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方法文章

肠类器官中佛司可林诱导的肿胀：一种 体外 用于评估囊性纤维化患者药物反应的检测方法

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DOI：

10.3791/55159

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2017年2月11日

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1Foundation Hubrecht Organoid Technology, 2Department of Pediatric Pulmonology, Regenerative Medicine Centre Utrecht, Wilhelmina Children's Hospital, University Medical Centre Utrecht, 3Department of Stem Cells and Cancer, Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, 4Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, University Medical Centre Utrecht

本文内容

摘要

本方案描述了一种用于检测囊性纤维化（CF）患者来源的培养组织中CFTR功能及CFTR调节剂反应性的实验方法。源自活检组织的肠道类器官在cAMP驱动下会发生肿胀，而囊性纤维化类器官中的这一反应存在缺陷（或显著减弱），通过暴露于CFTR调节剂可使该反应得以恢复。

摘要

近年来开发的囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）调节药物可纠正囊性纤维化（cystic fibrosis, CF）患者中突变型CFTR通道的表面表达和/或功能。由于CFTR突变存在广泛的异质性，以及其他影响个体药物疗效的未知因素，识别可能从这些药物中获益的患者具有挑战性。本文介绍一种简单且相对快速的检测方法，用于评估个体CFTR功能及其对CFTR调节剂的反应 体外三维（3D）上皮类器官由直肠活检组织在标准类器官培养基中培养生成。类器官建立后，可进行生物样本库保存，以供后续分析使用。在检测中，将30–80个类器官接种于96孔板中的基底膜基质内，并暴露于药物中。一天后，使用钙黄绿素绿色染料对类器官进行染色，并在37 °C条件下通过共聚焦活细胞显微镜监测佛司可林诱导的肿胀反应。佛司可林诱导的肿胀完全依赖于CFTR功能，且具有足够的敏感性和精确性，能够区分不同个体之间、甚至基因型相同个体之间的药物反应差异 CFTR 突变。 体外 肿胀反应与治疗的临床反应相关。该检测方法提供了一种经济有效的手段，用于识别对药物有反应的个体，且不受CFTR突变类型的影响。该方法还可能在未来的CFTR调节剂开发中发挥重要作用。

引言

囊性纤维化（CF）由编码上皮细胞阴离子通道的囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）基因突变引起。全球约有85,000人受此疾病影响1。目前已鉴定出超过2,000种CFTR突变（www.genet.sickkids.on.ca）。这种突变的多样性部分解释了临床上观察到的广泛疾病表型（www.CFTR2.org）2,3。根据CFTR蛋白表达和功能的影响，CFTR突变被分为六类：(I) 无蛋白合成，(II) 转运障碍，(III) 通道门控缺陷，(IV) 电导异常，(V) 正常功能CFTR蛋白水平降低，以及(VI) 细胞表面稳定性受损4。尽管常见CFTR突变已被广泛研究，但在个体水平上，CFTR功能与其临床状态之间的关系仍不明确，尤其是对于大量罕见的"孤儿"突变而言（www.CFTR2.org）1,3。

近年来，已开发出针对CFTR蛋白的突变特异性药物。目前临床上使用的CFTR蛋白靶向药物分为两类，其作用机制各不相同。增效剂（如VX-770）可提高定位于细胞顶膜的突变型CFTR通道的开放概率，并在加入细胞后直接发挥作用5。校正剂（如VX-809）则可恢复内质网中错误折叠的CFTR蛋白的转运功能，但需在细胞中预先孵育一段时间后才能观察到效果6。CFTR增效剂VX-770已被批准用于携带G551D突变的患者7,8，以及另外八种CFTR门控突变（包括S1251N）的患者9；总体而言，这些突变存在于约5%的囊性纤维化患者中。其他临床试验表明，VX-770与校正剂VX-809联合使用，对携带F508del突变纯合子（存在于45-50%患者中）的个体肺功能具有有限但显著的改善作用，并可降低病情加重的发生率10,11。

在其余50%的囊性纤维化（CF）患者中，通过传统临床试验识别药物响应个体成本高昂且耗时漫长，对于携带极为罕见CFTR基因型的个体而言并不可行。因此，亟需开发新型、经济高效且个性化的研究方法，以将不断增多的CFTR调节剂精准匹配至携带各类CFTR突变的患者。迄今为止，针对携带特定CFTR突变患者群体的临床试验入组，主要依据是在异源细胞系统中转染突变CFTR基因后，通过Ussing chamber进行的电生理研究5,6,12。由于缺乏合适的CF动物模型，药物有效性研究通常采用来自CF肺组织移植材料的气液界面分化支气管上皮细胞进行药物开发13,14,15。然而，肺移植组织来源有限，且从非终末期疾病患者获取支气管细胞需侵入性操作，这限制了对较罕见CFTR突变的分析，也阻碍了个性化药物测试的实施。为克服这些局限，目前正探索使用诸如结肠类器官、鼻腔气道细胞以及由诱导多能干细胞衍生的气道细胞等"易于获取"的组织，用于个性化药物治疗。

此前，我们已建立了从任何胃肠道器官中以三维类器官形式培养上皮干细胞的方案16,17。对于人结肠/直肠组织，培养条件包括特定的生长因子（表皮生长因子（EGF）、胃泌素、Wnt-3A、R-脊椎蛋白3（Rspo3）和Noggin）以及小分子化合物（烟酰胺、A83-01和SB202190），并置于基底膜基质中进行培养。在此条件下，单个干细胞或微小组织片段可生长为封闭的囊状三维结构，其上皮细胞具有高度极性，基底面朝外。所有细胞类型均以正常的比例和位置出现。类器官可通过每周机械性传代和重新接种实现长期扩增。它们在遗传和表型上均保持稳定，并可被冻存，从而实现长期扩增和生物样本库保存17。此外，类器官适用于所有为二维细胞系开发的标准细胞生物学/遗传学操作及分析技术18。

我们最近证明，囊性纤维化跨膜电导调节因子（CFTR）功能可在结直肠类器官中通过佛司可林诱导肿胀（FIS）实验便捷地测定19,20。当暴露于佛司可林（Fsk）或霍乱毒素时，类器官会迅速升高其环磷酸腺苷（cAMP）水平，进而导致CFTR通道开放19。来自健康个体或携带具有残余功能的CFTR突变个体的类器官，会因离子和水向类器官腔内的转运而发生肿胀，这相当于体外的分泌性腹泻现象。in vitro研究表明，结直肠类器官的FIS反应完全依赖于CFTR，这一点已通过来自CFTR缺失个体的类器官以及特异性药理学CFTR抑制剂的使用得到证实19。在取活检后数周内，即可获得大量个体特异性的数据集。

本文详细描述的FIS检测中，类器官由直肠活检组织培养获得，该活检可在任何年龄进行且仅引起轻微不适21。类器官通过机械性分离为单个隐窝进行每周传代，这些隐窝易于自我封闭并形成新的类器官。进行FIS检测时，将约30–80个经机械分离的小类器官接种至96孔板的每个孔中19。在检测当日，使用钙黄绿素绿色（calcein green）对类器官进行染色，该荧光染料可穿透活细胞并在其中保留，便于活细胞成像。随后加入Fsk（forskolin），其可提高细胞内cAMP水平，从而激活CFTR，诱导类器官肿胀。作用于顶膜CFTR的增效剂与forskolin同时加入，而恢复CFTR转运功能的矫正剂则在加入Fsk前24小时添加。类器官肿胀程度通过自动图像分析进行量化，该分析计算在加入forskolin后各时间点所有荧光物体总面积相对于基线的增加倍数。

与在Ussing室中培养于二维气道细胞的传统电生理CFTR检测方法相比，三维类器官肿胀检测具有优势与局限性。其主要优势在于检测通量高。细胞培养和检测可使用同一种培养基完成，经验丰富的技术人员每周可培养多达25个类器官样本，并在12例患者样本中每周定量约1,200个数据点。我们通常在每块培养板上对单个实验条件设置双复孔或三复孔，并在三个独立的孵育时间点重复检测。总体而言，每个实验条件可测量约300–500个单独的类器官结构，从而实现对CFTR功能的高精度测定，技术变异性极低。这种高精度使我们能够清晰界定残余功能的差异以及对CFTR调节剂的反应差异，并可轻易检测到携带相同CFTR突变但遗传背景不同的患者之间的效应差异19,22,23,24,25。数据质量可通过显微镜图像轻松评估。尽管FIS完全依赖于CFTR，但它是一种间接的CFTR功能检测指标，其信号读出源于离子转运与液体转运的耦合效应。这与Ussing室中直接测量跨上皮离子电流的CFTR功能检测方法形成对比26。Ussing室允许选择性刺激顶膜或基底外侧膜（而类器官检测无法实现）；通过通透化基底外侧膜，可选择性测定顶膜CFTR依赖性阴离子分泌27。

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方案

本文所述使用人体组织的所有实验均经乌得勒支大学医学中心（UMCU；TcBio #14-008）伦理委员会批准。在威廉明娜儿童医院（WKZ）-UMCU，已从患者处获得关于组织采集、类器官制备、储存及使用的知情同意书。

设备耗材工具
超净工作台15 和 50 ml 锥形离心管 Zeiss LSM 800 – Zen 2 (Blue edition) 软件用于图像测量
CO2 培养箱微量离心管Microsoft Excel 程序
细胞培养显微镜（光学显微镜）0.22 µm 滤器
离心机血清移液管
滚轴摇床移液器滤芯吸头
4 °C 房间或用于培养箱的 4 °C 冰箱冻存管
CoolCell 细胞冻存容器
血清移液器
微量移液器（1,000、200 和 20 µl）
Viaflo 重复移液器
（活细胞）共聚焦显微镜
计算机
液氮罐
多通道移液器（200 µl）

1. 培养用试剂的配制

注意：所有步骤均须在生物安全柜内进行，并遵循细胞培养操作的标准规范。为了便于形成良好的基底膜基质液滴，需将96孔、24孔和6孔板的预热储备板置于37 °C培养箱中保温。

  1. 基础培养基制备
    注：基础培养基（BM）指添加了4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、谷氨酰胺和青霉素/链霉素（Pen/Strep）的Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium与Ham's F-12营养混合物（Ad-DF）。
    1. 在500 ml Ad-DF培养基瓶中加入5 ml 200 mM谷氨酰胺、5 ml 1 M HEPES和5 ml青霉素/链霉素溶液（10,000 U/ml，10,000 µg/ml）。
    2. 将BM置于4 °C冰箱中保存，至少可稳定4周。
  2. Wnt-3A条件培养基制备
    注：Wnt-3A条件培养基使用L-Wnt-3A细胞系按制造商说明书自行制备。
    1. 收集与细胞共培养一周的培养液以获取Wnt-3A条件培养基，于450 × g离心5分钟以去除悬浮细胞。
    2. 将Wnt-3A条件培养基经0.22 µm滤膜过滤，分装为每管40 ml至50 ml锥形管中。可在4 °C保存至少4个月而不损失活性。
    3. 使用转染了TOP-和FOP-荧光素酶以及TK-Renilla的人胚肾（HEK）-293细胞，按照制造商说明书使用Renilla-荧光素酶检测试剂盒进行TOP/FOP检测，以评估Wnt-3A条件培养基的活性。
      注：TOP-荧光素酶是一种含有野生型TCF结合区的报告质粒。若Wnt-3A条件培养基具有活性，则经典Wnt信号通路被激活，β-连环蛋白（beta-catenin）转入细胞核并与TCF/LEF转录因子结合，启动荧光素酶报告基因的转录，当加入底物后相对荧光素酶活性升高。FOP-荧光素酶作为阴性对照，因其荧光素酶基因上游的TCF结合区已发生突变。
  3. 结肠培养基制备
    注：所有生长因子和试剂应按照制造商推荐方法配制和稀释。使用小体积分装，避免反复冻融。功能性生长因子对实验结果至关重要。
    1. 通过向BM中添加1× B27、1.25 mM N-乙酰半胱氨酸、50 ng/ml hEGF、5 nM胃泌素、10 mM烟酰胺、300 ng/ml hRspo3、100 ng/ml hNoggin、500 µM A83-01、10 µM SB202190以及100 µg/ml抗菌剂（用于原代细胞），制备结肠培养基（CM）。
    2. 将CM分装后于-20 °C冷冻保存，最长可达4个月。使用时将CM与50% Wnt-3A条件培养基混合，配制成完全结肠培养基（FCM）。FCM可在4 °C保存最多7天而不损失活性。
    3. 为建立直肠活检来源的类器官培养，需在FCM中额外添加50 µg/ml万古霉素、50 µg/ml庆大霉素和10 µM Rho相关卷曲螺旋形成蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂（RhoKi）。该培养基称为分离培养基（IM），仅用于培养最初两至三天。
  4. EDTA储备液制备
    1. 用超纯H2O配制0.5 M乙二胺四乙酸（EDTA）溶液，调pH至8.0，经0.22 µm滤膜除菌。
  5. 基底膜基质操作
    1. 按照制造商推荐方法准备基底膜基质（BMM）。
    2. 将BMM置于冰上过夜解冻。
    3. 将BMM从原瓶转移至15 ml锥形管时，使用5 ml移液器，并使用预先在-20 °C预冷的15 ml锥形管。
    4. BMM完全解冻后，置于4 °C冰箱中保存，使用前需在冰上孵育至少30–60分钟。
      注：为获得最佳效果，在包埋隐窝或类器官前，BMM必须保持低温并充分混匀。

2. 从囊性纤维化患者活检样本建立结肠类器官

注意：组织采集后，重要的是将样本置于冰上的生理盐水、不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）或 BM 中保存。建议尽快处理活检样本，但已有研究表明，将活检组织在冰上保存长达 7 天后仍可成功建立类器官培养。

  1. 让活检组织沉降至15 ml锥形管底部，移除上清液。
  2. 向活检组织中加入10 ml DPBS，使用10 ml移液器上下吹打10–20次。
    注意：移液前需先用基质胶（BM）预润湿移液器。
  3. 让活检组织沉降至管底，移除上清液。
  4. 重复步骤2.2和2.3共4–5次，直至上清液澄清。
  5. 向活检组织中加入10 ml DPBS和200 µl EDTA（0.5 M），将管子置于摇床上，在4 °C孵育60–120分钟。
    注意：不同患者的孵育时间可能不同。若隐窝已释放，DPBS将变得浑浊。当显微镜下可观察到隐窝时，EDTA孵育即可终止。
  6. 让隐窝自然沉降，弃去上清液。
  7. 取2 ml基质胶（BM）加入新的15 ml锥形管中，手动轻轻摇晃该管，使管内壁均匀覆盖BM。
  8. 使用经BM预润湿的移液器，向含有活检组织的管中加入2 ml DPBS，并上下吹打10–20次。
  9. 让活检组织沉降后，将含有隐窝的DPBS转移至步骤2.7中已准备好的含2 ml BM的新管中。
  10. 重复步骤2.8和2.9，直至不再有隐窝释放。
  11. 在8 °C下以130 × g离心5分钟，沉淀隐窝。
  12. 在此期间，将培养基（IM）转移至室温（RT）下的生物安全柜中。
  13. 弃去上清液，向隐窝沉淀中加入10 ml BM，并重复步骤2.11。
  14. 将沉淀重悬于1 ml BM中。取5–10 µl，在显微镜下目测计数隐窝数量。
  15. 在8 °C下以130 × g离心5分钟，沉淀隐窝。
  16. 移除上清液，将沉淀重悬于55% BMM（v BMM : v IM）中。
    注意：隐窝应按每1个隐窝/µl的比例重悬于相应体积的55% BMM中。若隐窝数量不足，BMM的最小体积为40 µl。
  17. 接种时，每孔（24孔板）加入35 µl。将35 µl BMM分成3–5个独立液滴，以促进生长因子在BMM中的扩散。避免产生气泡。
  18. 将培养板倒置放入37 °C培养箱中，静置至少20分钟，使BMM凝固。
  19. 每孔加入500 µl IM，置于37 °C、5% CO2培养箱中培养。
  20. 每2–3天更换一次培养基。使用P1000移液器吸出旧培养基，注意保持BMM液滴完整。沿孔壁小心加入新鲜完全培养基（FCM），避免直接滴加在BMM液滴上。
    注意：若分离过程中未观察到隐窝释放，可将上清液离心，沉淀用BM洗涤2–3次后重悬于BMM中。将剩余组织用刀片切成小块，收集至15 ml锥形管中，离心后重悬于相同BMM中。若存在上皮干细胞，亦可形成类器官。

3. 结肠类器官的传代培养，用于维持、冻存及佛司可林诱导肿胀实验（FIS）

注意：每种类器官培养物都有其特定的倍增时间。通常，结直肠CF类器官每7-10天可按1:3至1:5的比例传代扩增。若观察到出芽状结构，表明生长状态良好。结直肠CF类器官的囊性特征较结直肠正常类器官（图2D）更少（图2A-2C）。类器官的建立与维持培养使用24孔板；冻存时使用6孔板；进行FIS检测时则使用96孔板。

  1. 类器官传代
    1. 使用前将BMM置于冰上至少30-60分钟。
    2. 使用前将FCM在室温下放置至少1小时。
    3. 标记一个15 ml锥形管为样品名称，另一个管标记为"洗涤用"。
    4. 使用P1000移液器小心吸去孔中的培养基，避免扰动BMM液滴。
    5. 向1个孔中加入1 ml BM，用P1000移液器吹打使BMM液滴分散。将此1 ml液体转移至标记有样品名称的15 ml锥形管中。
    6. 用另外1 ml BM洗涤该孔，并将洗液转移至同一15 ml管中。
    7. 对另外5个孔重复步骤3.1.5和3.1.6（最多可将24孔板中的6个孔洗涤液合并至一个15 ml锥形管中）。
    8. 用BM将管内液体补至12 ml。使用预先润湿的5 ml移液器上下吹打混匀。
    9. 在8 °C条件下以85 × g离心5分钟。
    10. 弃去上清液，向沉淀中加入1 ml BM。使用同一P1000移液器吸头吸取一个无滤芯的P10吸头，上下吹打20次。随后丢弃P1000和P10吸头。
    11. 用5 ml移液器加入4 ml BM，并将管子倾斜约70°（相对于垂直方向）。预先润湿一个新的P1000吸头，用P1000（1 ml体积）剧烈吹打混合2-3次。
    12. 保持倾斜状态数到10，小心用P1000移液器吸取最上层液体，将4 × 1 ml分别转移至标记为"洗涤用"的管中。
    13. 观察类器官在倾斜管中沉降至底部；完整类器官和较大团块会下沉到底部。将15 ml标记为"洗涤用"的管在8 °C条件下以85 × g离心5分钟。
    14. 弃去上清液，向类器官沉淀中加入所需量的培养基和BMM，使BMM终浓度为55%。通过上下吹打混匀，避免产生气泡（图3B）。
      注：以每10 µl BMM中接种25-30个类器官的密度为宜。
    15. 执行步骤2.17-2.19。
  2. 用于冻存的类器官传代
    1. 使用前将BM置于冰上至少30-60分钟。使用前将FCM在室温下放置至少1小时。
    2. 准备补充RhoKi的FCM（见步骤1.3.3）。
    3. 从冰箱中取出胰蛋白酶，室温放置至少30分钟后再使用。
    4. 执行步骤3.1.5-3.1.10。
    5. 尽可能吸除上清液，加入4 ml胰蛋白酶，涡旋振荡30秒。
    6. 将管子置于37 °C温水浴中1分钟，然后剧烈涡旋振荡30秒。
    7. 在显微镜下检查管中溶液。若仍可见完整类器官，则重复步骤3.2.7。
    8. 当类器官被充分消化后，加入8 ml BM以中和胰蛋白酶，并吹打10次。
    9. 在8 °C条件下以450 × g离心3分钟。
    10. 弃去上清液，向类器官沉淀中加入适量培养基和BMM，配制成含55% BMM的溶液。通过上下吹打混匀，避免产生气泡。
      注：用于冻存时，类器官在胰蛋白酶消化后应按1:1比例接种。
    11. 将250 µl细胞悬液接种至预热的6孔板的一个孔中，形成约10 µl大小的微小独立液滴。将培养板倒置放入37 °C培养箱中，使BMM凝固20-30分钟。
    12. 向6孔板每孔加入2.5 ml新鲜FCM + RhoKi，并将培养板转移至培养箱中（图3C）。
  3. 用于FIS检测的类器官传代
    注：根据类器官的数量和大小，24孔板中的4至6个孔足以接种一个96孔板的27个孔。
    1. 按照步骤3.1至3.1.13所述方法处理类器官。
    2. 将沉淀重悬于120 µl含50% BMM的溶液中。
    3. 在显微镜下确认3 µl BMM液滴中的类器官数量（30-50个）。
    4. 使用3 µl单滴液滴，将类器官接种至96孔板每个孔的中央位置。
    5. 将培养板置于37 °C培养箱中15分钟，使BMM凝固；后续步骤见步骤6.1.1。

4. 冷冻结肠类器官

注意：类器官在经过胰蛋白酶消化和培养后1-2天即可进行冻存，此时类器官体积较小，有助于提高解冻后的存活效率。

  1. 加入 1 ml BM，使用 P1000 移液器吹打分散 BMM 液滴，转移至 15 ml 锥形管中。
  2. 用另外 1 ml BM 清洗孔板孔，一并转移至同一 15 ml 锥形管中。
  3. 对所有孔重复步骤 4.1 和 4.2。
    注意：为避免 BMM 过量，将 6 孔板中的 3 个孔合并至一个 15 ml 锥形管中。
  4. 向含有类器官的 15 ml 锥形管中补加冷 BM 至总体积 12 ml，用 5 ml 移液器反复吹打混匀。将管置于冰上静置 5 分钟。
  5. 在 450 × g、8 °C 条件下离心 3 分钟，弃去上清液。
  6. 用冻存液重悬类器官沉淀，并反复吹打以充分悬浮类器官。
    注意：每 100 µl BMM 使用 500 µl 冻存液。
  7. 使用 5 ml 移液器，将 0.5 ml 用冻存液重悬的类器官转移至无菌冻存管中。
  8. 将冻存管放入细胞冻存盒中，置于 -80 °C 保存。
  9. 24 小时后，将冻存管转移至液氮中长期保存。

5. 从冻存类器官建立培养物

注意：在冰上解冻BMM，并始终保持在冰上。让BM升至室温，并在开始解冻一支冻存管之前，将10 ml等分试样预热至37 °C。

  1. 将冻存管在37 °C水浴中快速振荡融化，直至管内仅剩少量冰晶。
  2. 使用P1000移液器将解冻后的类器官转移至15 ml锥形管中。
  3. 立即沿管底逐滴加入1 ml预热的BM培养基，同时轻轻摇动锥形管。加完1 ml培养基后，轻轻吹打数次，以充分稀释冻存液。
  4. 向含有类器官的锥形管中缓慢逐滴加入9 ml预热的BM培养基，然后轻轻颠倒混匀数次。
  5. 将细胞悬液在85 × g、8 °C条件下离心3分钟。
  6. 小心弃去上清液，避免扰动沉淀。用90 µl添加了Rho激酶抑制剂（RhoKi）的FCM重悬类器官，随后加入110 µl BMM。
  7. 将35 µl细胞悬液分别加入预热的24孔板各孔中，形成微小且彼此分离的液滴。
  8. 将培养板转移至37 °C培养箱中，倒置培养20–30分钟。
  9. 向每孔加入500 µl含RhoKi的FCM，然后将培养板放回培养箱（图4A–图4C）。
  10. 待类器官充分恢复后（通常在解冻后2–3天进行，图4D–图4G），将其用更多BMM稀释，使每10 µl BMM中含有25–30个类器官，以确保类器官正常生长。

6. 福斯科林诱导肿胀实验（FIS）

注意：Fsk滴定可用于检测CFTR的残余功能。进行CFTR调节时，类器官暴露于特定的校正剂例如， VX-809）和/或增效剂（例如， VX-770），具体取决于基因型。通常在测量前18–24小时加入VX-809，而VX-770和Fsk则在开始测量前立即加入。需注意，某些调节剂（校正剂/增效剂）可能结合至检测板的塑料表面。

  1. 检测铺板
    注意：VX-809 储存液分装为 20 mM，保存于 -80 °C。解冻时置于室温，并避光。
    1. 按照第 3.3 节所述方法处理类器官。
    2. 若测试 VX-809 修正剂，使用以下浓度在 FCM 中制备三复孔的剂量-反应曲线：0.0003、0.003、0.03、0.3、3.0 和 30 µM。稀释液使用 FCM 配制。
    3. 向 96 孔板中加入 100 µl 含相应 VX-809 浓度的 FCM，或仅加入 100 µl FCM，并将板子进行孵育。
  2. 检测测量
    注意：VX-770 储存液分装为 20 mM，Fsk 储存液为 10 mM；两者均保存于 -80 °C。解冻时置于室温，并避光。
    1. 取一管钙黄绿素（calcein）和 DMSO，室温放置 15 分钟。
    2. 若为未开封的粉末状钙黄绿素，向管中加入 5.1 µl DMSO；否则，使用已重悬的含 2.5 µl 钙黄绿素的管。
    3. 在 1.5 ml 离心管中，将 2.5 µl 钙黄绿素加入 580 µl BM 中，并做好标记。
    4. 使用重复加样器，向每孔加入 10 µl 染料溶液（BM + 钙黄绿素）。
    5. 使用多通道移液器轻轻吹打混匀一次，确保染料充分混合。
    6. 将板子置于 37 °C 培养箱中孵育 30 分钟。
    7. 在钙黄绿素孵育期间，如需使用，开始配制 Fsk 和 VX-770 溶液。
    8. 若使用 VX-770 增效剂，使用以下浓度在 BM 中制备三复孔的剂量-反应曲线：0.0003、0.003、0.03、0.3、3.0 和 30 µM。若进行 Fsk 滴定，浓度为：0、0.008、0.02、0.05、0.12、0.32、0.8、2.0 和 5.0 µM。稀释液使用 BM 配制。
      注意：对于在第二天添加的 Fsk、VX-770 或其他药物，稀释液必须配制成最终浓度的 2 倍，因为每孔将加入 100 µl Fsk/药物滴定液，而孔中已含有 100 µl FCM。
    9. 将 Fsk 和 VX-770 溶液、p200 移液器及吸头转移至显微镜室。
    10. 进行 FIS 检测成像时，使用配备自动载物台、加热腔和 CO2 流通系统的活细胞共聚焦显微镜。
      注意：以下步骤针对特定显微镜。不同设备应根据制造商说明调整操作。
    11. 将 96 孔板放入板架中。
    12. 输入共聚焦显微镜的成像设置。
      1. 将活细胞成像系统预设为 37 °C 和 5% CO2，并在测量前让腔室预孵育至少 30 分钟。
      2. 使用 "Smart setup" 选项选择 Alexa Fluor-488 通道。
      3. 设置 5X 物镜，扫描区域为 0.6X，以缩小视野并捕获整个孔。
      4. 调整激光功率和探测器灵敏度，以在背景之上最佳检测钙黄绿素-绿色标记的类器官。针孔可增大至 130 µm，图像平均值设为 2。
      5. 设置位深为 8，帧尺寸为 512 x 512。
      6. 使用时间序列选项设置测量时间、频率和间隔。
        注意：常规测量建议：1 小时，间隔 10 分钟，共 7 个周期（周期 1 为 T = 0）。对于肿胀减少的测量，类器官可成像长达 3 小时。
      7. 使用拼接（tile）选项手动确定各孔位置。
    13. 按照与成像相同的顺序，向相应孔中加入 100 µl Fsk 和/或 VX-770 溶液。从第一个成像孔开始，按成像顺序依次添加。
    14. 开始测量。
    15. 实验结束后，保存文件。
  3. FIS 检测数据分析
    1. 使用图像分析软件中的分析工具，创建一个 "organoid analysis" 宏，用于 FIS 检测的数据分析，该宏可识别通过 Alexa-488 通道成像的所有结构，并填充识别出的结构，以计算不同时间点总类器官面积的增加。
    2. 在图像分析程序中打开包含采集图像的数据文件。
    3. 选择用于类器官分析的宏。
    4. 在时间点 1 的一个孔中设置阈值，以平衡信噪比，并确保所有类器官结构均被识别并填充。
      1. 检查 4–6 个孔在时间点 7 的结构是否也被正确识别。轻微调整阈值，确保时间点 7 的背景信号不被识别为结构（具体阈值可能在不同实验间略有变化）。
    5. 将识别对象的最小面积标准设为 1,000 µm2。
    6. 点击 "analyze" 开始分析。分析时间约 3 分钟，具体取决于所用软件。
    7. 软件分析完成后，进入 "create table"，选择以下数据：孔编号（表格应按此顺序递增）、时间点和每孔总面积。
    8. 将文件另存为 .xlm 格式，以便导出至电子表格程序。
    9. 在该程序中，通过将时间点 1 的面积设为 100%，计算每孔面积的相对增加。计算每个条件下时间点 1 至 7 的曲线下面积（AUC）；面积下限（Y 值）设为 100%。以 Fsk 或药物滴定浓度（X 轴）对 AUC（Y 轴）作图。

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结果

图1A 显示了嵌入基底膜基质（BMM）中的一例代表性新鲜分离隐窝。这些隐窝来自一名囊性纤维化（CF）患者的结肠直肠活检组织。通常情况下，每个隐窝可生成一个类器官（图1A–图1C）。由于CFTR功能障碍，大多数结肠CF类器官不呈囊状，而是结构致密，并带有突起和芽状结构（图2A–图2B）。然而，某些CF类器官培养物，尤其是具有较高残余功能的样本，会出现少量呈囊状形态的类器官（图2C），类似于野生型类器官培养物（图2D）。

在对类器官进行传代以扩增培养或接种FIS实验之前，类器官应具有较大的尺寸并形成多个出芽结构，如图3A所示。如果类器官在传代时体积较小且缺乏明显出芽，则会对其培养效果产生不...

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讨论

本文提供了人源结直肠类器官的生成、扩增、冻存与复苏的完整实验方案。尽管我们此前已建立了人源类器官培养体系17，但其他实验室在缺乏实际操作培训的情况下，往往难以成功建立该技术。我们预期这些实验方案将可替代传统的操作培训。

Wnt-3A 条件培养基是成功建立并维持长期类器官培养的最关键试剂之一。事实上，类器官培养可能 "碰撞" 当暴露于低活性的Wnt-3A条件培养基时。由于Wnt-3A条件培养基为实验室自制，因此在制备具有活性的培养基时需考虑多个因素。只有使用高质量的胎牛血清（FBS）配制培养基，才能产生具有活性的Wnt-3A，因为高质量FBS可为L细胞提供适当的生长信号，并有助于疏水性Wnt-3A分子的稳定。当Wnt-3A活性较低时（即， 低 TOP/FOP 比值（见下文）通常是由胎牛血清（FBS）引起的问题。

商用重组Wnt效果较差，因此我们不建议将其用作TOP/FOP Wnt报告基因实验的阳性对照。TOP/Renilla与FOP/Renilla...

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披露

Hans Clevers 是类器官培养技术和佛司可林诱导肿胀实验相关专利的发明人。Jeffrey M Beekman 是佛司可林诱导肿胀实验相关专利的发明人。Sylvia F Boj 和 Robert Vries 就职于 Hubrecht 类器官技术基金会（HUB），该机构拥有类器官技术的独家许可权。除此之外，作者无其他利益冲突需要披露。

致谢

本研究得到了荷兰囊性纤维化基金会（NCFS）的HIT-CF项目、ZonMW（40-00812-98-14103）、威尔海米娜儿童医院研究基金以及CZ和Zilverenkruis/Achmea的资助。我们感谢S. Heida-Michel、M. Geerdink、K.M. de Winter-de Groot和G. Berkers（乌得勒支大学医学中心威尔海米娜儿童医院儿科呼吸科）以及R.H.J. Houwen（乌得勒支大学医学中心威尔海米娜儿童医院儿科消化科）在患者招募及获取活检样本以建立囊性纤维化生物样本库方面所做的贡献。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
高级DMEM’s 改良伊格尔培养基与F-12哈姆营养混合物（Ad-DF）500 ml 赛默飞世尔科技  Invitrogen#126344 ℃ 保存 °C
GlutaMax赛默飞世尔科技  Invitrogen#350504 ℃ 保存 °C
Hepes赛默飞世尔科技  Invitrogen# 15630-0564℃保存 °C
青霉素/链霉素赛默飞世尔科技  Invitrogen#15140-122储存于 -20 °C
96孔培养板Cellstar#655180
24孔培养板Cellstar#662160
6孔培养板Cellstar#657160
不含氯化钙的杜氏磷酸盐缓冲液2 (-) MgCl2) (DPBS)Life Technologies：Gibco#14190-0944 ℃下保存 °C
杜尔贝科’s 改良伊格尔培养基  （DMEM）500 ml 赛默飞世尔科技  Invitrogen#31966-021用于Wnt-3A条件培养基的制备。4℃保存 °C
胎牛血清（FBS）Bovogen#SFBS 批号#11113用于Wnt-3A条件培养基的制备。储存于-20 °C
L Wnt3A 细胞系ATCC#CRL-2647用于Wnt-3A条件培养基的制备
TOP/FOP 质粒Millipore #17-285用于检测Wnt活性
pTK-RenillaPromega #E2241用于检测Wnt活性
HEK-293ATCC#CRL-1573用于检测Wnt活性
双荧光素酶报告基因检测系统Promega #E1910用于检测Wnt活性
Zeocin 赛默飞世尔科技  Invitrogen#R250-01Wnt-3A 细胞系筛选
B27添加剂 赛默飞世尔科技  Invitrogen#17504-044储存于 -20 °C
N-乙酰半胱氨酸Sigma Aldrich#A9165-5G储存于 -20 °C
烟酰胺Sigma Aldrich#N0636储存于 -20 °C
人表皮生长因子（hEGF）PrepoTech#AF-100-15储存于 -20 °C
胃泌素Sigma Aldrich#G9145储存于 -20 °C
TGFb I型受体抑制剂（A83-01） Tocris#2939储存于 -20 °C
Y-27632 二盐酸盐（RhoKi）Selleckchem#S1049储存于 -20 °C
p38 MAPK抑制剂（p38i）（SB202190）Sigma Aldrich#S7067储存于 -20 °C
PrimocinInvivoGen#ant-pm-1储存于 -20 °C
人Noggin（hNoggin）PrepoTech#120-10C储存于 -20 °C
人R-脊椎蛋白3（hRspo-3）R&D Systems#3500-RS/CF储存于 -20 °C
万古霉素Sigma Aldrich#861987- 250毫克储存于 -20 °C
庆大霉素Life Technologies：Gibco#15710-049储存于 -20 °C
乙二胺四乙酸（EDTA）Sigma Aldrich#4317884 ℃下保存 °C
Matrigel康宁#354230储存于 -80 °C
TryplE Express Life Technologies：Gibco#12605-010用于类器官冻存前的胰蛋白酶消化
复苏细胞培养冻存液Life Technologies：Gibco#12648010用于冷冻
钙黄绿素Life Technologies：Gibco#C3100MP储存于 -20 °C
福斯科林R&D Systems#1099-50 mg储存于 -80 °C
Lumacaftor (VX-809)Selleckchem#s1565储存于 -80 °C
Ivacaftor (VX-770)Selleckchem#s1144储存于 -80 °C
<强>试剂/材料名称<强>溶剂<强>储存浓度<强>终浓度
GlutaMax200 mM2 mM
Hepes1 M10 mM
青霉素/链霉素10K U/ml 10K µg/ml100 U/ml 100 µg/ml
Zeocin 100 mg/ml 125 µg/ml
B27添加剂 100x1x
N-乙酰半胱氨酸MiliQ H2O500 mM
烟酰胺DPBS1 M10 mM
人表皮生长因子（hEGF）DPBS 0.1% BSA0.5 mg/ml50 ng/ml
胃泌素DPBS100 µM10 nM
TGFb I型受体抑制剂（A83-01） DMSO5 mM500 nM
Y-27632 二盐酸盐（RhoKi）DMSO10 mM10 µM
p38 MAPK抑制剂（p38i）（SB202190）DMSO30 mM10 µM
Primocin50 mg/ml 100 µg/ml
人Noggin（hNoggin）DPBS 0.1% BSA100 µg/ml100 ng/ml
人R-脊椎蛋白3（hRspo-3）因批次而异300 ng/ml
万古霉素10 mg/ml50 µg/ml
庆大霉素10 mg/ml50 µg/ml
乙二胺四乙酸（EDTA）MiliQ H2O0.5 M2 mM
钙黄绿素DMSO10 µg/ml3.3 ng/ml
ForskolinDMSO10 mM可变的
Lumacaftor (VX-809)DMSO20 mM可变的
Ivacaftor（VX-770）DMSO20 mM可变的

参考文献

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