本文介绍了一种1,2-氮硼杂苯的合成方法及其与T4溶菌酶突变体蛋白复合物的制备方案。
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本文内容
摘要
摘要
我们描述了一种采用标准无水无氧技术合成1,2-氮杂硼杂苯的方法，以及通过蒸汽扩散法制备T4溶菌酶突变体蛋白复合物的流程。对氧气和湿气敏感的化合物需在惰性气氛（N₂）下进行制备和分离。2）使用真空气体操作装置或手套箱。作为氮杂硼杂苯合成的一个示例，我们演示了该挥发性物质的合成与纯化 N- H -B-乙基-1,2-氮杂硼杂苯通过五步反应序列制备，涉及蒸馏和柱层析以分离产物。T4溶菌酶突变体L99A和L99A/M102Q的表达采用 大肠杆菌 RR1 菌株。采用化学法裂解细胞后，通过羧甲基离子交换柱纯化，可获得纯度足以用于结晶的蛋白质。蛋白质结晶采用悬滴 vapor diffusion 法，在不同浓度的沉淀剂和不同 pH 范围内进行。小分子复合物的制备在惰性气氛下通过 vapor diffusion 法完成。对晶体复合物进行 X 射线衍射分析，可明确提供蛋白质结合位点与 1,2-氮硼杂萘之间结合相互作用的结构证据。
引言
含硼-氮的杂环化合物（即 1,2-氮杂硼杂苯）近年来作为芳环的生物电子等排体引起了广泛关注。这种电子等排性可促进现有结构基元的多样化，从而拓展化学空间2,3,4。氮杂硼杂苯在生物医学研究中具有潜在应用价值5,6,7,8，尤其在药物化学领域，化学家常需合成结构和功能相关分子的化合物库。然而值得注意的是，尽管目前已有大量成熟的合成方法可用于制备含芳环的分子，但关于氮杂硼杂苯的合成方法报道却十分有限9,10,11,12,13。这主要归因于合成起始阶段硼源选择有限，且该类分子对空气和水分高度敏感。
本文的第一部分将描述使用标准无水无氧技术对N-TBS-B-Cl-1,2-氮杂硼烯（3）进行多克级合成的方法。该化合物是一种多功能的中间体，可进一步官能化生成结构更复杂的分子14,15。以化合物3为起始原料，本文还将描述用于蛋白质结合研究的N-H-B-乙基-1,2-氮杂硼烯（5）的合成与纯化过程。由于5具有挥发性，其高效分离需要对反应温度、反应时间和蒸馏条件进行精确控制。
在第二部分，将介绍T4溶菌酶突变体（L99A和L99A/M102Q）17,18,19,20的蛋白表达与分离纯化方案，随后介绍蛋白结晶及蛋白-配体晶体复合物的制备。选择T4溶菌酶突变体L99A和L99A/M102Q作为生物模型系统，用于研究含N-H键的氮杂硼杂苯分子的氢键形成能力17。采用标准的分子生物学方法，在大肠杆菌（Escherichia coli）RR1菌株中表达蛋白，并用异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）诱导表达。通过离子交换柱层析法进行蛋白纯化。采用悬滴气相扩散法进行蛋白结晶，所用蛋白溶液为高浓度且高度纯化的蛋白（经凝胶电泳检测纯度>95%）。由于本研究中所用配体对氧气敏感，蛋白-配体复合物的制备需在无氧条件下进行。
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方案
注意：所有对氧气和湿气敏感的操作均在惰性气氛（N2）下进行，采用标准无水无氧操作技术或在手套箱中完成。四氢呋喃（THF）、乙醚（Et2O）、二氯甲烷（CH2Cl2）、甲苯和戊烷通过氩气保护下的中性氧化铝柱纯化。乙腈在氢化钙（CaH2）中干燥后，在氮气气氛下蒸馏后使用。Pd/C（钯碳催化剂）在使用前于100 °C高真空条件下加热12小时。硅胶（230–400目）在高真空下于180 °C干燥12小时。快速柱色谱在此硅胶上于惰性气氛下进行。其余所有化学品和溶剂均直接购买后使用，未经进一步处理。
注意：请在使用前查阅所有相关的材料安全数据表（MSDS）。合成过程中使用的多种化学品具有急性毒性和致癌性。
1. 1,2-氮杂硼杂苯的制备
注意：本研究中所有化合物的表征数据此前已有报道12, 13, 16。
图1：1,2-氮杂硼杂苯的合成路线。 各化合物（1-5）的详细合成方案见实验步骤部分。 请点击此处查看该图的放大版本。
- 制备 N-烯丙基-NTBS缓冲液B-烯丙基氯加合物（1)
- 在手套箱中，称取 6.70 g（50.0 mmol）三烯丙基硼烷22 放入一个经烘箱干燥的配有搅拌子的24/40接口1 L圆底烧瓶中，加入250 mL二氯甲烷。用橡胶隔膜密封烧瓶。在箱外将溶液冷却至-78 °C 在真空气体操作台上，于氮气氛围中进行。
- 将100 mL 1.00 M 三氯化硼己烷溶液（100 mmol）加入三烯丙基硼烷溶液中，温度保持在 -78 °C 通过套管转移。让反应混合物在此温度下搅拌4小时。
注意：氯化硼三（BCl₃）遇水剧烈反应，需谨慎操作。 - 在另一个100 mL的烧瓶中，称取25.7 g N-(t-丁基二甲基硅基)-N-烯丙基胺（150 mmol），加入20.0 mL二氯甲烷。通过套管转移将此溶液加入1 L反应瓶中，保持反应温度在-78 °C.
- 加入21.0 mL三乙胺（150 mmol）至反应体系中。在氮气正压下持续搅拌，并于室温下静置过夜，使反应逐渐升温至室温。
- 搅拌18小时后，使用高真空（300–500 mTorr）和液氮捕集装置，通过真空气体多通管去除约一半的溶剂。
- 将反应烧瓶转移至手套箱中，通过装有烘箱干燥的中等孔隙度烧结玻璃漏斗、24/40 真空接头和带搅拌子的 24/40 500 mL 圆底烧瓶，过滤除去反应混合物中生成的白色盐。使用二氯甲烷转移所有残留物质。
- 使用高真空气体歧管在通风橱外除去滤液中残留的所有挥发性物质。
- 在手套箱中，将浓缩后的反应混合物转移至一个已烘干的14/20接口100 mL圆底烧瓶中，烧瓶内放入搅拌子，用于后续蒸馏。用隔膜盖紧烧瓶。
- 在氮气氛围下，迅速打开隔垫，加入200 mg氢化钙作为干燥剂。
- 安装蒸馏装置：将一个经烘箱干燥的14/20标准磨口蒸馏头连接至装置，蒸馏头上配有温度计，一侧连接14/20标准磨口的50 mL无水接收瓶，另一侧连接盛有粗产物的100 mL烧瓶。在蒸馏头上通入冷却水。（蒸馏装置的所有接口均需涂抹真空脂。）
注意：当蒸气温度达到时，产物开始蒸馏 60 °C 在 300 mTorr 下。 - 继续通过升高油浴温度来收集产物，直至蒸馏头温度计读数达到 75 °C.
注意：该产品为无色透明液体。 - 移去热源以停止蒸馏，并在储存前将装置冷却至室温。冷却后，用氮气重新加压装置，并紧密关闭无水储存瓶上的插塞阀。将分离得到的产物储存在手套箱冰箱中。
注：产率可能在65%至84%之间波动。
- 制备 NTBS缓冲液B-Cl 环化产物（2)
- 在手套箱中，称取 56.0 g N-烯丙基-N-TBS-B-烯丙基氯加合物（1) (217 mmol) 置于经烘箱干燥的 24/40 接口 1 L 圆底烧瓶中，加入搅拌子，再加入 500 mL 甲苯。
- 称取 1.79 g Grubbs 1st 生成催化剂（2.17 mmol）。
- 在手套箱中，将催化剂分批加入室温下搅拌的1号溶液中。在加入过程中对手套箱进行吹扫，以除去反应生成的乙烯气体。
注意：反应通常在气体停止逸出后30分钟内完成。作为反应完成的另一指示，反应液颜色会从最初的紫色完全变为棕色。此时可通过减压蒸馏分离产物；具体操作详见参考文献12。本方案采用一锅法、两步反应，直接合成 3 被描述。
- 制备 NTBS-B-Cl-1,2-氮杂硼杂苯3)
- 向环化产物的反应溶液中2) 溶于甲苯中，加入14.0 g 钯碳（10 wt% Pd，13.2 mmol）。
- 从盒子中取出烧瓶，并安装一个经氮气吹扫并连接冷凝水的已烘干的24/40回流冷凝管。
- 使用油浴加热反应至剧烈回流状态 135 °C 同时搅拌。
- 回流保持16小时后，将烧瓶从油浴中取出以冷却反应。冷却至室温后，使用配有经烘箱干燥的鲁尔锁针头的注射器从反应混合物中取出0.5 mL等分试样。将0.5 mL等分试样转移至螺口核磁共振管中，用于分析 11B 核磁共振12.
注意：目标产物峰出现在 约 35.5 ppm12，而起始原料峰出现在 ca42.9 ppm12通常在此时 11¹¹B NMR 表明反应不完全，仍有少量起始原料峰存在。 - 若反应不完全，将反应瓶转移至手套箱中，并加入额外的3.00 g碳载钯（10 wt% Pd，2.82 mmol）。
- 按照1.3.2和1.3.3中所述条件，将反应再次置于回流条件下进行。
- 回流反应继续进行24小时后，取另一份反应液进行分析 11B 核磁共振。此时，反应应已完全。
- 将反应烧瓶转移至手套箱中，将反应混合物通过装有纸巾的 disposable flash chromatography 柱进行过滤。用 50.0 mL 甲苯洗涤，收集滤液。
- 在配备高真空装置的真空气体操作台上，将滤液中的所有挥发性物质从箱外去除。
注意：去除挥发性溶剂所需时间取决于真空压力，通常为40至90分钟。当真空表显示压力达到最大值时，表明溶剂已完全去除。在去除溶剂过程中，确保烧瓶下方的水浴保持在室温，以利于散热。 - 在手套箱中，将浓缩的反应混合物转移至一个已烘干的24/40接口250 mL圆底烧瓶中，烧瓶内放置磁力搅拌子。用隔膜密封烧瓶。
- 迅速移去隔膜，加入200 mg氢化钙作为干燥剂。
- 安装蒸馏装置，连接一个经烘箱干燥的24/40标准磨口蒸馏头，蒸馏头上配有温度计，一侧连接24/40标准磨口的100 mL无水储存接收瓶，另一侧连接盛有粗产物的100 mL圆底烧瓶。将蒸馏头通入冷却水进行冷却。蒸馏装置各磨口连接处均需涂抹真空脂。
注意：当蒸气温度达到65至 70 °C 在1,000 mTorr下，油浴温度保持在90–100 °C产品为澄清无色液体。 - 移去热源以停止蒸馏，并在储存前将装置冷却至室温。冷却后，用氮气重新加压装置，并紧密关闭无水储存瓶上的插塞阀。将分离得到的产物储存在手套箱冰箱中，温度为 -30 °C.
注意：一锅法两步反应的产率为52%。
图2： 11通过B核磁共振谱监测形成过程 NTBS-B-Cl-1,2-氮杂硼杂苯（3）。A) N烯丙基-N-TBS-B-烯丙基氯加合物（1环化复分解反应的起始原料。 B16小时后的氧化反应。（未反应） NTBS缓冲液B-Cl 环化产物（2）并发生异构化 B-乙烯基环化产物（2'）以及 N-TBS-B-Cl-1,2-氮杂硼杂苯3如图所示。 C) 额外培养24小时后的氧化反应。 D) 分离产物（3经真空蒸馏纯化后。 请点击此处以查看此图的放大版本。
- 制备 N- H -B-OBu-1,2-氮杂硼杂苯4)
- 在手套箱中，称取 4.00 g N-TBS-B-Cl-1,2-氮硼杂苯 (3)（17.6 mmol）置于装有搅拌子的烘干100 mL圆底烧瓶中，加入35 mL乙腈。称取1.14 g乙酰胺（19.3 mmol）并转移至反应烧瓶中。用橡胶隔膜密封烧瓶。
- 将反应烧瓶从手套箱中取出，并安装一个经氮气吹扫并连接冷水循环的烘干过的24/40回流冷凝管。
- 将反应加热至回流 85 °C 在油浴中搅拌。
- 回流反应3小时后，将烧瓶从油浴中取出以冷却反应。冷却至室温后，使用配备高真空系统的真空气体分配装置除去溶剂。
- 在真空下去除挥发性物质后，将反应残余物重新溶解于15.0 mL THF中。向该溶液中加入3.21 mL n-丁醇（35.1 mmol）。
- 室温下搅拌反应1小时。
- 在配备高真空装置的真空气体操作台上除去溶剂，得到粗产物。
- 在手套箱中，通过硅胶柱色谱法分离产物，以戊烷与乙醚（5:1）的混合液为洗脱剂。使用配备高真空的真空气体分配装置，除去含产物馏分中的挥发性物质，得到白色固体状的纯产物。
注：产率可能在82%至87%之间波动。
- 制备 N- H -B-乙基-1,2-氮杂硼杂苯（5)
- 在手套箱中，称取 1.00 g N-H- B -OBu-1,2-氮杂硼杂苯4)（6.62 mmol）置于经烘箱干燥的100 mL圆底烧瓶中，加入搅拌子，再加入25 mL Et2O. 用橡胶隔垫密封烧瓶，并置于 N₂ 氛围下2 在真空气体操作台上。
- 在另一个烘干的100 mL圆底烧瓶中，于氮气氛围下加入26.5 mL乙基锂溶液（0.5 M，溶于苯/环己烷，13.2 mmol）。除去乙基锂试剂中的溶剂（苯/环己烷），以避免在分离目标氮杂硼杂苯产物时出现问题。将固体乙基锂重新溶解于13.0 mL Et2O.
注意：警告：有机锂试剂具有自燃性（接触空气或水可点燃）。目标产物（5）具有较高挥发性（MW = 106.96）。因此，由于乙基锂试剂中的苯/环己烷溶剂与目标产物挥发性相近，需去除溶剂才能有效分离得到纯品。 - 将含有4至-的反应烧瓶冷却30 °C 使用冷却浴。
- 通过拔液管在 -78 °C 下将乙基锂溶液加入反应瓶中30 °C在此温度下持续搅拌1小时，然后使其缓慢升至室温。
- 通过以下方式监测反应进程 11B NMR。（所需中间产物峰出现在 约 39.8 ppm。
- 反应完成后，将反应体系冷却至 -30 °C 并加入6.62 mL盐酸溶液（2.0 M，溶于Et2O，13.2 mmol）。搅拌反应1小时，同时使其缓慢升至室温。
- 使用配备低真空（20–25 Torr）的真空气体操作台除去溶剂，得到粗产物混合物。
- 在手套箱中，通过硅胶柱层析分离产物，以2-甲基丁烷为洗脱剂。在配备减压真空装置的真空气体歧管上去除挥发性物质，得到无色液体状纯产物。
注：产率为56%。
2. T4溶菌酶突变体的蛋白质制备与结晶
- 蛋白质表达与纯化
- 培养 E. coli 携带亚克隆质粒（L99A 或 L99A/M102Q）的RR1细胞17, 20 在200 mL LB（Luria-Bertani）培养基中加入40.0 mg氨苄青霉素 37 °C 12 小时。
注意：LB培养基的成分为每1 L H₂O中含12 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g氯化钠和1 g葡萄糖2O. - 接种160 mL过夜培养物至4.00 L LB培养基（添加800 mg氨苄青霉素）中，于 37 °C 在240 rpm转速下，通入过滤空气。
- 当600 nm处的光密度达到0.7时，将菌液从培养箱中取出，冷却至室温。
- 称取695 mg异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）（终浓度0.7 mM）于锥形离心管中，加入4 mL LB培养基溶解。
- 加入IPTG溶液以诱导蛋白表达。将培养物在110 rpm条件下孵育21小时，温度为 25 °C.
- 在 4,412 × g 条件下离心培养物 30 分钟 4 °C弃去上清液，将沉淀重悬于300 mL 0.1 M磷酸钠（pH 6.6）、0.2 M NaCl中，并加入30.0 mL 0.5 M乙二胺四乙酸（EDTA）（pH 8.0）。将悬浮液在17 h内持续搅拌 4 °C.
- 加入 30.0 mL 的 1.0 M MgCl2 加入0.500 mL脱氧核糖核酸酶I（DNase I）至悬浮液中，室温下搅拌反应8 h。
- 将裂解的细胞悬液在 30,913 x g 离心 30 分钟，温度为 4 °C收集含有表达蛋白的上清液，弃去沉淀。
- 将裂解液在20 mM磷酸钠缓冲液（L99A为pH 6.5，L99A/M102Q为pH 6.3）中透析 4 °C 过夜。
- 用平衡缓冲液（50 mM Tris，1 mM EDTA（pH 7.3））洗涤并平衡层析柱中的20.0 mL羧甲基离子交换树脂。将含有蛋白质的溶液上样至树脂，随后用100 mL平衡缓冲液洗涤层析柱。在平衡缓冲液中采用600 mL线性梯度（含300 mM NaCl）进行洗脱。
- 使用低压层析系统进行柱纯化。泵流速为1 mL/min，收集10 mL的组分。收集含有纯蛋白的组分。
注意：洗脱过程中，监测280 nm处的光密度（OD）以确认蛋白的存在。通过SDS-PAGE测定各组分的纯度，并仅收集最纯的组分。
- 培养 E. coli 携带亚克隆质粒（L99A 或 L99A/M102Q）的RR1细胞17, 20 在200 mL LB（Luria-Bertani）培养基中加入40.0 mg氨苄青霉素 37 °C 12 小时。
图3：T4溶菌酶突变体L99A/M102Q蛋白纯化的代表性结果。A) 色谱图显示在280 nm处测得的紫外吸光度（以AU为单位，蓝色线）和电导率（mS/cm，红色线）。合并第20–23号组分，并通过SDS-PAGE测定其纯度。B) 15% SDS-PAGE凝胶显示第20–23号组分中存在分子量为18.6 kDa的纯化蛋白。请点击此处查看该图的放大版本。
- 蛋白质结晶
- 将纯化的蛋白质溶液转移至透析膜管（12,000 至 14,000 MWCO）中。将透析管放入含有 4.00 L 的 100 mM 磷酸钠、550 mM NaCl、0.02% NaN3（L99A 为 pH 6.5，L99A/M102 为 pH 6.3）的烧杯中。在 4 °C 下搅拌 4 L 溶液过夜。
- 向透析后的样品中加入 2-巯基乙醇（终浓度为 5 mM），使用离心浓缩器（10,000 MWCO）浓缩至约 40.0 mg/mL。通过测量 280 nm 处的吸光度确定蛋白质浓度。在结晶前离心去除任何沉淀物。
- 采用气相扩散悬滴法进行蛋白质结晶。在硅化玻璃盖玻片上，将 5.00 µL 浓缩的蛋白质溶液与 5.00 µL 储液（2.0–2.2 M 钠/钾磷酸盐，pH 6.7–7.1，50 mM 2-巯基乙醇，50 mM 2-羟乙基二硫化物）混合。
- 将盖玻片倒置覆盖在含有储液的每个孔上，使液滴与 1.00 mL 储液达到平衡。用真空脂将每个孔与盖玻片紧密密封。使用 24 孔板并结合 2.2.3 中所述储液设置多种条件。将板置于 4 °C 下以促进晶体生长。
注意：晶体通常在盖玻片上的平衡缓冲液中 1–2 周内生长。在步骤 2.2.3 中，当蛋白质溶液与储液混合时立即出现沉淀，表明结晶失败。
图4：T4溶菌酶突变体L99A在与配体形成复合物前的代表性晶体图像。晶体处于母液中（2.1 M 钠/钾磷酸盐，pH 6.9，50 mM 2-巯基乙醇，50 mM 2-羟乙基二硫化物）。请点击此处查看该图的放大版本。
- 复合物制备
- 使用环状低温环（见材料列表）挑取晶体，并将其放入0.6 mL的微量离心管中。向管中加入50.0 µL母液，以防止晶体干燥并保持其完整性。
注意：使用显微镜有助于单晶的挑选。 - 将含有晶体的离心管转移至手套箱中。取5.00 µL的氮杂硼烷配体（5），置于离心管的扣盖内。盖紧管盖，并将离心管存放于手套箱内的冰箱（4 °C）中，通过蒸气扩散法平衡2–7天。
注意：氮杂硼烷配体（5）具有高挥发性和在水溶液中的良好溶解性，使其可通过蒸气扩散法与预先形成的蛋白质晶体发生配位反应。 - 使用环状低温环将晶体转移至载玻片上的N-石蜡油液滴中，随后在液氮中进行快速冷冻。用N-石蜡油保护晶体后，迅速将带晶体的低温环浸入装有液氮的杜瓦瓶中实现快速冷冻。使用低温镊子将冷冻后的晶体固定在低温环上。
- 利用同步辐射光源收集单晶的数据集。采用已发表的结构进行分子置换法解析相位20,24；通过观察蛋白结合位点内未建模的电子密度“团块”来确认配体的存在。
- 使用环状低温环（见材料列表）挑取晶体，并将其放入0.6 mL的微量离心管中。向管中加入50.0 µL母液，以防止晶体干燥并保持其完整性。
图 5：T4溶菌酶突变体L99A结合口袋的原子模型及其电子密度图。A) L99A空腔在结合位点处存在未建模的电子密度团块。B) L99A空腔中包含建模的氮硼杂苯配体5，呈现两种替代构象。请点击此处查看该图的高清版本。
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结果
1,2-氮杂硼杂苯的示意图合成路线如图1所示。本方案适用于五种不同含硼-氮分子的合成。图2展示了在步骤1.3过程中测得的11B核磁共振谱，用于监测目标产物（3）的生成。蛋白质纯化采用低压色谱系统进行，典型的色谱图如图3所示。收集组分的纯度通过SDS-PAGE测定。T4溶菌酶突变体L99A的晶体结构如图4所示。图5展示了L99A的结合口袋，包含未建模的电子密度，以及配体5结合后经精修的结合空腔。
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讨论
在本实验方案的第一部分中，我们描述了一种基于先前报道方法改进的1,2-氮杂硼杂苯合成方法12, 13三烯丙基硼烷22 被用作替代烯丙基三苯基锡或烯丙基三氟硼酸钾路线以制备 N-烯丙基-NTBS-缓冲液B-烯丙基氯加合物（1）。该方法实现了更高的原子经济性，并且对环境更加友好。适用于以下合成： N-TBS-B-Cl-1,2-氮杂硼杂苯（3），采用了一锅法两步反应序列（关环复分解反应后接氧化反应），其分离产率高于先前涉及中间体分离的方法（2）（两步反应产率分别为52%和29%）。 （然而，产率取决于加合物的纯度（1），在氧化步骤之前可能需要通过减压蒸馏分离环化产物。此时，使用二氯甲烷代替甲苯作为溶剂，可缩短蒸馏前去除挥发性物质所需的时间。）监测 ...
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披露
所有作者声明本稿件不存在竞争性经济利益。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院普通医学科学研究所（NIGMS，资助号：R01-GM094541）和波士顿学院资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 四氢呋喃（THF），无抑制剂，用于高效液相色谱 ≥99.9% | Sigma Aldrich | 34865 | |
| 乙醚（Et2高效液相色谱用 ≥99.9%，无抑制剂 | Sigma Aldrich | 309966 | |
| 二氯甲烷 (CH2Cl2），（稳定化/认证ACS） | Fisher | D37-20 | |
| 甲苯 | Fisher | T290-4 | |
| 戊烷，HPLC | Fisher | P399-4 | |
| 乙腈 | Fisher | A21-4 | |
| 氢化钙（CaH2），试剂级，95% | Sigma Aldrich | 208027 | 易燃的 |
| 活性炭负载钯（Pd/C），10 wt% Pd | Strem | 46-1900 | |
| 1.0 M 三氯化硼己烷溶液 | Sigma Aldrich | 211249 | 剧毒/自燃性 |
| 三乙胺 ≥99.5% | Sigma Aldrich | 471283 | |
| 格拉布斯 1st 生成催化剂 | 材料 | C823 | |
| 乙酰胺 | Sigma Aldrich | A0500 | |
| 正丁醇，无水，99.8% | Sigma Aldrich | 281549 | |
| 乙基锂溶液，0.5 苯/环己烷中的 M 浓度 | Sigma Aldrich | 561452 | 剧毒/自燃性 |
| 2.0 M HCl溶液，溶于Et2O | Sigma Aldrich | 455180 | |
| 2-甲基丁烷，无水 ≥99% | Sigma Aldrich | 277258 | |
| 大肠杆菌，（Migula）Castellani 和 Chalmers（ATCC® 31343™) | ATCC | 31343 | |
| T4溶菌酶野生型*（L99A） | Addgene | 18476 | |
| T4溶菌酶突变体（S38D L99A M102Q N144D） | Addgene | 18477 | |
| 氨苄青霉素钠盐 | Sigma Aldrich | A0166 | |
| 异丙基-β异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG） | Invitrogen | AM9464 | |
| 无水磷酸二氢钠 | Fisher | BP329 | |
| 无水磷酸氢二钠 | Fisher | BP332 | |
| 氯化钠 | Fisher | S642212 | |
| 乙二胺四乙酸 | Fisher | BP118 | |
| 氯化镁 | Sigma Aldrich | M4880 | 腐蚀性 |
| Thermo Scientific Pierce DNase I | Fisher | PI-90083 | |
| GE Healthcare Sepharose Fast Flow 阳离子交换介质 | Fisher | 45-002-931 | |
| Tris碱 | Fisher | BP152-500 | |
| 叠氮化钠 | TCI | S0489 | 剧毒 |
| 2-巯基乙醇 | Fisher | ICN806443 | |
| 赛多利斯 Vivaspin 20 离心浓缩管 | Fisher | 14-558-501 | |
| 磷酸二氢钾 | Sigma Aldrich | P5379 | |
| 2-羟乙基二硫化物 | Sigma Aldrich | 380474 | |
| N-对甲苯磺酰基对氨基苯甲酸 | Hampton Research | HR2-643 | |
| 4 RC 透析膜管，12,000 至 14,000 道尔顿截留分子量 | Fisher | 08-667E | |
| CryoLoop | Hampton Research | 环形低温管 | |
| CryoTong | 赛默飞世尔科技 | 低温钳 | |
| Coot | 电子密度图像是由软件生成的 |
参考文献
- Ducruix, A., Giége, R. Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, A Practical Approach. , IRL Press. Oxford, UK, New York. (1992).
- Bosdet, M. J. D., Piers, W. E. B-N as a C-C substitute in aromatic systems. Can. J. Chem. 87 (1), 8-29 (2009).
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