Method Article

钙化事件的表征在海洋Tubeworm使用实时光学和电子显微镜技术

DOI:

10.3791/55164

⸱

February 28th, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Clemson University, 2Department of Marine Biodiversity Research (BioDive), Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC), 3Advanced Material Research Laboratory (AMRL), Clemson University, 4Swire Institute of Marine Sciences and School of Biological Sciences, The University of Hong Kong

In This Article

Summary

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我们演示了各种显微镜方法的使用，这些方法可用于观察管虫（秀丽隐杆线虫）的钙化，以及定位和表征第一种钙化材料。实时显微镜和电子显微镜一起使用，以提供在研究生物矿化中很重要的功能和材料信息。

Abstract

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表征碳酸钙生物生产的第一个事件需要结合显微镜方法。首先，可以使用实时显微镜观察细胞内 pH 值分布和钙离子随时间的变化。这允许识别生命阶段和具有感兴趣特征的组织，以便进一步进行电子显微镜研究。生命阶段和目标组织的 pH 值和 Ca 信号通常较高。

在这里，使用秀丽隐杆线虫，我们提出了一种方案，在扫描电子显微镜 （SEM） 上表征生物标本中碳酸钙结构的存在，使用能量色散 X 射线光谱 （EDS） 可视化元素组成，使用电子背散射衍射 （EBSD） 确定晶体结构的存在，并使用透射电子显微镜 （TEM） 分析材料的成分和结构。 在该协议中，使用聚焦离子束 （FIB） 来分离尺寸适合 TEM 分析的样品。由于 FIB 是一种特定于位点的技术，因此我们演示了如何使用先前技术中的信息来识别 Ca 信号最高的感兴趣区域。

Introduction

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生物矿化是一个复杂的一系列事件，其中桥接一套导致产生精美有序矿物质1的细胞活动。面临的挑战是表征两个动态细胞过程和使用的光学和电子显微镜方法的组合的复杂的矿物结构。细胞内pH的正视利于碳酸钙晶体的形成，因此，鉴定具有增加的pH的生命阶段揭示当钙化可能被发生2,3的时间。

从家庭的龙介虫科管虫是海洋中的4种常见钙化。这也是海洋研究一种流行的无脊椎动物的模式，尤其是在生物污染5,6。在这项研究中，钙化成矿车厢的过程中杜里NG生物矿化观察。变态的快速过程包括碳酸钙结构7,8的出现。

我们展示了如何pH值内部测量可以在tubeworm进行，以及如何生活阶段，相关的钙化组织可筛选。感兴趣的生命阶段被识别后，负责钙化的组织可被表征在使用电子显微镜的方法更高的分辨率。使用荧光显微镜，我们确定变质诱导后出现需要碳酸钙的时间。人生的一个类似的阶段，随后用SEM-EDS对可视化....

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Protocol

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1.筛选生命阶段和实时成像利益组织

  1. 培养根据先前报道的方法6，7，9海洋幼虫能力。孵育tubeworm幼虫每毫升密度5幼虫用10μMSNARF-凌晨1点通宵过滤的海水。用铝箔覆盖该容器，以防止光致漂白的荧光探针。
  2. 通过观察解剖显微镜的幼虫。主管tubeworm幼虫准备变态将在向前方向，而不是圆周运动游泳。
  3. 转移主管幼虫到60微米的网格。按网格对培养皿中，提供了良好的密封留住液体。快速释放密封释放并丢弃含有荧光染料的海水，保留幼虫。
  4. 洗净用过滤人工海水（FASW）幼虫两次，取注意不要干出过程中的幼虫。
  5. 将10至20幼虫薄玻璃底菜用5毫升含有变态过程观察10 -4 M异丁基（IBMX）FASW的。
  6. 插入滤波器立方体检测SNARF-1信号（通道1:实施例二十五分之五百十EM三十零分之五百八十○;通道2:实施例二十五分之五百十EM三十五分之六百四十○）和幼虫的DIC图像。
  7. 在20X物镜下的变态幼虫的位置，那么，优化快门时间（100-300毫秒）足够快，以确保活体动物的清晰图像被捕获。
  8. 置1微米的距离来捕获所有三个通道的Z堆叠，成像活体动物时，在移动到z方向的下一层将使信道之间的更好的相关性....

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Results

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以下是tubeworm变态过程中钙化过程的一些看法。 图1示出了套环区域附近的pH值下比变态后的其他组织高。 图2I显示了钙的均匀分布，这表明没有大的钙化活动已经开始tubeworm; 图2II表明已钙化对于较长时间的tubeworm，表明钙化已经超越的感兴趣的时间点; 图2III示出了具有所感兴趣的钙化阶段，其选择用于进一步分析，以了解负责矿化组织一个tubeworm。 图3显示了较高的pH值与来自钙黄绿素染色和SEM-EDX测绘较高钙离子信号相关。从这些观察，从感兴趣的生活阶段的组织在一喜了检查采用更加本地化的技术，SEM-EBSD gher分辨率。在矿物相的发现， 图4示出了聚焦离子束的应用解除出来的用于TEM兴趣和选定的区域的衍射分析中的材料，以确认矿物的结晶。

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Discussion

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活光学成像是一种用于在多细胞生物体观测细胞事件的有用方法。这里，内部pH和钙离子的指标被用于测量在矿化站点离子的通量。在这些区域中，活性离子泵送需要提高pH和钙离子浓度，以使钙化2,3。当施加荧光分子研究的有机体，重要的是确保所用的浓度具有可忽略毒性，使生物体在生理相关的方式来执行。较低浓度的染色是毒性较低，通常配上较长的染色时间10。它保持在温育时间幼虫密度低，在染色期间最小化氧气剥夺和废物积累是重要的。

此前追求FIB / TEM方法，它涉及到本地化感兴趣区域，它是通过生命阶段和使用较低分辨率的方法，如SEM-EDS和SEM-EBSD兴趣组织筛选关键。在反向散射模式观察标本的地方能够对比较轻的关联到重原子量11的相对元素组成的可视化。因此，SEM-BSE图像也提供的，其中，如钙离子和锇染色的脂质球较重元件位于的估计。 SEM-EDS分析允许对样品.......

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Disclosures

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作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

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作者非常感谢克莱姆森广播制作公司，J. Bright 的录音，A. D. McQuiston 的旁白，音频甜美，K. Murphy，G. Spake 的摄像，T. Messervy 的图形艺术，T. Messervy 和 E. Rodgers 的视频编辑。技术援助和科学建议的灵感来自于 S. Kawada、S. Kubo、J. Hudson、T. Darroudi、D. Mulwee、H. Qian、Y. W. Lam、M. B. Johnstone、C. Campanati、AC Lane 和 R. Dineshram 的建议。这项研究由香港特别行政区研究资助局的三项 GRF 资助（资助编号：705511P、705112P 和 17304914）。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
六甲基二硅氮烷 电子显微镜科学16700（EM）
四氧化锇 2% 水溶液电子显微镜科学19192
IBMX 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤ThermoFisher ScientificPHZ1124
尼日利亚菌素，游离酸ThermoFisher ScientificN7143-5MG
35 mm 直径培养皿，孔径 27 mm，玻璃 0 号，无涂层ThermoFisher ScientificD110400
5-（and-6）-Carboxy SNARF-1，乙酰氧基甲酯，乙酸盐ThermoFisher ScientificC-1271
BDH 氯化钾，ACS 级VWRBDH0258-500G
多聚甲醛
试剂级，结晶		SigmaP6148
1 M 盐酸，用于体积分析Wako Pure ChemicalIndustries， Ltd083-01095
用于体积分析的 0.05 M 氢氧化钠溶液Wako Pure Chemical Industries， Ltd199-02185
钙黄绿素SigmaC0875
FASWIwaki Co. Ltd.Rei-sea Marine
混合纤维素酯膜;直径 47 mm，直径 0.45 µmADVANTECA045A047A
乙醇Wako Pure Chemical Industries， Ltd051-00476
美国能源部 （1994） 的 SOP06缓冲器用人工海水
氯化钠Wako Pure Chemical Industries， Ltd191-01665
氯化钾Wako Pure Chemical Industries， Ltd163-03545
氯化镁六水合Wako Pure Chemical Industries， Ltd135-00165
氯化钙Wako Pure Chemical Industries， Ltd039-00475
硫酸钠Wako Pure Chemical Industries， Ltd197-03345
盐酸Wako Pure Chemical Industries， Ltd089-08415
2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇（三）Wako Pure Chemical Industries， Ltd207-06275
2-氨基吡啶Wako Pure Chemical Industries， Ltd011-02775
Orion 5 星 Plus pH 计Thermo Scientific
PrpHecT ROSS 微量复合 pH 电极 8220BNWPThermo Scientific
Axiovision，版本 4.6，Axio观察者 Z1蔡司
ImageJNIH，贝塞斯达，马里兰州，美国
HRTEM H500日立
SU6600 VPSEM日立
NB5000 聚焦离子和电子束 （FIB-SEM） 系统日立 
根据的，cdiac.ornl.gov/ftp/cdiac74/sop06.pdf物

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aizenberg, J., et al. Skeleton of Euplectella sp.: structural hierarchy from the nanoscale to the macroscale. Science. 309 (5732), 275-278 (2005).
  2. de Nooijer, L. J., Toyofuku, T., Oguri, K., Nomaki, H., Kitazato, H. Intracellular pH distribution in foraminifera determined by the fluorescent probe HPTS. Limnol Oceanogr Methods. ....

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