本文介绍了一种1,2-氮硼杂苯的合成方法及其与T4溶菌酶突变体蛋白复合物的制备方案。
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本文内容
摘要
摘要
我们描述了一种采用标准无水无氧技术合成1,2-氮杂硼杂苯的方法，以及通过蒸汽扩散法制备T4溶菌酶突变体蛋白复合物的流程。对氧气和湿气敏感的化合物需在惰性气氛（N₂）下进行制备和分离。2）使用真空气体操作装置或手套箱。作为氮杂硼杂苯合成的一个示例，我们演示了该挥发性物质的合成与纯化 N- H -B-乙基-1,2-氮杂硼杂苯通过五步反应序列制备，涉及蒸馏和柱层析以分离产物。T4溶菌酶突变体L99A和L99A/M102Q的表达采用 大肠杆菌 RR1 菌株。采用化学法裂解细胞后，通过羧甲基离子交换柱纯化，可获得纯度足以用于结晶的蛋白质。蛋白质结晶采用悬滴 vapor diffusion 法，在不同浓度的沉淀剂和不同 pH 范围内进行。小分子复合物的制备在惰性气氛下通过 vapor diffusion 法完成。对晶体复合物进行 X 射线衍射分析，可明确提供蛋白质结合位点与 1,2-氮硼杂萘之间结合相互作用的结构证据。
引言
含硼-氮的杂环化合物（即 1,2-氮杂硼杂苯）近年来作为芳环的生物电子等排体引起了广泛关注。这种电子等排性可促进现有结构基元的多样化，从而拓展化学空间2,3,4。氮杂硼杂苯在生物医学研究中具有潜在应用价值5,6,7,8，尤其在药物化学领域，化学家常需合成结构和功能相关分子的化合物库。然而值得注意的是，尽管目前已有大量成熟的合成方法可用于制备含芳环的分子，但关于氮杂硼杂苯的合成方法报道却十分有限9,10,11,12,13。这主要归因于合成起始阶段硼源选择有限，且该类分子对空气和水分高度敏感。
本文的第....
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方案
注意：所有对氧气和湿气敏感的操作均在惰性气氛（N2）下进行，采用标准无水无氧操作技术或在手套箱中完成。四氢呋喃（THF）、乙醚（Et2O）、二氯甲烷（CH2Cl2）、甲苯和戊烷通过氩气保护下的中性氧化铝柱纯化。乙腈在氢化钙（CaH2）中干燥后，在氮气气氛下蒸馏后使用。Pd/C（钯碳催化剂）在使用前于100 °C高真空条件下加热12小时。硅胶（230–400目）在高真空下于180 °C干燥12小时。快速柱色谱在此硅胶上于惰性气氛下进行。其余所有化学品和溶剂均直接购买后使用，未经进一步处理。
注意：请在使用前查阅所有相关的材料安全数据表（MSDS）。合成过程中使用的多种化学品具有急性毒性和致癌性。
1. 1,2-氮杂硼杂苯的制备
注意：本研究中所有化合物的表征数据此前已有报道12, 13, 16。
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结果
1,2-氮杂硼杂苯的示意图合成路线如图1所示。本方案适用于五种不同含硼-氮分子的合成。图2展示了在步骤1.3过程中测得的11B核磁共振谱，用于监测目标产物（3）的生成。蛋白质纯化采用低压色谱系统进行，典型的色谱图如图3所示。收集组分的纯度通过SDS-PAGE测定。T4溶菌酶突变体L99A的晶体结构如图4所示。图5展示了L99A的结合口袋，包含未建模的电子密度，以及配体5结合后经精修的结合空腔。
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讨论
在本实验方案的第一部分中，我们描述了一种基于先前报道方法改进的1,2-氮杂硼杂苯合成方法12, 13三烯丙基硼烷22 被用作替代烯丙基三苯基锡或烯丙基三氟硼酸钾路线以制备 N-烯丙基-NTBS-缓冲液B-烯丙基氯加合物（1）。该方法实现了更高的原子经济性，并且对环境更加友好。适用于以下合成： N-TBS-B-Cl-1,2-氮杂硼杂苯（3），采用了一锅法两步反应序列（关环复分解反应后接氧化反应），其分离产率高于先前涉及中间体分离的方法（2）（两步反应产率分别为52%和29%）。 （然而，产率取决于加合物的纯度（1），在氧化步骤之前可能需要通过减压蒸馏分离环化产物。此时，使用二氯甲烷代替甲苯作为溶剂，可缩短蒸馏前去除挥发性物质所需的时间。）监测 .......
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披露
所有作者声明本稿件不存在竞争性经济利益。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院普通医学科学研究所（NIGMS，资助号：R01-GM094541）和波士顿学院资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 四氢呋喃（THF），无抑制剂，用于高效液相色谱 ≥99.9% | Sigma Aldrich | 34865 | |
| 乙醚（Et2高效液相色谱用 ≥99.9%，无抑制剂 | Sigma Aldrich | 309966 | |
| 二氯甲烷 (CH2Cl2），（稳定化/认证ACS） | Fisher | D37-20 | |
| 甲苯 | Fisher | T290-4 | |
| 戊烷，HPLC | Fisher | P399-4 | |
| 乙腈 | Fisher | A21-4 | |
| 氢化钙（CaH2），试剂级，95% | Sigma Aldrich | 208027 | 易燃的 |
| 活性炭负载钯（Pd/C），10 wt% Pd | Strem | 46-1900 | |
| 1.0 M 三氯化硼己烷溶液 | Sigma Aldrich | 211249 | 剧毒/自燃性 |
| 三乙胺 ≥99.5% | Sigma Aldrich | 471283 | |
| 格拉布斯 1st 生成催化剂 | 材料 | C823 | |
| 乙酰胺 | Sigma Aldrich | A0500 | |
| 正丁醇，无水，99.8% | Sigma Aldrich | 281549 | |
| 乙基锂溶液，0.5 苯/环己烷中的 M 浓度 | Sigma Aldrich | 561452 | 剧毒/自燃性 |
| 2.0 M HCl溶液，溶于Et2O | Sigma Aldrich | 455180 | |
| 2-甲基丁烷，无水 ≥99% | Sigma Aldrich | 277258 | |
| 大肠杆菌，（Migula）Castellani 和 Chalmers（ATCC® 31343™) | ATCC | 31343 | |
| T4溶菌酶野生型*（L99A） | Addgene | 18476 | |
| T4溶菌酶突变体（S38D L99A M102Q N144D） | Addgene | 18477 | |
| 氨苄青霉素钠盐 | Sigma Aldrich | A0166 | |
| 异丙基-β异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG） | Invitrogen | AM9464 | |
| 无水磷酸二氢钠 | Fisher | BP329 | |
| 无水磷酸氢二钠 | Fisher | BP332 | |
| 氯化钠 | Fisher | S642212 | |
| 乙二胺四乙酸 | Fisher | BP118 | |
| 氯化镁 | Sigma Aldrich | M4880 | 腐蚀性 |
| Thermo Scientific Pierce DNase I | Fisher | PI-90083 | |
| GE Healthcare Sepharose Fast Flow 阳离子交换介质 | Fisher | 45-002-931 | |
| Tris碱 | Fisher | BP152-500 | |
| 叠氮化钠 | TCI | S0489 | 剧毒 |
| 2-巯基乙醇 | Fisher | ICN806443 | |
| 赛多利斯 Vivaspin 20 离心浓缩管 | Fisher | 14-558-501 | |
| 磷酸二氢钾 | Sigma Aldrich | P5379 | |
| 2-羟乙基二硫化物 | Sigma Aldrich | 380474 | |
| N-对甲苯磺酰基对氨基苯甲酸 | Hampton Research | HR2-643 | |
| 4 RC 透析膜管，12,000 至 14,000 道尔顿截留分子量 | Fisher | 08-667E | |
| CryoLoop | Hampton Research | 环形低温管 | |
| CryoTong | 赛默飞世尔科技 | 低温钳 | |
| Coot | 电子密度图像是由软件生成的 |
参考文献
- Ducruix, A., Giége, R. Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, A Practical Approach. , IRL Press. Oxford, UK, New York. (1992).
- Bosdet, M. J. D., Piers, W. E. B-N as a C-C substitute in aromatic systems. Can. J. Chem. 87 (1), 8-29 (2009).
- Campbell, P. G., Marwitz, A. J., Liu, S. -Y.
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