钙化事件的表征在海洋Tubeworm使用实时光学和电子显微镜技术

Summary

我们演示了各种显微镜方法的使用，这些方法可用于观察管虫（秀丽隐杆线虫）的钙化，以及定位和表征第一种钙化材料。实时显微镜和电子显微镜一起使用，以提供在研究生物矿化中很重要的功能和材料信息。

Abstract

表征碳酸钙生物生产的第一个事件需要结合显微镜方法。首先，可以使用实时显微镜观察细胞内 pH 值分布和钙离子随时间的变化。这允许识别生命阶段和具有感兴趣特征的组织，以便进一步进行电子显微镜研究。生命阶段和目标组织的 pH 值和 Ca 信号通常较高。

在这里，使用秀丽隐杆线虫，我们提出了一种方案，在扫描电子显微镜 （SEM） 上表征生物标本中碳酸钙结构的存在，使用能量色散 X 射线光谱 （EDS） 可视化元素组成，使用电子背散射衍射 （EBSD） 确定晶体结构的存在，并使用透射电子显微镜 （TEM） 分析材料的成分和结构。 在该协议中，使用聚焦离子束 （FIB） 来分离尺寸适合 TEM 分析的样品。由于 FIB 是一种特定于位点的技术，因此我们演示了如何使用先前技术中的信息来识别 Ca 信号最高的感兴趣区域。

Introduction

生物矿化是一个复杂的一系列事件，其中桥接一套导致产生精美有序矿物质¹的细胞活动。面临的挑战是表征两个动态细胞过程和使用的光学和电子显微镜方法的组合的复杂的矿物结构。细胞内pH的正视利于_碳酸钙晶体的形成，因此，鉴定具有增加的pH的生命阶段揭示当钙化可能被发生^2,3的时间。

从家庭的龙介虫科管虫是海洋中的⁴种常见钙化。这也是海洋研究一种流行的无脊椎动物的模式，尤其是在生物污染^5,6。在这项研究中，钙化成矿车厢的过程中杜里NG生物矿化观察。变态的快速过程包括碳酸钙结构^7,8的出现。

我们展示了如何pH值内部测量可以在tubeworm进行，以及如何生活阶段，相关的钙化组织可筛选。感兴趣的生命阶段被识别后，负责钙化的组织可被表征在使用电子显微镜的方法更高的分辨率。使用荧光显微镜，我们确定变质诱导后出现需要碳酸钙的时间。人生的一个类似的阶段，随后用SEM-EDS对可视化元素组成的分布，并采用两种不同的电子显微镜方法，尤其是SEM-EBSD和FIB-TEM分析了沉积矿物中。

Protocol

1.筛选生命阶段和实时成像利益组织

1. 培养根据先前报道的方法^6，7，9海洋幼虫能力。孵育tubeworm幼虫每毫升密度5幼虫用10μMSNARF-凌晨1点通宵过滤的海水。用铝箔覆盖该容器，以防止光致漂白的荧光探针。
2. 通过观察解剖显微镜的幼虫。主管tubeworm幼虫准备变态将在向前方向，而不是圆周运动游泳。
3. 转移主管幼虫到60微米的网格。按网格对培养皿中，提供了良好的密封留住液体。快速释放密封释放并丢弃含有荧光染料的海水，保留幼虫。
4. 洗净用过滤人工海水（FASW）幼虫两次，取注意不要干出过程中的幼虫。
5. 将10至20幼虫薄玻璃底菜用5毫升含有变态过程观察10 ^-4 M异丁基（IBMX）FASW的。
6. 插入滤波器立方体检测SNARF-1信号（通道1:实施例二十五分之五百十EM三十零分之五百八十○;通道2:实施例二十五分之五百十EM三十五分之六百四十○）和幼虫的DIC图像。
7. 在20X物镜下的变态幼虫的位置，那么，优化快门时间（100-300毫秒）足够快，以确保活体动物的清晰图像被捕获。
8. 置1微米的距离来捕获所有三个通道的Z堆叠，成像活体动物时，在移动到z方向的下一层将使信道之间的更好的相关性之前，成像所有三个通道的每一层。
9. 对所有通道和图层作为从显微镜软件TIF文件导出灰度图像:文件|出口|文件类型TIF |开始。
10. 使用ImageJ，即时通讯端口各通道的图像序列:文件|进口|图像序列。
    1. 要导入通道_1λ1 ^EM，输入起始影像3和增量:4。
    2. 要导入通道_2λ2 ^EM，输入起始影像4和增量:4。
11. 通过将_λ2 ^EM由_λ1 ^EM每一层逐个像素生成的合成图像（流程|图片计算器... |图像文件640纳米的"鸿沟"的图像文件580纳米），即五百八分之六百四纳米比。
12. 选择图片|查找表| 16种颜色。
13. 选择分析|工具|校准条。
14. 检查不同的层，识别包含最异质层。这提供了关于内部pH值分布最有用的信息。
15. 使用之间五百八十零分之六百四十〇纳米比和pH值之间的关系，建立一个情节信息可视化内部pH值的分布。

2。内部pH值的校准

1. 10μMSNARF-凌晨1点20左右幼虫隔夜染色后，加入尼日利亚和氯化钾库存解决方案，以弥补50μM尼日利亚和150毫米氯化钾进行校准。
2. 调整用稀的NaOH或HCl校准AFSW的pH值，直到pH值周围5.9实现。记下确切的pH值。测量pH值用pH计用玻璃电极的基于已经校准由海水2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇（TRIS）和2-氨基吡啶^9。
3. 一起用液体具有已知pH值在640 nm和580nm处传送一个染色tubeworm幼虫一个干燥和清洁盘为信号强度的测量。
4. 重复步骤2.2和2.3四个点的pH范围为5.9至9.9。它们代表了一系列生理相关的值。
5. 检查以确保信号出现在整个动物体内均匀。这表明，细胞内pH一直ëquilibrated与环境海水。
6. 图像在五个不同的海水的pH环境中tubeworm幼虫，记录示为在640纳米"灰度值"，并在580纳米，即，λ2 EXC，λ1 EXC的强度。

3.比例式成像数据分析

1. 从五胡乱地点或从上一试算表感兴趣的区域测量输入灰度值。
2. 检查看看，五点校准呈线性关系，表明细胞内pH（ 例如 ，像方程Y = 0.30x - 1.47; Y =灰度值; X = pH值; R = 0.934）。
3. 从使用测量五百八十零分之六百四十〇纳米强度比在步骤1.13的方程式计算细胞内pH值。

4.样品保鲜，脱水和安装电子显微镜

1. 保留的用4％多聚甲醛感兴趣的生命阶段。在这个研究中，修复管虫2-4天附着后，保持动物固定液直至分析。
2. 在通风橱中工作时，后固定，用1％四氧化锇水溶液试样30分钟期间脱水过程，以减少组织的收缩。
3. 脱水用梯度乙醇系列试样:50％的乙醇5分钟，70％的乙醇5分钟，85％的乙醇5分钟，95％乙醇进行5分钟，和5分钟最后无水乙醇两次。
4. 在通风橱中工作，则添加1:乙醇和六甲基二硅氮烷（HMDS）1溶液向试样，允许液体完全蒸发。
5. 在通风柜，100％的HMDS添加到样品，允许液体完全蒸发。
6. 使用钻石刀，介绍几个切到培养皿中，周围一些管虫。盖上盖子，按住底部的菜对铝存根打破菜。
7. 在解剖镜下，发现包含一个完整的tubeworm骨折片。
8. 应用银漆以铝存根和碎片小心地固定在存根。漆围绕塑料碎片的边缘，以减少充电。

5.定位钙丰富的地区运用SEM-EDS

1. 使试样存根到样品保持器。
2. 衡量设置有显微镜的计整个组件的高度，通过松开锁紧垫圈和旋转后调整高度直到试样是在标准高度，或输入的高度所记录。
3. 允许空气进入显微镜交换室和摆动室门打开。样品架滑动到交换杆的端部。然后关闭并撤离室。
4. 打开闸阀和朝向显微镜室中滑动的交换杆。在滑动杆交换一路样品架完全固定在显微镜阶段。删除Exchange杆和关闭闸阀。
5. 输入采样他样品尺寸和发送阶段初始位置放置电子柱下方的样本。
6. 坐落在VP-SEM模式室真空度为20-30帕。设置电子加速电压20千伏，并打开高压。
7. 提高阶段为10毫米的样品的工作距离。收购活饲料，并找到标本。优化图像调整散光，并根据需要聚焦。
8. 打开SEM-EDS程序，并选择EDS-SEM模式选项。选择菜单选项来运行的EDS图。
9. 变更聚光透镜和光圈设定在3的处理时间内实现的〜30％的死区时间通过在SEM-EDS节目的速率计监测。使得梁设置进行任何更改后运行光束和光圈调整程序。
10. 选择一个放大率使得单个生物体填充的整个视场。启用漂移校正选项，并在SEM-EDS程序捕获图像。
11. 收购马与生物体填充的整个视野​​，使用50-100毫秒的停留时间数p的数据。跑地图，直到数据显示有机体（约15分钟）内钙的独特定位。
12. 以获得点量化数据，改变工艺时间为6，并调整电子探针获得的〜30％的死区时间。运行调整的步骤和优化图像是必要的。
13. 选择在SEM-EDS程序指向和ID选项，并获得另一幅图像。使用单点工具，请单击上出现钙丰富的EDS图，以及钙缺乏的地区进行比较的区域。扫描每个点为30秒的生存时间。

6.确定钙丰富的地区的晶体信息使用SEM-EBSD

1. 从扁试样存根消除利益塑料含有片段标本并加盖用导电银胶45°的预倾斜存根的倾斜面。
2. 拧存根到样品H老年人和朝向样本保持器的正面位置存根的倾斜面（用试样）。插入样品架到使用交换室显微镜的腔室。
3. 设置室真空至30Pa和电子加速电压20千伏。发送电子柱下方的样品和倾斜级25°到样品表面从正常大约70°放置于电子束。开启高电压。
4. 提高阶段的〜18mm的工作距离。使用轨迹球移动舞台，找到一个标本。增加放大倍数帧感兴趣的特定功能。对准光束和优化图像是必要的。
5. 打开该电子背散射衍射模式的SEM-EDS计划。选择方解石和文石为感兴趣相。将相机EBSD在154毫米的距离。将相机条件为1×1分档和一个100毫秒的帧时间。使用快速束光栅，收购的背景。
   注:不同的帧速率可以根据电子探针需;调整探头或相机帧速率达到约90％的信号。
6. 捕获在SEM-EDS节目的图像。使用现场分析工具，然后单击某处图像扫描该点的光束。观察摄像头窗口，看是否检测到任何菊池模式。
7. 点击图像的不同区域进行扫描电位钙化位点，观察照相机窗口在每个点，以查看是否菊池频带都存在。如果图案是本和匹配任何数据库中的所选阶段的，它们将自动地被索引。

透射电镜7.样品制备使用FIB-SEM

1. 溅射涂层制备的扫描电镜样品用铂或类似材料以产生导电层。
   1. 将以前固定，脱水，并安装到标本溅射镀膜机的外壳和接通电源，开始抽水室了。
   2. 一旦该腔室真空读取40毫乇或更少，打开煤气开关并增加氩气流量达到200毫托的室压。调节气体流量，以达到80毫托的最终腔室压力。
   3. 开启电压切换开关，并增加电压达到15毫安的电流。设置定时器和涂层中的时间过长（〜10分钟），以创建从离子辐照损坏保护样品表面的厚层（〜60纳米）。调节，以保持一个稳定的15毫安电流的电压。
   4. 一旦完成后，涂布器以释放真空并除去样品掉电。
2. 螺钉所制备的基底，溅射涂覆的样品到仪器样品架的M4螺钉讯息。直到拧紧手，松开锁紧螺母，然后旋转样品架后改变组件的高度。使用激光高度计和标准与供应的（如在视频显示= 0.04英寸）调整高度为1mm以内ð与仪器。
3. 关闭在FIB-SEM所有枪阀门，然后让空气进入eucentric阶段气闸。一旦压力与环境均衡，滑动空气锁打开并加盖样本保持器到交换杆的尖头。打开交换杆的端部的旋钮的"锁定"位置。关闭空气锁并撤离气闸室。
4. 一旦eucentric级空气锁已被疏散和压力相匹配的FIB-SEM室，打开闸阀，并在交流中杆推插入样品。在滑动交换杆一路在仪器eucentric阶段样品架座，则交换杆旋转到"解锁"位置上。滑动杆交换背出，关闭闸阀。
5. 移动台到所述离子束列下的样本位置。打开闸阀，并获得FIB的活离子引起的二次电子图像。使用低倍率和快速光栅扫描，以尽量减少离子损伤。重置普通观察光束的聚焦，提高阶段的Z高度，直到所述样品是在焦点。在这一点上，样品是在其中两个所述离子和电子束聚焦在同一位置的交叉点的位置。
6. 从扫描电镜使用二次电子图像，定位在标本感兴趣的区域，使用轨迹球来移动样品。感兴趣的领域是先前由EDS图谱测定钙丰富的地区。旋转作为必要得到的符合窗口的框架感兴趣的特征的阶段。
7. 上的FIB窗口接口，捕获样品的快照在1,000X的与另外的2X数字变焦的倍率和在感兴趣的区域绘制〜8微米×2微米的沉积模板。沉积箱的倍率尺寸可以调整，以适应不同尺寸的特征。设定溅射条件下，使用一个40千伏至淀积碳，0.09 nA的光束，采用0.5微秒的停留时间为5分钟。
8. 碳的沉积后，修改沉积条件使用40千伏，0.7 nA的光束，并沉积5分钟，以产生一〜2-3微米钨帽以沉积钨。
9. 捕获使用观察光束FIB快照，并使用微量取样溅射工具绘制围绕钨帽四个框的模式。设置的上，下框为约15μm×8微米;右箱10微米×5微米，和左框6微米×5微米，或大到足以包围感兴趣的区域。
   1. 修改的制造条件下，使用一个40千伏，19 nA的光束，和50微秒，以及每个框3-4扫描帧的驻留时间，以切断。然后制作图案。制造，感兴趣的区域，以保护Ç和W层之后，将类似于一个岛，在顶部，底部，和右边除去所有相邻的材料。
10. 倾斜级58°把SAMP勒表面法线到电子柱中，在一个陡峭的角度，以在离子柱。找到样本"孤岛"使用FIB的背面，并在捕捉放大倍数1000倍和2-4X数码变焦快照。
11. 在其中，它是可见的最末端绘制在样品的背面的底部上的〜15微米×2微米的溅射图案"岛"。制造使用4 nA的光束的框3分钟，或直到光束已经穿过样品的底切"岛"。
12. 倾斜eucentric阶段从当前位置（回零）-58°。通过点击"探头"，在FIB接口将钨微量取样探头。选择"MS"的舞台控制面板上，并使用轨迹球在试样的顶部移动探头。
13. 以1 KX的倍率获取来自FIB活饲料，并且使得尖端是直接的微量样品的钨盖的右侧上方的探针的位置。同时观察活从SEM SE图像，使用阶段面板的Z控制旋钮降低探针，直到它接触钨帽。蜂鸣器发声，一旦接触已经取得进展。
14. 捕获使用FIB使用40千伏，0.01 nA的束快照，在1000倍和2倍数码变焦的放大倍数。使用沉积工具在它已接触微量样品的钨帽的探针的末端画出2微米×2微米的框。
    1. 设定的条件使用40千伏，0.09 nA的光束以沉积钨，2分钟和0.5微秒的停留时间。然后制作图案。
15. 绘制〜2微米×5微米的溅射图案在微量样品的左端"臂"（其中它仍然连接到散装样品的）。使用40千伏制造的图案，0.7 nA的光束，进行2分钟，或直至蜂鸣表明微量样品已经从散装样品分离。
16. 使用Z控制旋钮附加到微量样品提高探头它清除了大样，然后缩回探头。发送eucentric阶段主页或交换位置。
17. 放置一个铜半格成侧面入口支架和支架加载到侧入口阶段清洗室。疏散室，并插入侧进持有人。将持有人的FIB位置。
18. 台上按控制面板上侧，并使用轨迹球带来的半格眼帘的FIB监视器上。移动以清洁半格的区域和使用Z旋钮表面带入焦点。
19. 按探针在插入阶段控制面板上的探针，按MS和使用轨迹球和Z旋钮在半格到微量样品的位置。降低探头，直到接触微量样品格。
20. 捕获的FIB图像在放大1000倍（2X变焦）。使用沉积工具，并通过微量样品的下侧绘制〜10微米×3微米的图案。存款钨为40千伏，0.7 nA的光束，利用停留Ť0.5微秒3分钟IME。
21. 使用溅射工具和在探针的末端画小1微米×3微米的图案。使用40千伏，0.7 nA的光束在3毫秒的停留时间，以切割探针从微量样品远离制造的图案。缩回探头一次免费的。
22. 捕获在5000倍放大倍率的FIB图像，并绘制两个溅射图案在微量样品的顶部和底部7微米×4微米，而使箱之间的〜1微米的间隙。居中的图案，以便不切割微量样品的左，右两侧。制造使用40千伏，4 NA光束，和3微秒的停留时间，这两个图案2分钟，设置朝向微量样品的中心光栅方向。
23. 使用捕捉在5000倍的FIB观察梁另一个图像。调整之前的溅射框〜6.5微米×1微米，靠拢在一起，留下〜差距0.5微米，并制造使用40千伏，0.7 nA的光束。
24. 倾斜侧入门阶段0.5°和瓶盖TURE另一FIB图像。调整溅射箱6微米宽。在微量样品的顶侧的顶部图案的位置，并用40千伏，0.7 nA的光束制造。倾斜-0.5°并且与微量样品的下溅射图案侧和底侧重复。
25. 进一步降低由〜0.5微米的图案宽度。倾斜0.5°，并用40千伏，0.09 nA的光束溅射微量样品的顶侧。在-0.5°倾斜的底侧重复。
26. 倾斜的舞台2.2°，在1万倍获取FIB图像。调整溅射模式，以5微米，宽光束改变条件，5千伏，0.03呐。上部图案在微量样品的上侧，放置直到顶边，和制造。倾斜-2.2°，与下侧和底部图案重复。
27. 重复5千伏铣步骤，直到微量样品变成电子透明（约100纳米厚）。一旦完成后，关闭gunvalves并卸下侧入座。

8.Øbtaining选区衍射图样上的TEM

1. 为了准备分析仪器，请在两个杜瓦液氮瓶和加速电压为300千伏。
2. 使用FIB样品制备后，取出从FIB-SEM的侧入架和调整脚位置，使得持有人的长度相匹配的300千伏TEM的。旋转支架到正确的观察位置的提示，再次比较它与标准的TEM持有人，以确保正确的采样方向。
   1. 另外，卸下半格与标准TEM持有人的FIB-SEM座和地方附加片状结晶。
3. 加载样本保持器插入TEM的交换室和排空腔室。确保每当空气被允许进入交换室仪器枪阀关闭。一旦交换室已抽了下来，一个发出报警声。样品架顺时针旋转，让VACU微米拉样品架中的第一停止位置。
4. 让仪器真空收回，然后打开阀门枪。重新聚焦和变焦至约1万倍的放大倍数。
5. 使用对准旋钮光束转移到荧光屏的中心。收缩和扩张的光束，并确保所有光束移动同心。调整聚光散光是必要的。
6. 逆时针旋转样品架，并允许该真空在支架拉完全插入柱。使用台移动旋钮导航和定位的样本。
7. 增加样品上放大和调整的Z高度，直到所述样品是在焦点。使用光学目镜是必要的。
8. 插入相机，取出荧光屏。展开必要的光束，以避免过饱和相机。调整焦距和摄像机参数，然后开始采集捕获的图像。
9. 为了获得一个衍射图样，第一中心感兴趣的功能。除去客观光圈和插入衍射光圈。
10. 按控制面板上的按钮，DIFF更改为衍射镜片模式，并使用DIFF控制旋钮缩小光束。
11. 插入必要的消隐，以防止衍射图案的中心从燃烧相机或荧光屏。开始采集的相机捕捉到图案的图像。

Results

以下是tubeworm变态过程中钙化过程的一些看法。 图1示出了套环区域附近的pH值下比变态后的其他组织高。 图2I显示了钙的均匀分布，这表明没有大的钙化活动已经开始tubeworm; 图2II表明已钙化对于较长时间的tubeworm，表明钙化已经超越的感兴趣的时间点; 图2III示出了具有所感兴趣的钙化阶段，其选择用于进一步分析，以了解负责矿化组织一个tubeworm。 图3显示了较高的pH值与来自钙黄绿素染色和SEM-EDX测绘较高钙离子信号相关。从这些观察，从感兴趣的生活阶段的组织在一喜了检查采用更加本地化的技术，SEM-EBSD gher分辨率。在矿物相的发现， 图4示出了聚焦离子束的应用解除出来的用于TEM兴趣和选定的区域的衍射分析中的材料，以确认矿物的结晶。

Discussion

活光学成像是一种用于在多细胞生物体观测细胞事件的有用方法。这里，内部pH和钙离子的指标被用于测量在矿化站点离子的通量。在这些区域中，活性离子泵送需要提高pH和钙^离子浓度，以使钙化^2,3。当施加荧光分子研究的有机体，重要的是确保所用的浓度具有可忽略毒性，使生物体在生理相关的方式来执行。较低浓度的染色是毒性较低，通常配上较长的染色时间^10。它保持在温育时间幼虫密度低，在染色期间最小化氧气剥夺和废物积累是重要的。

此前追求FIB / TEM方法，它涉及到本地化感兴趣区域，它是通过生命阶段和使用较低分辨率的方法，如SEM-EDS和SEM-EBSD兴趣组织筛选关键。在反向散射模式观察标本的地方能够对比较轻的关联到重原子量¹¹的相对元素组成的可视化。因此，SEM-BSE图像也提供的，其中，如钙离子和锇染色的脂质球较重元件位于的估计。 SEM-EDS分析允许对样品...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
六甲基二硅氮烷	电子显微镜科学	16700（EM）
四氧化锇 2% 水溶液	电子显微镜科学	19192
IBMX 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤	ThermoFisher Scientific	PHZ1124
尼日利亚菌素，游离酸	ThermoFisher Scientific	N7143-5MG
35 mm 直径培养皿，孔径 27 mm，玻璃 0 号，无涂层	ThermoFisher Scientific	D110400
5-（and-6）-Carboxy SNARF-1，乙酰氧基甲酯，乙酸盐	ThermoFisher Scientific	C-1271
BDH 氯化钾，ACS 级	VWR	BDH0258-500G
多聚甲醛 试剂级，结晶	Sigma	P6148
1 M 盐酸，用于体积分析	Wako Pure ChemicalIndustries， Ltd	083-01095
用于体积分析的 0.05 M 氢氧化钠溶液	Wako Pure Chemical Industries， Ltd	199-02185
钙黄绿素	Sigma	C0875
FASW	Iwaki Co. Ltd.	Rei-sea Marine
混合纤维素酯膜;直径 47 mm，直径 0.45 µm	ADVANTEC	A045A047A
乙醇	Wako Pure Chemical Industries， Ltd	051-00476
美国能源部 （1994） 的 SOP06	缓冲器用人工海水
氯化钠	Wako Pure Chemical Industries， Ltd	191-01665
氯化钾	Wako Pure Chemical Industries， Ltd	163-03545
氯化镁六水合	Wako Pure Chemical Industries， Ltd	135-00165
氯化钙	Wako Pure Chemical Industries， Ltd	039-00475
硫酸钠	Wako Pure Chemical Industries， Ltd	197-03345
盐酸	Wako Pure Chemical Industries， Ltd	089-08415
2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇（三）	Wako Pure Chemical Industries， Ltd	207-06275
2-氨基吡啶	Wako Pure Chemical Industries， Ltd	011-02775
Orion 5 星 Plus pH 计	Thermo Scientific
PrpHecT ROSS 微量复合 pH 电极 8220BNWP	Thermo Scientific
Axiovision，版本 4.6，Axio观察者 Z1	蔡司
ImageJ	NIH，贝塞斯达，马里兰州，美国
HRTEM H500	日立
SU6600 VPSEM	日立
NB5000 聚焦离子和电子束 （FIB-SEM） 系统	日立