我们展示了多种显微技术的应用，这些技术可用于观察管虫Hydroides elegans的钙化过程，并定位及表征其最初形成的钙化物质。活体显微观察与电子显微技术结合使用，以提供研究生物矿化过程中重要的功能与材料信息。
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本文内容
摘要
摘要
表征生物碳酸钙生成的首个事件需要结合多种显微技术。首先，可通过活细胞显微镜随时间观察细胞内pH分布和钙离子情况。这有助于确定具有研究特征的生命阶段和组织，以便进一步开展电子显微镜研究。通常，目标生命阶段和组织的pH值和钙信号较高。
本文以 H. elegans 为例，介绍一种利用扫描电子显微镜（SEM）检测生物样本中碳酸钙结构存在的实验方案，结合能量色散X射线光谱（EDS）可视化元素组成，利用电子背散射衍射（EBSD）确定晶体结构的存在，并通过透射电子显微镜（TEM）分析材料的组成与结构。在本方案中，采用聚焦离子束（FIB）技术制备适合TEM分析的样品。由于FIB是一种具有位点特异性的技术，我们展示了如何利用前述技术获得的信息来定位感兴趣区域，即钙信号最强的区域。
引言
生物矿化是一系列复杂的过程，连接着多种细胞活动，最终形成高度有序的矿物1。挑战在于结合光学显微镜和电子显微镜技术，对动态的细胞过程和复杂的矿物结构进行表征。细胞内pH值升高有利于CaCO3晶体的形成，因此，确定pH值升高的生命阶段，可揭示钙化最可能发生的时间2,3。
龙介虫科（Serpulidae）的管虫是海洋中常见的钙化生物4。它也是海洋研究中常用的无脊椎动物模型，尤其在生物污损研究中应用广泛5,6。本研究观察了生物矿化过程中矿化区室内钙化的过程。这一快速的变态过程包括碳酸钙结构的形成7,8。
我们展示了如何对管栖蠕虫进行体内pH值测量，以及如何筛选与钙化相关的生命阶段和组织。在确定了感兴趣的生命阶段后，可利用电子显微镜方法对负责钙化的组织进行更高分辨率的表征。通过荧光显微镜，我们确定了变态诱导后碳酸钙出现所需的时间。随后，利用扫描电镜-能谱仪（SEM-E....
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方案
1. 利用活体成像技术对目标发育阶段和组织进行筛选
- 根据已报道的方法将海洋幼虫培养至具有变态能力6,7,9。将管状蠕虫幼虫在含有10 µM SNARF-1 AM的过滤海水（每毫升5条幼虫）中于避光条件下孵育过夜。用铝箔覆盖容器，以防止荧光探针发生光漂白。
- 使用解剖显微镜观察幼虫。具有变态能力的管状蠕虫幼虫将向前游动，而非做环形运动。
- 将具有变态能力的幼虫转移至60 µm的滤网中。将滤网紧压在培养皿上，形成良好密封以保留液体。迅速解除密封，释放并弃去含有荧光染料的海水，保留幼虫。
- 用过滤的人工海水（FASW）清洗幼虫两次，注意过程中避免幼虫干燥。
- 将10至20条幼虫置于底部为薄玻璃的培养皿中，加入含10-4 M异丁基甲基黄嘌呤（IBMX）的5 mL FASW，用于观察变态过程。
- 插入滤光片组以检测SNARF-1信号（通道1：激发510/25，发射580/30；通道2：激发510/25，发射640/35），并获取幼虫的微分干涉差（DIC）图像。
- 将正在变态的幼虫置于20倍物镜下，调整快门时间（100–300 ms），确保能够清晰捕捉活体动物的图像。
- 设置1 µm的步距....
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结果
以下是关于管虫变态过程中钙化现象的一些观察结果。图1显示，变态后，领部区域附近的pH值高于其他组织。图2i显示一只钙（Ca）分布均匀的管虫，表明尚未开始显著的钙化事件；图2ii显示一只经历了较长时间钙化的管虫，表明钙化过程已超过本研究关注的时间点；图2iii显示一只处于本研究关注钙化阶段的管虫，被选中用于进一步分析，以明确负责矿化的组织。图3显示，较高的pH值与钙黄素染色和扫描电镜-能量色散X射线（SEM-EDX）图谱中更强的Ca离子信号相关联。基于这些观察结果，研究采用更高空间分辨率的局部分析技术——扫描电镜-电子背散射衍射（SEM-EBSD），对目标生活阶段的组织进行了更深入的观察。在确定矿物相后，图4展示了利用聚焦离子束（FIB）切割并提取目标材料，用于透射电镜（TEM）及选区电子衍射分析，以确认该矿物的晶体性质。
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讨论
活体光学成像是一种用于观察多细胞生物体内细胞事件的有效方法。本研究中，使用了细胞内pH和钙离子指示剂来检测矿化位点的离子流。在这些区域，需要主动的离子泵活动以提高pH值和Ca2+浓度，从而促进钙化过程2,3。当应用荧光分子研究生物体时，关键是要确保所使用的浓度具有可忽略的毒性，并能使生物体以符合生理状态的方式正常活动。较低的染色浓度毒性更小，但通常需要更长的染色时间10。在孵育期间应保持幼虫密度较低，以尽量减少染色过程中缺氧和代谢废物积累的影响。
在采用聚焦离子束/透射电子显微镜（FIB/TEM）方法研究特定局部区域之前，至关重要的是先利用分辨率较低的方法（如扫描电镜-能谱分析（SEM-EDS）和扫描电镜-电子背散射衍射（SEM-EBSD））对目标生命阶段和组织进行初步筛选。在背散射电子模式下观察样品，可实现对相对元素组成的可视化，其中较亮的对比度对应于较重的原子量
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨向克莱姆森广播制作公司致以诚挚感谢，J. Bright 负责音频录制，A. D. McQuiston 负责旁白，K. Murphy 负责音频润色，G. Spake 负责摄影，T. Messervy 负责平面设计，T. Messervy 和 E. Rodgers 负责视频剪辑。本研究的技术支持与科学指导得益于 S. Kawada、S. Kubo、J. Hudson、T. Darroudi、D. Mulwee、H. Qian、Y. W. Lam、M. B. Johnstone、C. Campanati、A. C. Lane 和 R. Dineshram 提供的宝贵建议。本研究由香港特别行政区研究资助局（HKSAR-RGC）提供的三项优配研究金资助（项目编号：705511P、705112P 和 17304914）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 六甲基二硅氮烷 | Electron Microscopy Sciences | 16700(EM) | |
| 四氧化锇 2% 水溶液 | Electron Microscopy Sciences | 19192 | |
| IBMX 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 | ThermoFisher Scientific | PHZ1124 | |
| 尼日尔菌素，游离酸 | ThermoFisher Scientific | N7143-5MG | |
| 35 mm 直径培养皿，孔径 27 mm，玻璃 0 号，未包被 | ThermoFisher Scientific | D110400 | |
| 5-(和-6)-羧基 SNARF-1 乙酰氧甲基酯，乙酸盐 | ThermoFisher Scientific | C-1271 | |
| BDH 氯化钾，ACS 级 | VWR | BDH0258-500G | |
| 多聚甲醛 试剂级，结晶状 | Sigma | P6148 | |
| 1 M 盐酸溶液，用于容量分析 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 083-01095 | |
| 0.05 M 氢氧化钠溶液，用于容量分析 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 199-02185 | |
| 钙黄绿素 | Sigma | C0875 | |
| FASW | Iwaki Co. Ltd. | Rei-sea Marine | |
| 混合纤维素酯膜；直径 47 mm，孔径 0.45 µm | ADVANTEC | A045A047A | |
| 乙醇 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 051-00476 | |
| 缓冲液用人工海水 | 依据 DOE (1994) 的 SOP06，cdiac.ornl.gov/ftp/cdiac74/sop06.pdf | ||
| 氯化钠 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 191-01665 | |
| 氯化钾 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 163-03545 | |
| 六水合氯化镁 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 135-00165 | |
| 氯化钙 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 039-00475 | |
| 硫酸钠 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 197-03345 | |
| 盐酸 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 089-08415 | |
| 2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇（Tris） | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 207-06275 | |
| 2-氨基吡啶 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 011-02775 | |
| Orion 5-star Plus pH 计 | Thermo Scientific | ||
| PrpHecT ROSS 微型复合 pH 电极 8220BNWP | Thermo Scientific | ||
| Axiovision，版本 4.6，Axio Observer Z1 | Zeiss | ||
| ImageJ | NIH, Bethesda, MD, USA | ||
| HRTEM H500 | Hitachi | ||
| SU6600 VPSEM | Hitachi | ||
| NB5000 聚焦离子束与电子束（FIB-SEM）系统 | Hitachi |
参考文献
- Aizenberg, J., et al. Skeleton of Euplectella sp.: structural hierarchy from the nanoscale to the macroscale. Science. 309 (5732), 275-278 (2005).
- de Nooijer, L. J., Toyofuku, T., Oguri, K., Nomaki, H., Kitazato, H. Intracellular pH distribution in foraminifera determined by the fluorescent probe HPTS. Limnol Oceanogr Methods. ....
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