本方案描述了一种用于检测囊性纤维化（CF）患者来源的培养组织中CFTR功能及CFTR调节剂反应性的实验方法。源自活检组织的肠道类器官在cAMP驱动下会发生肿胀，而囊性纤维化类器官中的这一反应存在缺陷（或显著减弱），通过暴露于CFTR调节剂可使该反应得以恢复。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
近年来开发的囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）调节药物可纠正囊性纤维化（cystic fibrosis, CF）患者中突变型CFTR通道的表面表达和/或功能。由于CFTR突变存在广泛的异质性，以及其他影响个体药物疗效的未知因素，识别可能从这些药物中获益的患者具有挑战性。本文介绍一种简单且相对快速的检测方法，用于评估个体CFTR功能及其对CFTR调节剂的反应 体外三维（3D）上皮类器官由直肠活检组织在标准类器官培养基中培养生成。类器官建立后，可进行生物样本库保存，以供后续分析使用。在检测中，将30–80个类器官接种于96孔板中的基底膜基质内，并暴露于药物中。一天后，使用钙黄绿素绿色染料对类器官进行染色，并在37 °C条件下通过共聚焦活细胞显微镜监测佛司可林诱导的肿胀反应。佛司可林诱导的肿胀完全依赖于CFTR功能，且具有足够的敏感性和精确性，能够区分不同个体之间、甚至基因型相同个体之间的药物反应差异 CFTR 突变。 体外 肿胀反应与治疗的临床反应相关。该检测方法提供了一种经济有效的手段，用于识别对药物有反应的个体，且不受CFTR突变类型的影响。该方法还可能在未来的CFTR调节剂开发中发挥重要作用。
引言
囊性纤维化（CF）由编码上皮细胞阴离子通道的囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）基因突变引起。全球约有85,000人受此疾病影响1。目前已鉴定出超过2,000种CFTR突变（www.genet.sickkids.on.ca）。这种突变的多样性部分解释了临床上观察到的广泛疾病表型（www.CFTR2.org）2,3。根据CFTR蛋白表达和功能的影响，CFTR突变被分为六类：(I) 无蛋白合成，(II) 转运障碍，(III) 通道门控缺陷，(IV) 电导异常，(V) 正常功能CFTR蛋白水平降低，以及(VI) 细胞表面稳定性受损4。尽管常见CFTR突变已被广泛研究，但在个体水平上，CFTR功能与其临床状态之间的关系仍不明确，尤其是对于大量罕见的"孤儿"突变而言（www.CFTR2.org）1,3。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本文所述使用人体组织的所有实验均经乌得勒支大学医学中心（UMCU；TcBio #14-008）伦理委员会批准。在威廉明娜儿童医院（WKZ）-UMCU，已从患者处获得关于组织采集、类器官制备、储存及使用的知情同意书。
....| 设备 | 耗材 | 工具 |
| 超净工作台 | 15 和 50 ml 锥形离心管 | Zeiss LSM 800 – Zen 2 (Blue edition) 软件用于图像测量 |
| CO2 培养箱 | 微量离心管 | Microsoft Excel 程序 |
| 细胞培养显微镜（光学显微镜） | 0.22 µm 滤器 | |
| 离心机 | 血清移液管 |
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
图1A 显示了嵌入基底膜基质（BMM）中的一例代表性新鲜分离隐窝。这些隐窝来自一名囊性纤维化（CF）患者的结肠直肠活检组织。通常情况下，每个隐窝可生成一个类器官（图1A–图1C）。由于CFTR功能障碍，大多数结肠CF类器官不呈囊状，而是结构致密，并带有突起和芽状结构（图2A–图2B）。然而，某些CF类器官培养物，尤其是具有较高残余功能的样本，会出现少量呈囊状形态的类器官（图2C），类似于野生型类器官培养物（图2D）。
在对类器官进行传代以扩增培养或接种FIS实验之前，类器官应具有较大的尺寸并形成多个出芽结构，如图3A所示。如果类器官在传代时体积较小且缺乏明显出芽，则会对其培养效果产生不.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文提供了人源结直肠类器官的生成、扩增、冻存与复苏的完整实验方案。尽管我们此前已建立了人源类器官培养体系17，但其他实验室在缺乏实际操作培训的情况下，往往难以成功建立该技术。我们预期这些实验方案将可替代传统的操作培训。
Wnt-3A 条件培养基是成功建立并维持长期类器官培养的最关键试剂之一。事实上，类器官培养可能 "碰撞" 当暴露于低活性的Wnt-3A条件培养基时。由于Wnt-3A条件培养基为实验室自制，因此在制备具有活性的培养基时需考虑多个因素。只有使用高质量的胎牛血清（FBS）配制培养基，才能产生具有活性的Wnt-3A，因为高质量FBS可为L细胞提供适当的生长信号，并有助于疏水性Wnt-3A分子的稳定。当Wnt-3A活性较低时（即， 低 TOP/FOP 比值（见下文）通常是由胎牛血清（FBS）引起的问题。
商用重组Wnt效果较差，因此我们不建议将其用作TOP/FOP Wnt报告基因实验的阳性对照。TOP/Renilla与FOP/Renilla.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
Hans Clevers 是类器官培养技术和佛司可林诱导肿胀实验相关专利的发明人。Jeffrey M Beekman 是佛司可林诱导肿胀实验相关专利的发明人。Sylvia F Boj 和 Robert Vries 就职于 Hubrecht 类器官技术基金会（HUB），该机构拥有类器官技术的独家许可权。除此之外，作者无其他利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了荷兰囊性纤维化基金会（NCFS）的HIT-CF项目、ZonMW（40-00812-98-14103）、威尔海米娜儿童医院研究基金以及CZ和Zilverenkruis/Achmea的资助。我们感谢S. Heida-Michel、M. Geerdink、K.M. de Winter-de Groot和G. Berkers（乌得勒支大学医学中心威尔海米娜儿童医院儿科呼吸科）以及R.H.J. Houwen（乌得勒支大学医学中心威尔海米娜儿童医院儿科消化科）在患者招募及获取活检样本以建立囊性纤维化生物样本库方面所做的贡献。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 高级DMEM’s 改良伊格尔培养基与F-12哈姆营养混合物（Ad-DF）500 ml | 赛默飞世尔科技 Invitrogen | #12634 | 4 ℃ 保存 °C |
| GlutaMax | 赛默飞世尔科技 Invitrogen | #35050 | 4 ℃ 保存 °C |
| Hepes | 赛默飞世尔科技 Invitrogen | # 15630-056 | 4℃保存 °C |
| 青霉素/链霉素 | 赛默飞世尔科技 Invitrogen | #15140-122 | 储存于 -20 °C |
| 96孔培养板 | Cellstar | #655180 | |
| 24孔培养板 | Cellstar | #662160 | |
| 6孔培养板 | Cellstar | #657160 | |
| 不含氯化钙的杜氏磷酸盐缓冲液2 (-) MgCl2) (DPBS) | Life Technologies：Gibco | #14190-094 | 4 ℃下保存 °C |
| 杜尔贝科’s 改良伊格尔培养基 （DMEM）500 ml | 赛默飞世尔科技 Invitrogen | #31966-021 | 用于Wnt-3A条件培养基的制备。4℃保存 °C |
| 胎牛血清（FBS） | Bovogen | #SFBS 批号#11113 | 用于Wnt-3A条件培养基的制备。储存于-20 °C |
| L Wnt3A 细胞系 | ATCC | #CRL-2647 | 用于Wnt-3A条件培养基的制备 |
| TOP/FOP 质粒 | Millipore | #17-285 | 用于检测Wnt活性 |
| pTK-Renilla | Promega | #E2241 | 用于检测Wnt活性 |
| HEK-293 | ATCC | #CRL-1573 | 用于检测Wnt活性 |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | #E1910 | 用于检测Wnt活性 |
| Zeocin | 赛默飞世尔科技 Invitrogen | #R250-01 | Wnt-3A 细胞系筛选 |
| B27添加剂 | 赛默飞世尔科技 Invitrogen | #17504-044 | 储存于 -20 °C |
| N-乙酰半胱氨酸 | Sigma Aldrich | #A9165-5G | 储存于 -20 °C |
| 烟酰胺 | Sigma Aldrich | #N0636 | 储存于 -20 °C |
| 人表皮生长因子（hEGF） | PrepoTech | #AF-100-15 | 储存于 -20 °C |
| 胃泌素 | Sigma Aldrich | #G9145 | 储存于 -20 °C |
| TGFb I型受体抑制剂（A83-01） | Tocris | #2939 | 储存于 -20 °C |
| Y-27632 二盐酸盐（RhoKi） | Selleckchem | #S1049 | 储存于 -20 °C |
| p38 MAPK抑制剂（p38i）（SB202190） | Sigma Aldrich | #S7067 | 储存于 -20 °C |
| Primocin | InvivoGen | #ant-pm-1 | 储存于 -20 °C |
| 人Noggin（hNoggin） | PrepoTech | #120-10C | 储存于 -20 °C |
| 人R-脊椎蛋白3（hRspo-3） | R&D Systems | #3500-RS/CF | 储存于 -20 °C |
| 万古霉素 | Sigma Aldrich | #861987- 250毫克 | 储存于 -20 °C |
| 庆大霉素 | Life Technologies：Gibco | #15710-049 | 储存于 -20 °C |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | Sigma Aldrich | #431788 | 4 ℃下保存 °C |
| Matrigel | 康宁 | #354230 | 储存于 -80 °C |
| TryplE Express | Life Technologies：Gibco | #12605-010 | 用于类器官冻存前的胰蛋白酶消化 |
| 复苏细胞培养冻存液 | Life Technologies：Gibco | #12648010 | 用于冷冻 |
| 钙黄绿素 | Life Technologies：Gibco | #C3100MP | 储存于 -20 °C |
| 福斯科林 | R&D Systems | #1099-50 mg | 储存于 -80 °C |
| Lumacaftor (VX-809) | Selleckchem | #s1565 | 储存于 -80 °C |
| Ivacaftor (VX-770) | Selleckchem | #s1144 | 储存于 -80 °C |
| <强>试剂/材料名称 | <强>溶剂 | <强>储存浓度 | <强>终浓度 |
| GlutaMax | 200 mM | 2 mM | |
| Hepes | 1 M | 10 mM | |
| 青霉素/链霉素 | 10K U/ml 10K µg/ml | 100 U/ml 100 µg/ml | |
| Zeocin | 100 mg/ml | 125 µg/ml | |
| B27添加剂 | 100x | 1x | |
| N-乙酰半胱氨酸 | MiliQ H2O | 500 mM | |
| 烟酰胺 | DPBS | 1 M | 10 mM |
| 人表皮生长因子（hEGF） | DPBS 0.1% BSA | 0.5 mg/ml | 50 ng/ml |
| 胃泌素 | DPBS | 100 µM | 10 nM |
| TGFb I型受体抑制剂（A83-01） | DMSO | 5 mM | 500 nM |
| Y-27632 二盐酸盐（RhoKi） | DMSO | 10 mM | 10 µM |
| p38 MAPK抑制剂（p38i）（SB202190） | DMSO | 30 mM | 10 µM |
| Primocin | 50 mg/ml | 100 µg/ml | |
| 人Noggin（hNoggin） | DPBS 0.1% BSA | 100 µg/ml | 100 ng/ml |
| 人R-脊椎蛋白3（hRspo-3） | 因批次而异 | 300 ng/ml | |
| 万古霉素 | 10 mg/ml | 50 µg/ml | |
| 庆大霉素 | 10 mg/ml | 50 µg/ml | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | MiliQ H2O | 0.5 M | 2 mM |
| 钙黄绿素 | DMSO | 10 µg/ml | 3.3 ng/ml |
| Forskolin | DMSO | 10 mM | 可变的 |
| Lumacaftor (VX-809) | DMSO | 20 mM | 可变的 |
| Ivacaftor（VX-770） | DMSO | 20 mM | 可变的 |
参考文献
- De Boeck, K., Amaral, M. D. Progress in therapies for cystic fibrosis. Lancet Respir Med. 4 (8), 662-674 (2016).
- Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Rev Genet. 16 (1), 45-56 (2015).
- ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
