方法可视化和用透射电子显微镜分析膜蛋白的相互作用

Summary

许多蛋白质在附着在膜表面时发挥其功能。纳米盘膜上的外源性蛋白质的结合可以通过透射电子显微镜间接成像。我们表明，由负染色磷钨酸钠诱导的纳米圆盘的特征堆叠 （rouleau） 被外源性蛋白的结合所阻止。

Abstract

单位蛋白在附着在膜表面时发挥其功能，这种相互作用取决于特定的脂质组成和执行该功能的足够区域的可用性。纳米圆盘用于提供尺寸和脂质含量受控的膜表面。在没有结合的外源性蛋白的情况下，通过透射电子显微镜 （TEM） 从侧面观察时，磷酸钨酸钠染色的纳米圆盘看起来像一堆硬币。因此，该协议旨在有意促进堆叠;因此，防止堆积可以解释为膜结合蛋白与 Nanodisc 的结合。在下一步中，蛋白质-纳米盘复合物的 TEM 图像可以用标准的单颗粒方法处理，以产生低分辨率结构，作为更高分辨率 cryoEM 工作的基础。此外，纳米圆盘可提供适用于 TEM 或非变性凝胶电泳的样品。为了说明该方法，提出了 Ca²⁺ 诱导的 5-脂氧合酶在纳米圆盘上的结合。

Introduction

在医学研究中，许多注意力集中在膜蛋白，无论是内在的或外在的，参与多种脂质的相互作用。与脂相互作用的蛋白质的工作包括任一选择的替代给脂质，如清洁剂，amphipols ^1，或小蛋白质^2，或发现的膜替代，保持该蛋白的可溶性和活性。硫辛酸膜替代品包括脂质体和纳米圆盘^{（ND）3,4。}

纳米圆盘是通过改造蛋白的一部分，载脂蛋白A-1，高密度脂蛋白（HDL）在血液天然存在的开发近天然膜的平台。载脂蛋白A-1是243残留长的短的两亲性α螺旋链，并有一个免费的脂溶性构象。 在体外 ，当在脂质的存在下，蛋白质的ApoA-1的两个副本自发重新排列以环绕HYDR脂质双层补丁⁵ ophobic酰基链部。的ApoA-1的工程化的版本通常被称为膜支架蛋白（MSP），以及越来越多的是可商购的质粒或纯化的蛋白质。在⁶较长或较短的⁷膜支架蛋白重复或α螺旋的缺失载脂蛋白A-1的结果。这又使得能够形成大约6毫微米光盘⁷至17纳米的直径⁸英寸有不同类型....

Protocol

1.纳米圆盘的制备

1. 表达和膜支架蛋白⁸的纯化^，35
   1. 表达在大肠杆菌 BL21的His-标记MSP1E3D1（DE3）中T1R pRARE2应变在烧瓶中。准备与在37℃下补充有50微克/毫升卡那霉素的LB培养基的50mL过夜起始培养。稀释过夜起始培养在2L补充50微克/毫升卡那霉素了不起的肉汤培养基。
   2. 生长的细胞在37℃，直至在600nm（OD _600）的光密度在18℃达到约3.诱导用0.5mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）为3小时的蛋白的表达。
   3. 制备裂解缓冲液（100mM的Tris-HCl，pH值8.0; 100毫摩尔NaCl; 10％甘油）。临用前加1毫米TCEP。
   4. 在18℃诱导3小时后，收获，离心所述细胞10分钟，在4500 xg离心和4℃。弃去上清液，称重收获的细胞，并在裂解缓冲液以每克细胞的2裂解毫升缓冲液中的比例重新悬浮它们。
   5. 裂解的细胞用脉冲超声处理（重复率:4秒开，4秒OFF）为3分钟，在80％的幅度。
   6. 离心20分钟的裂解物在49000 xg离心和4℃。舍弃这个离心沉淀。
   7. 注入上清液成5毫升镍⁺螯合柱连接到自动化液体色谱系统优选保持在4℃。
   8. 洗脱步骤（步骤1.1.9）之....

Results

我们提出的方法，取决于制备纳米圆盘提供monotopic膜蛋白结合膜表面。因为有嵌入到纳米圆盘脂质双层无跨膜蛋白，所述纳米圆盘在这里表示为"空纳米圆盘"（ 图2A）。这些具有256 kDa的计算分子量两个MSP1E3D1骨架蛋白和大约260 POPC ⁸的分子的组合物。使用这种蛋白质:用于重建脂质比，一个主要的峰（ 图2A）的凝胶过滤中洗脱。约9毫升（ 图2A）的峰级分用蓝色天然凝胶电泳⁴⁹检查，示出一个频带（ 图2B，泳道1）。虽然带对应于一个尺寸比计算256 kDa的略大一些，在TEM图像测量的纳米圆盘直径对应于预计13纳米±0.5纳米。

如前面^35的上方（协议步骤2），并.......

Discussion

该方法可以被分为三个部分:空纳米圆盘的重组，制备蛋白质 - 纳米圆盘复合物，以及用于这些配合物的TEM的阴性染色。每个部分将分别关于该技术，关键步骤，和有用的改进的局限性来解决。

空纳米圆盘重建。关键步骤和限制在生产和使用纳米圆盘。

为空的纳米圆盘的制备中，有必要优化MSP与脂质的比例。对于最常见的MSP和脂质（使用胆作为洗涤剂），为最佳比率建议可以在文献中找到（ 例如，125 -每MSP1E3D1 ^8，51 130 POPC在本协议中使用）。差异获得的相比已发布比率可取决于用于蛋白质浓度测定，升效率的方法IPID溶剂化在洗涤剂，并从溶液中去除清洁剂的方法。

我们提出使用疏水珠^48（步骤1.3）来执行的洗涤剂除去，而可能的替代方案是透析或添加环糊精

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
透射电子显微镜：JEOL2100F	JEOL
CCD 相机	Tiez Video and Imaging Processing System GmbH，德国
辉光放电器	Baltec
TEM 网格：400 目	TAAB	GM016/C
尺寸排阻色谱：Agilent SEC-5	Agilent Technologies	5190-2526
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare Life Sciences	17-5172-01
质粒：MSP1E3D1	Addgene	20066
细菌：BL21DE3	NEB	C2527H
细菌：BL21 （DE3） T1R pRARE2	蛋白质科学设施，KI，Solna
纯化基质：ATP 琼脂糖	Sigma Aldrich	A2767
纯化基质：HisTrap HP-5 mL	GE Healthcare Life Sciences	17-5247-01
脂质：POPC	Avanti 极性脂质	850457C	25 mg/mL 在氯仿中
疏水珠：Bio-Beads、SM-2 树脂	Bio-Rad	1523920
13 mm 针式过滤器：0.2 μm	颇尔生命科学	PN 4554T
染色剂：磷钨酸钠三水合	Sigma Aldrich	31648
2-巯基乙醇	Sigma Aldrich	M3148-250ML
十二烷基硫酸钠 （SDS）	Bio-Rad	161-0301
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma Aldrich	4693132001
TCEP	Sigma Aldrich	646547
洗涤剂：胆酸钠水合	Sigma Aldrich	C6445-10G
胆酸			500 mM 胆酸钠。重悬于 miliQ 水中，并储存在 -20 °C 下。
脂质储备			50 mM POPC、100 mM 胆酸钠、20 mM Tris-HCl pH 7.5、100 mM NaCl。储存在 4 °C 一周;或 Store -80 °C 放置一个月，然后用氮气吹扫溶液。
MSP 标准缓冲液			20 mM Tris-HCl，pH 7.5,100 mM NaCl，0.5 mM EDTA。 在 4 &°C 下储存。
非变性电泳阳极缓冲液	Thermo Fisher Scientific	BN2001	50 mM Bis-Tris，50 mM Tricine，pH 6.8
非变性电泳阴极缓冲液	Thermo Fisher Scientific	BN2002	50 mM Bis-Tris，50 mM Tricine，pH 6.8,0.002% 考马斯 G-250
非变性电泳 4x 样品上样缓冲液	Thermo Fisher Scientific	BN2003	50 mM Bis-Tris，pH 7.2,6 N HCl，50 mM NaCl，10% （w/v） 甘油，0.001% 丽春红 S
变性电泳运行缓冲液			内部配方：25 mM Tris-HCl，pH 6.8,200 mM 甘氨酸，0.1% （w/v） SDS
变性电泳 5x 样品上样缓冲液			内部配方：0.05% （w/v） 溴酚蓝，0.2 M Tris-HCl，pH 6.8,20% （v/v） 甘油， 10% （w/v） SDS，10 mM 2-巯基乙醇
好的肉			胰蛋白胨 - 12.0 g，酵母提取物 - 24.0 g，100 mL 0.17 M KH2PO4 和 0.72 M K2HPO<>4， 甘油 - 4 mL. 胰蛋白胨、酵母提取物和甘油制备至 900 mL 并分别高压灭菌。分别制备 KH2PO4 和 K2HPO4 并进行高压灭菌。在使用培养基之前，两者均已混合。