我们展示了多种显微技术的应用，这些技术可用于观察管虫Hydroides elegans的钙化过程，并定位及表征其最初形成的钙化物质。活体显微观察与电子显微技术结合使用，以提供研究生物矿化过程中重要的功能与材料信息。
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本文内容
摘要
摘要
表征生物碳酸钙生成的首个事件需要结合多种显微技术。首先，可通过活细胞显微镜随时间观察细胞内pH分布和钙离子情况。这有助于确定具有研究特征的生命阶段和组织，以便进一步开展电子显微镜研究。通常，目标生命阶段和组织的pH值和钙信号较高。
本文以 H. elegans 为例，介绍一种利用扫描电子显微镜（SEM）检测生物样本中碳酸钙结构存在的实验方案，结合能量色散X射线光谱（EDS）可视化元素组成，利用电子背散射衍射（EBSD）确定晶体结构的存在，并通过透射电子显微镜（TEM）分析材料的组成与结构。在本方案中，采用聚焦离子束（FIB）技术制备适合TEM分析的样品。由于FIB是一种具有位点特异性的技术，我们展示了如何利用前述技术获得的信息来定位感兴趣区域，即钙信号最强的区域。
引言
生物矿化是一系列复杂的过程，连接着多种细胞活动，最终形成高度有序的矿物1。挑战在于结合光学显微镜和电子显微镜技术，对动态的细胞过程和复杂的矿物结构进行表征。细胞内pH值升高有利于CaCO3晶体的形成，因此，确定pH值升高的生命阶段，可揭示钙化最可能发生的时间2,3。
龙介虫科（Serpulidae）的管虫是海洋中常见的钙化生物4。它也是海洋研究中常用的无脊椎动物模型，尤其在生物污损研究中应用广泛5,6。本研究观察了生物矿化过程中矿化区室内钙化的过程。这一快速的变态过程包括碳酸钙结构的形成7,8。
我们展示了如何对管栖蠕虫进行体内pH值测量，以及如何筛选与钙化相关的生命阶段和组织。在确定了感兴趣的生命阶段后，可利用电子显微镜方法对负责钙化的组织进行更高分辨率的表征。通过荧光显微镜，我们确定了变态诱导后碳酸钙出现所需的时间。随后，利用扫描电镜-能谱仪（SEM-EDS）对相似的生命阶段进行观察，以分析元素组成的分布情况，并采用两种不同的电子显微镜方法——即扫描电镜-电子背散射衍射（SEM-EBSD）和聚焦离子束-透射电子显微镜（FIB-TEM）——对沉积的矿物进行分析。
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方案
1. 利用活体成像技术对目标发育阶段和组织进行筛选
- 根据已报道的方法将海洋幼虫培养至具有变态能力6,7,9。将管状蠕虫幼虫在含有10 µM SNARF-1 AM的过滤海水（每毫升5条幼虫）中于避光条件下孵育过夜。用铝箔覆盖容器，以防止荧光探针发生光漂白。
- 使用解剖显微镜观察幼虫。具有变态能力的管状蠕虫幼虫将向前游动，而非做环形运动。
- 将具有变态能力的幼虫转移至60 µm的滤网中。将滤网紧压在培养皿上，形成良好密封以保留液体。迅速解除密封，释放并弃去含有荧光染料的海水，保留幼虫。
- 用过滤的人工海水（FASW）清洗幼虫两次，注意过程中避免幼虫干燥。
- 将10至20条幼虫置于底部为薄玻璃的培养皿中，加入含10-4 M异丁基甲基黄嘌呤（IBMX）的5 mL FASW，用于观察变态过程。
- 插入滤光片组以检测SNARF-1信号（通道1：激发510/25，发射580/30；通道2：激发510/25，发射640/35），并获取幼虫的微分干涉差（DIC）图像。
- 将正在变态的幼虫置于20倍物镜下，调整快门时间（100–300 ms），确保能够清晰捕捉活体动物的图像。
- 设置1 µm的步距以采集三个通道的Z轴层扫图像；在对活体动物成像时，应在移动至下一个Z轴层面之前，完成当前层面所有三个通道的成像，以实现通道间更好的相关性。
- 从显微镜软件中将所有通道和层面的灰度图像导出为TIF文件：文件 | 导出 | 文件类型 TIF | 开始。
- 使用ImageJ导入每个通道的图像序列：文件 | 导入 | 图像序列。
- 导入通道1 λ1em时，输入起始图像编号为3，增量为4。
- 导入通道2 λ2em时，输入起始图像编号为4，增量为4。
- 对每一层进行逐像素的λ2em除以λ1em运算，生成复合图像（处理 | 图像计算器... | 640 nm图像文件 "除以" 580 nm图像文件），即640/580 nm比值图像。
- 选择 图像 | 查找表 | 16色。
- 选择 分析 | 工具 | 标尺条。
- 检查不同层面，识别出异质性最显著的层面，该层面可提供关于内部pH分布的最有价值信息。
- 利用640/580 nm比值与pH之间的关系，构建轮廓图以可视化内部pH的分布情况。
2. 内部pH的校准
- 将约20条幼虫用10 µM SNARF-1 AM染色过夜后，加入尼日里菌素（nigericin）和KCl的储备液，配制成含50 µM尼日里菌素和150 mM KCl的溶液用于校准。
- 用稀释的NaOH或HCl调节校准用人工海水（AFSW）的pH值，直至pH值达到约5.9，记录确切的pH值。使用玻璃电极pH计测量pH值，该pH计需使用基于海水的2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇（Tris）和2-氨基吡啶进行校准9。
- 将一条已染色的管栖蠕虫幼虫连同已知pH值的液体转移至干燥洁净的培养皿中，测量其在640 nm和580 nm处的信号强度。
- 重复步骤2.2和2.3，再测定另外四个pH点（范围从5.9至9.9），这些pH值代表生理上相关的一系列数值。
- 检查信号是否在整个动物体内分布均匀，这表明细胞内pH已与周围海水环境达到平衡。
- 在五种不同海水pH环境下对管栖蠕虫幼虫进行成像，记录在640 nm和580 nm处的信号强度（即λ2exc和λ1exc），以"灰度值"表示。
3. 比值成像数据的分析
- 在电子表格中输入从五个随机位置或感兴趣区域测得的灰度值。
- 检查五点校准是否显示出线性关系，以指示细胞内pH值例如，方程如 y = 0.30x - 1.47；其中 y 为灰度值，x 为 pH 值，R² = 0.934。
- 根据步骤1.13中测得的640/580 nm强度比，利用方程计算细胞内pH值。
4. 电子显微镜样品的保存、脱水与封片
- 使用4%多聚甲醛固定目标生活史阶段。本研究中，在管状蠕虫附着后2-4天进行固定，并将样品保存在固定液中直至分析。
- 在通风橱中，用1%四氧化锇水溶液对样品进行后固定，处理30分钟，以尽量减少脱水过程中的组织收缩。
- 采用梯度乙醇系列对样品进行脱水：50%乙醇5分钟，70%乙醇5分钟，85%乙醇5分钟，95%乙醇5分钟，最后用无水乙醇处理两次，每次5分钟。
- 在通风橱中，向样品加入体积比为1:1的乙醇与六甲基二硅氮烷（HMDS）混合溶液，待液体完全挥发。
- 在通风橱中，向样品加入100% HMDS，待液体完全挥发。
- 使用金刚石刀在培养皿上切出数道切口，围绕若干管状蠕虫。盖上皿盖后，将培养皿底部紧贴铝质载片，将其折断。
- 在解剖显微镜下，寻找含有完整管状蠕虫的断裂碎片。
- 在铝质载片上涂抹导电银漆，小心地将碎片固定于载片上。在塑料碎片边缘周围涂漆，以减少电荷积累。
5. 使用扫描电镜-能谱仪（SEM-EDS）定位富含钙的区域
- 将样品台固定在样品 holder 上。
- 使用显微镜附带的量规测量整个组件的高度，通过松开锁紧垫圈并旋转支柱来调节高度，直至样品达到标准高度，或输入已记录的高度值。
- 向显微镜交换室中通入空气，打开交换室门。将样品 holder 滑至交换杆末端，然后关闭并抽空交换室。
- 打开闸阀，将交换杆向显微镜腔室方向推入。将交换杆完全推入，使样品 holder 完全就位到显微镜载物台上。取出交换杆并关闭闸阀。
- 输入样品尺寸，并将载物台移至“Home”位置，使样品位于电子束柱下方。
- 在 VP-SEM 模式下将腔室真空度设为 20–30 Pa。将电子加速电压设为 20 kV，并开启高压。
- 升高载物台，使样品工作距离为 10 mm。获取实时图像并定位样品。根据需要调节像散和聚焦，以优化图像质量。
- 打开 SEM-EDS 程序，选择 EDS-SEM 模式选项。选择菜单中的 EDS 面扫描（map）运行选项。
- 调整聚光镜和光阑设置，使在 SEM-EDS 程序中通过计数率表监测时，处理时间为 3 时的探头“死时间”约为 30%。每次更改束流设置后，均需运行束流和光阑对中程序。
- 选择合适的放大倍数，使单个生物体充满整个视野。启用漂移校正功能，并在 SEM-EDS 程序中采集一幅图像。
- 以 50–100 ms 的驻留时间，对充满整个视野的生物体进行面扫描数据采集。持续运行面扫描，直至数据清晰显示生物体内 Ca 的定位分布（约 15 分钟）。
- 为获得定点定量数据，将处理时间改为 6，并调节电子探针，使“死时间”约为 30%。执行对中步骤，并根据需要优化图像。
- 在 SEM-EDS 程序中选择“Point and ID”选项并采集另一幅图像。使用单点工具，点击 EDS 面扫描图中显示富含 Ca 的区域，以及 Ca 缺乏的区域作为对照。每个点扫描的实时时间为 30 秒。
6. 使用扫描电镜-电子背散射衍射技术鉴定富钙区域的晶体学信息
- 从平面样品台上取下含有目标样本的塑料碎片，并使用银导电胶将其固定在45°预倾斜样品台的斜面上。
- 将样品台拧紧在样品托上，并使样品台的倾斜面（含样品）朝向样品托前端。通过交换室将样品托插入显微镜腔体中。
- 将腔体真空度设为30 Pa，电子加速电压设为20 kV。将样品送至电子柱下方，并将样品台倾斜25°，使样品表面与电子束法线方向夹角约为70°。开启高压。
- 升高样品台至约18 mm的工作距离。使用轨迹球移动样品台并定位样本。增加放大倍数以框选感兴趣的特定结构。根据需要对电子束进行校准并优化图像。
- 在SEM-EDS程序中打开EBSD模式。选择方解石（calcite）和文石（aragonite）作为目标物相。将EBSD相机推进至154 mm的距离。设置相机条件为1×1 binning模式，帧时间为100 ms。使用快速电子束扫描获取背景图像。
注意：根据电子探针的不同，可能需要调整帧率；请调节探针参数或相机帧率，以获得约90%的信号强度。 - 在SEM-EDS程序中捕获一幅图像。使用点分析工具，在图像上某处点击以对该点进行电子束扫描。观察相机窗口，判断是否检测到菊池花样（Kikuchi patterns）。
- 点击图像上的不同区域，扫描潜在的钙化位点，并在每个点观察相机窗口中是否存在菊池衍射带（Kikuchi bands）。如果出现衍射花样且与数据库中选定的任一物相匹配，则系统将自动完成标定。
7. 使用聚焦离子束-扫描电子显微镜制备透射电子显微镜样品
- 使用铂或类似材料对制备好的 SEM 样品进行溅射镀膜，以形成导电层。
- 将先前固定、脱水并安装好的样品放入溅射镀膜仪的腔室内，打开电源开始抽真空。
- 当腔室真空度达到 40 mTorr 或更低时，打开气体开关，增加氩气流量，使腔室压力升至 200 mTorr。调节气体流量，最终将腔室压力稳定在 80 mTorr。
- 打开电压开关，升高电压至电流达到 15 mA。设定计时器，进行较长时间的镀膜（约 10 分钟），以形成较厚的镀层（约 60 nm），保护样品表面免受离子辐照损伤。调节电压以维持稳定的 15 mA 电流。
- 完成后，关闭镀膜仪电源以释放真空，取出样品。
- 将已制备并完成溅射镀膜的样品基座旋紧到仪器样品台的 M4 螺纹柱上。用手拧紧后，松开锁紧螺母，然后旋转样品台支柱以调节组件高度。使用激光高度规，将高度调整至与仪器附带的标准件相差 1 mm 以内（视频中显示为 0.04 英寸）。
- 关闭 FIB-SEM 中所有枪阀，然后向共心级空气锁中通入空气。待压力与环境平衡后，滑开空气锁，将样品台固定在换样杆的叉状端上。将换样杆末端的旋钮转至 "lock" 位置。关闭空气锁，并对空气锁腔室进行抽真空。
- 当共心级空气锁被抽真空且压力与 FIB-SEM 腔室压力一致时，打开闸阀，通过推进换样杆插入样品。将换样杆完全推入，使样品台就位在仪器的共心级上，然后将换样杆旋转至 "unlock" 位置。将换样杆拉回并关闭闸阀。
- 移动样品台，使样品位于离子束柱下方。打开闸阀，获取 FIB 的实时离子诱导二次电子图像。使用低倍率和快速扫描以最小化离子损伤。重置常规观察束的聚焦，并升高样品台 Z 高度，直至样品清晰对焦。此时样品处于交叉点位置，即离子束与电子束在同一位置聚焦。
- 利用 SEM 的二次电子图像，通过轨迹球移动样品，定位样品中的感兴趣区域。感兴趣区域为先前 EDS 映射确定的富钙区域。必要时旋转样品台，使感兴趣特征与窗口框架对齐。
- 在 FIB 窗口界面中，以 1,000X 放大倍数和额外 2X 数字变焦拍摄样品的快速快照，并在感兴趣区域上方绘制一个约 8 µm × 2 µm 的沉积模板。可根据不同尺寸特征调整沉积框的放大倍数。设置溅射条件：使用 40 kV、0.09 nA 的电子束，驻留时间为 0.5 µs，持续 5 分钟，进行碳沉积。
- 完成碳沉积后，修改沉积条件，使用 40 kV、0.7 nA 的电子束进行钨沉积，持续 5 分钟，生成一个约 2–3 µm 的钨帽。
- 使用观察束获取 FIB 快照，并使用微采样溅射工具在钨帽周围绘制四个方框的图案。上、下方框设为约 15 µm × 8 µm；右侧方框为 10 µm × 5 µm，左侧方框为 6 µm × 5 µm，或足够大以包围感兴趣区域。
- 修改加工条件，使用 40 kV、19 nA 的电子束，驻留时间为 50 µs，每个方框扫描 3–4 帧，然后加工该图案。加工完成后，感兴趣区域连同保护性的 C 和 W 层将呈现为“岛”状结构，其顶部、底部和右侧相邻材料均已被去除。
- 将样品台倾斜 58°，使样品表面垂直于电子束柱，同时相对于离子束柱呈陡峭角度。使用 FIB 定位样品背面的 "island"，并在 1,000X 放大倍数和 2–4X 数字变焦下拍摄快照。
- 在样品 "island" 背面底部末端可见处，绘制一个约 15 µm × 2 µm 的溅射图案。使用 4 nA 的电子束加工 3 分钟，或直至电子束完全切穿样品 "island" 的底部。
- 将共心级样品台从当前位置倾斜 -58°（恢复至零位）。在 FIB 界面中点击 "Probe In" 插入钨微采样探针。在样品台控制面板上选择 "MS"，并使用轨迹球将探针移至样品上方。
- 以 1 kx 放大倍数获取 FIB 的实时图像，调整探针位置，使其尖端正对微样品钨帽的右侧上方。在观察 SEM 的实时二次电子图像的同时，使用样品台面板上的 Z 控制旋钮降低探针，直至其接触钨帽。接触完成后蜂鸣器将响起。
- 使用 FIB 以 40 kV、0.01 nA 的电子束，在 1,000X 放大倍数和 2X 数字变焦下拍摄快照。使用沉积工具在探针尖端与微样品钨帽接触处绘制一个 2 µm × 2 µm 的方框。
- 设置条件：使用 40 kV、0.09 nA 的电子束进行钨沉积，持续 2 分钟，驻留时间为 0.5 µs，然后加工该图案。
- 在微样品 "arm" 的左端（仍与主体样品相连处）绘制一个约 2 µm × 5 µm 的溅射图案。使用 40 kV、0.7 nA 的电子束加工 2 分钟，或直至蜂鸣声提示微样品已从主体样品上分离。
- 使用 Z 控制旋钮提升带有微样品的探针，直至其完全脱离主体样品，然后收回探针。将共心级样品台移至“Home”或“Exchange”位置。
- 将铜半网格放入侧向插入 holder 中，并将 holder 装入侧向插入样品台吹扫室。抽真空后插入侧向插入 holder，并将其设置为 FIB 位置。
- 在样品台控制面板上按下“Side”，使用轨迹球在 FIB 监视器上显示半网格。移动至半网格的洁净区域，并使用 Z 旋钮将表面调至对焦清晰。
- 按下“Probe In”插入探针，在样品台控制面板上按下“MS”，并使用轨迹球和 Z 旋钮将微样品定位在半网格上方。降低探针，直至微样品接触网格。
- 在 FIB 上以 1,000X 放大倍数（2X 变焦）拍摄图像。使用沉积工具在微样品下侧绘制一个约 10 µm × 3 µm 的图案。使用 40 kV、0.7 nA 的电子束进行钨沉积，驻留时间为 0.5 µs，持续 3 分钟。
- 使用溅射工具在探针尖端绘制一个 1 µm × 3 µm 的小图案。使用 40 kV、0.7 nA 的电子束，驻留时间为 3 ms，加工该图案，以切断探针与微样品的连接。探针自由后将其收回。
- 在 5,000X 放大倍数下获取 FIB 图像，并在微样品顶部和底部各绘制两个 7 µm × 4 µm 的溅射图案，图案之间保留约 1 µm 的间隙。将图案居中，避免切割微样品的左右两侧。使用 40 kV、4 nA 的电子束，驻留时间为 3 µs，加工 2 分钟，设置扫描方向朝向微样品中心。
- 使用 FIB 观察束在 5,000X 下再拍摄一张图像。将之前的溅射框调整为约 6.5 µm × 1 µm，使其更靠近，保留约 0.5 µm 的间隙，并使用 40 kV、0.7 nA 的电子束进行加工。
- 将侧向插入样品台倾斜 0.5°，再获取一张 FIB 图像。将溅射框宽度调整为 6 µm。将上方图案置于微样品上侧并进行加工，使用 40 kV、0.7 nA 的电子束。倾斜 -0.5°，对下方溅射图案和微样品下侧重复操作。
- 进一步将图案宽度减小约 0.5 µm。倾斜 0.5°，使用 40 kV、0.09 nA 的电子束溅射微样品上侧。在 -0.5° 倾斜下对下侧重复操作。
- 将样品台倾斜 2.2°，在 10,000X 下获取 FIB 图像。将溅射图案调整为 5 µm 宽，并将电子束条件改为 5 kV、0.03 nA。将上方图案置于微样品上侧边缘处并进行加工。倾斜 -2.2°，对下侧和底部图案重复操作。
- 重复 5 kV 研磨步骤，直至微样品达到电子透明状态（厚度约 100 nm）。完成后，关闭枪阀并取出侧向插入 holder。
8. 在透射电子显微镜上获取选区电子衍射图样
- 为准备仪器进行分析，将两个杜瓦瓶中充满液氮，并将加速电压设置为 300 kV。
- 使用聚焦离子束（FIB）完成样品制备后，从FIB-SEM中取出侧插式样品杆，调整销钉位置，使样品杆长度与300 kV透射电子显微镜（TEM）匹配。旋转样品杆尖端至正确的观察位置，并再次与标准TEM样品杆进行比对，以确保样品取向正确。
- 或者，将带有薄片样品的半网格从FIB-SEM样品杆上取下，并装入标准TEM样品杆中。
- 将样品杆装入TEM的样品交换室并抽真空。每当向交换室通入空气时，务必确保仪器的电子枪阀门处于关闭状态。当交换室完成抽真空后，会发出可听见的警报声。顺时针旋转样品杆，并让真空将样品杆拉至第一个停止位置。
- 等待仪器真空恢复后，打开电子枪阀门。重置聚焦和放大倍数，将放大倍数调至约10,000倍。
- 使用对中旋钮将电子束移至荧光屏中心。收缩和扩展电子束，确保所有束流移动均为同心。根据需要调节聚光镜消像散器。
- 逆时针旋转样品杆，让真空将样品杆完全拉入镜筒。使用样品台移动旋钮进行导航并定位样品。
- 提高样品放大倍数，并调节Z轴高度，直至样品处于焦点位置。必要时使用光学目镜进行观察。
- 插入相机并移除荧光屏。根据需要扩展电子束，以避免相机过饱和。调节聚焦和相机参数，然后开始采集以获取图像。
- 如需获取衍射图样，首先将感兴趣区域置于中心。移除物镜光阑，插入衍射光阑。
- 通过按下控制面板上的DIFF按钮切换至衍射透镜模式，并使用DIFF控制旋钮缩小电子束。
- 必要时插入束流挡板，以防止衍射图样中心烧损相机或荧光屏。启动相机采集，以获取图样图像。
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结果
以下是关于管虫变态过程中钙化现象的一些观察结果。图1显示，变态后，领部区域附近的pH值高于其他组织。图2i显示一只钙（Ca）分布均匀的管虫，表明尚未开始显著的钙化事件；图2ii显示一只经历了较长时间钙化的管虫，表明钙化过程已超过本研究关注的时间点；图2iii显示一只处于本研究关注钙化阶段的管虫，被选中用于进一步分析，以明确负责矿化的组织。图3显示，较高的pH值与钙黄显色染色和扫描电镜-能量色散X射线谱（SEM-EDX）图谱中更强的钙离子信号相关联。基于这些观察结果，针对所关注生活阶段的组织，采用空间分辨率更高、定位更精确的技术——扫描电镜-电子背散射衍射（SEM-EBSD）进行了进一步观察。在确定矿物相后，图4展示了利用聚焦离子束（focused ion beam）将目标材料切割并提取出来，用于透射电子显微镜（TEM）及选区电子衍射分析，以确认该矿物的晶体结构。
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讨论
活体光学成像是一种用于观察多细胞生物体内细胞事件的有效方法。本研究中，使用了细胞内pH和钙离子指示剂来检测矿化位点的离子流。在这些区域，需要主动的离子泵活动以提高pH值和Ca2+浓度，从而促进钙化过程2,3。当应用荧光分子研究生物体时，关键是要确保所使用的浓度具有可忽略的毒性，并能使生物体以符合生理状态的方式正常活动。较低的染色浓度毒性更小，但通常需要更长的染色时间10。在孵育期间应保持幼虫密度较低，以尽量减少染色过程中缺氧和代谢废物积累的影响。
在采用聚焦离子束/透射电子显微镜（FIB/TEM）方法研究特定局部区域之前，至关重要的是先利用分辨率较低的方法（如扫描电镜-能谱分析（SEM-EDS）和扫描电镜-电子背散射衍射（SEM-EBSD））对目标生命阶段和组织进行初步筛选。在背散射电子模式下观察样品，可实现对相对元素组成的可视化，其中较亮的对比度对应于较重的原子量
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨向克莱姆森广播制作公司致以诚挚感谢，J. Bright 负责音频录制，A. D. McQuiston 负责旁白，K. Murphy 负责音频润色，G. Spake 负责摄影，T. Messervy 负责平面设计，T. Messervy 和 E. Rodgers 负责视频剪辑。本研究的技术支持与科学指导得益于 S. Kawada、S. Kubo、J. Hudson、T. Darroudi、D. Mulwee、H. Qian、Y. W. Lam、M. B. Johnstone、C. Campanati、A. C. Lane 和 R. Dineshram 提供的宝贵建议。本研究由香港特别行政区研究资助局（HKSAR-RGC）提供的三项优配研究金资助（项目编号：705511P、705112P 和 17304914）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 六甲基二硅氮烷 | Electron Microscopy Sciences | 16700(EM) | |
| 四氧化锇 2% 水溶液 | Electron Microscopy Sciences | 19192 | |
| IBMX 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 | ThermoFisher Scientific | PHZ1124 | |
| 尼日尔菌素，游离酸 | ThermoFisher Scientific | N7143-5MG | |
| 35 mm 直径培养皿，孔径 27 mm，玻璃 0 号，未包被 | ThermoFisher Scientific | D110400 | |
| 5-(和-6)-羧基 SNARF-1 乙酰氧甲基酯，乙酸盐 | ThermoFisher Scientific | C-1271 | |
| BDH 氯化钾，ACS 级 | VWR | BDH0258-500G | |
| 多聚甲醛 试剂级，结晶状 | Sigma | P6148 | |
| 1 M 盐酸溶液，用于容量分析 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 083-01095 | |
| 0.05 M 氢氧化钠溶液，用于容量分析 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 199-02185 | |
| 钙黄绿素 | Sigma | C0875 | |
| FASW | Iwaki Co. Ltd. | Rei-sea Marine | |
| 混合纤维素酯膜；直径 47 mm，孔径 0.45 µm | ADVANTEC | A045A047A | |
| 乙醇 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 051-00476 | |
| 缓冲液用人工海水 | 依据 DOE (1994) 的 SOP06，cdiac.ornl.gov/ftp/cdiac74/sop06.pdf | ||
| 氯化钠 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 191-01665 | |
| 氯化钾 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 163-03545 | |
| 六水合氯化镁 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 135-00165 | |
| 氯化钙 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 039-00475 | |
| 硫酸钠 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 197-03345 | |
| 盐酸 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 089-08415 | |
| 2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇（Tris） | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 207-06275 | |
| 2-氨基吡啶 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 011-02775 | |
| Orion 5-star Plus pH 计 | Thermo Scientific | ||
| PrpHecT ROSS 微型复合 pH 电极 8220BNWP | Thermo Scientific | ||
| Axiovision，版本 4.6，Axio Observer Z1 | Zeiss | ||
| ImageJ | NIH, Bethesda, MD, USA | ||
| HRTEM H500 | Hitachi | ||
| SU6600 VPSEM | Hitachi | ||
| NB5000 聚焦离子束与电子束（FIB-SEM）系统 | Hitachi |
参考文献
- Aizenberg, J., et al. Skeleton of Euplectella sp.: structural hierarchy from the nanoscale to the macroscale. Science. 309 (5732), 275-278 (2005).
- de Nooijer, L. J., Toyofuku, T., Oguri, K., Nomaki, H., Kitazato, H. Intracellular pH distribution in foraminifera determined by the fluorescent probe HPTS. Limnol Oceanogr Methods. 6 (11), 610-618 (2008).
- de Nooijer, L. J., Langer, G., Nehrke, G., Bijma, J. Physiological controls on seawater uptake and calcification in the benthic foraminifer Ammonia tepida. Biogeosciences. 6 (11), 2669-2675 (2009).
- Smith, A. M., Riedi, M. A., Winter, D. J. Temperate reefs in a changing ocean: skeletal carbonate mineralogy of serpulids. Mar Biol. 160 (9), 1-14 (2013).
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