 每分子MSP1E3D1含有125至130个POPC分子^8,51 在本方案中使用）。与已发表比例的差异可能取决于蛋白质浓度测定方法、脂质在去垢剂中溶解的效率，以及从溶液中去除去垢剂的方法。

我们建议使用疏水珠进行去垢剂去除⁴⁸（步骤1.3），可能的替代方法包括透析或添加环糊精⁵²

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
透射电子显微镜：JEOL2100F	JEOL
CCD相机	Tiez Video and Imaging Processing System GmbH，德国
电晕放电器	Baltec
透射电镜载网：400目	TAAB	GM016/C
尺寸排阻色谱柱：Agilent SEC-5	Agilent Technologies	5190-2526
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare Life Sciences	17-5172-01
质粒：MSP1E3D1	Addgene	20066
细菌：BL21DE3	NEB	C2527H
细菌：BL21 (DE3) T1R pRARE2	Protein Science Facility, KI, Solna
纯化介质：ATP琼脂糖	Sigma Aldrich	A2767
纯化介质：HisTrap HP-5 mL	GE Healthcare Life Sciences	17-5247-01
脂质：POPC	Avanti polar lipids	850457C	氯仿中浓度为25 mg/mL
疏水珠：Bio-Beads，SM-2树脂	Bio-Rad	1523920
13 mm注射器滤器：0.2 μm	Pall life sciences	PN 4554T
染色剂：三碱基钨酸钠水合物	Sigma Aldrich	31648
2-巯基乙醇	Sigma Aldrich	M3148-250ML
十二烷基硫酸钠（SDS）	Bio-Rad	161-0301
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma Aldrich	4693132001
TCEP	Sigma Aldrich	646547
去垢剂：胆酸钠水合物	Sigma Aldrich	C6445-10G
胆酸钠			500 mM 胆酸钠。用超纯水重悬后，于 -20 °C 保存。
脂质储备液			50 mM POPC，100 mM 胆酸钠，20 mM Tris-HCl（pH 7.5），100 mM NaCl。 氮气吹扫后，4 °C 可保存一周；或 -80 °C 可保存一个月。
MSP标准缓冲液			20 mM Tris-HCl，pH 7.5，100 mM NaCl，0.5 mM EDTA。 4 °C 保存。
非变性电泳阳极缓冲液	Thermo Fisher Scientific	BN2001	50 mM Bis-Tris，50 mM Tricine，pH 6.8
非变性电泳阴极缓冲液	Thermo Fisher Scientific	BN2002	50 mM Bis-Tris，50 mM Tricine，pH 6.8，0.002% 考马斯亮蓝G-250
非变性电泳4倍上样缓冲液	Thermo Fisher Scientific	BN2003	50 mM Bis-Tris，pH 7.2，6 N HCl，50 mM NaCl，10% (w/v) 甘油，0.001% 丽春红S
变性电泳运行缓冲液			实验室配方：25 mM Tris-HCl，pH 6.8，200 mM 甘氨酸，0.1% (w/v) SDS
变性电泳5倍上样缓冲液			实验室配方：0.05% (w/v) 溴酚蓝，0.2 M Tris-HCl，pH 6.8，20% (v/v) 甘油，10% (w/v) SDS，10 mM 2-巯基乙醇
优质肉汤培养基（Terrific broth）			胰蛋白胨 - 12.0 g，酵母提取物 - 24.0 g，100 mL 0.17 M KH2PO4 和 0.72 M K2HPO4，甘油 - 4 mL。 胰蛋白胨、酵母提取物和甘油加至900 mL，分别灭菌。KH2PO4 和 K2HPO4 分别配制并单独灭菌。使用前将两者混合。