活细胞中线粒体钙与线粒体膜电位的荧光显微镜同步检测

摘要

线粒体可利用其内膜上的电化学势能（Δ_Ψm）来摄取钙离子（Ca²⁺），从而调控细胞质内的Ca²⁺信号。本文介绍一种利用荧光染料和共聚焦显微镜在活细胞中同时检测线粒体Ca²⁺摄取和ΔΨ_m的方法。

摘要

除了在生成ATP中的关键作用外，线粒体还作为局部钙（Ca²⁺) 缓冲液以严格调控细胞内 Ca²⁺ 浓度。为此，线粒体利用其内膜两侧的电化学势能（ΔΨ_m) 以螯合 Ca²⁺. Ca²⁺的内流²⁺ 进入线粒体后可刺激三类限速脱氢酶，从而增强三羧酸循环中电子通过氧化磷酸化（OXPHOS）复合体的传递。这种刺激作用可维持ΔΨ_m，这种电势会在正钙离子穿过线粒体内膜进入线粒体基质时暂时消散。

本文介绍一种利用共聚焦显微镜在活细胞中同时检测线粒体 Ca²⁺ 摄取和线粒体膜电位（ΔΨ_m）的方法。通过细胞透化处理，可使用荧光 Ca²⁺ 探针 Fluo-4, AM 检测线粒体内的 Ca²⁺ 水平，同时采用荧光染料四甲基罗丹明甲酯高氯酸盐（TMRM）检测 ΔΨ_m。该系统的优势在于两种荧光染料的光谱重叠极少，因而能够实现对线粒体 Ca²⁺ 和 ΔΨ_m 的精确同步测量。通过依次加入定量的 Ca²⁺ 溶液，可实时监测线粒体对 Ca²⁺ 的摄取过程，并确定 Ca²⁺ 诱导线粒体膜通透性转换及 ΔΨ_m 丧失时的临界浓度。

引言

线粒体通过作为细胞内局部 Ca²⁺ 缓冲剂，在调节细胞内 Ca²⁺ 浓度方面发挥重要作用¹。Ca²⁺ 通过 Ca²⁺ 单向转运体进入线粒体，该过程由线粒体内膜两侧存在的电化学梯度（ΔΨ_m）驱动²。一旦进入线粒体基质，Ca²⁺ 可通过激活三羧酸循环中的三种限速脱氢酶来促进氧化磷酸化³。这种激活作用可维持 ΔΨ_m，而该电势在正电性的钙离子跨过线粒体内膜进入基质时会暂时消散。当线粒体内 Ca²⁺ 浓度过高时，可能诱发线粒体通透性转换，导致 ΔΨ_m 消散、氧化磷酸化停止，并激活细胞死亡信号通路⁴。

线粒体在细胞钙离子的空间缓冲中发挥着重要作用，因此准确监测线粒体钙离子水平至关重要。目前已建立多种监测线粒体钙离子的方法，包括使用基于罗丹明的染料。其中一种染料Rhod-2, AM可有效靶向线粒体，用于检测线粒体内的Ca²⁺水平^5,6。然而需谨慎使用，因为部分染料可能在其他细胞器（如脂质体）中积聚，或滞留在细胞质中。尽管如此，可通过后续分析手段将这些信号与线粒体来源的信号区分开来⁷。

另一种监测线粒体钙的方法是利用荧光报告基因构建体⁸。这类基因编码探针的优势在于，可通过内源性N端肽将其特异性靶向至线粒体，例如人细胞色素c氧化酶（COX）亚基VIII的N端靶向信号。该系统已被用于构建靶向线粒体的水母发光蛋白（aequorin）探针，在研究线粒体钙信号方面已证明极为有效⁹。这类基因编码探针的主要缺点是需要通过瞬时转染将探针导入细胞（某些细胞类型无法实现瞬时转染，且结果可能存在较大变异性），或构建稳定表达系统（耗时较长）。

为克服上述问题，我们开发了一种新方案，可同时测量线粒体 Ca²⁺ 和 ΔΨ_m。该方案基于先前描述的一种向透化细胞中添加外源性钙的方法¹⁰。与其它方法相比，本方案具有三个主要优势：首先，我们使用 Fluo-4, AM 和 TMRM 来监测线粒体 Ca²⁺ 和 ΔΨ_m，这两种染料具有截然不同的光谱特性；其次，细胞经过透化处理，使得 Fluo-4 信号仅检测线粒体内的 Ca²⁺，而不会受到其他细胞器或细胞质中 Ca²⁺ 的干扰；第三，使用 Fluo-4 检测线粒体 Ca²⁺ 可实现快速且简便的细胞染色，避免了使用基因编码探针时可能存在的细胞转染或转化问题。

方案

1. 细胞的制备

1. 在 10 cm 细胞培养皿或 75 cm² 培养瓶中，使用培养基 [含 5% (v/v) 胎牛血清 (FBS) 和 1× 青霉素/链霉素 (p/s) 的 10 ml DMEM (Dulbecco 改良 Eagle 培养基)] 于 37 °C/5% CO₂ 条件下培养细胞。
2. 收集细胞时，通过抽吸去除培养基，然后用 5 ml 1× 磷酸盐缓冲液 (1× PBS) 洗涤。再次通过抽吸去除 1× PBS，加入 1.5 ml 0.25% (w/v) 胰蛋白酶/0.25% (w/v) 乙二胺四乙酸 (EDTA)，于 37 °C/5% CO₂ 条件下孵育 2 分钟。轻敲培养皿或培养瓶使细胞脱落，然后加入 5 ml 培养基重悬细胞。
3. 取 12 µl 重悬的细胞悬液加入血细胞计数板，进行细胞计数。
4. 将细胞接种于培养皿或带腔室的盖玻片上，用于共聚焦成像。
   注意：所用培养皿或盖玻片应具有适合倒置显微镜观察的塑料或玻璃底材。
5. 接种细胞时，应使成像当天细胞融合度约为 80%。例如，可在成像前一日，将约 2 × 10⁴ 个 143B 骨肉瘤细胞接种至 8 孔腔室载玻片的一个孔中。
6. 将细胞于 37 °C/5% CO₂ 条件下孵育过夜，以使细胞贴壁并恢复状态。

2. TMRM 和 Fluo-4 成像用缓冲液

1. 配制含156 mM NaCl、3 mM KCl、2 mM MgSO₄的记录液（RS）₄，1.25 mM KH₂PO₄，10 mM D-葡萄糖，2 mM CaCl₂ 和 10 mM HEPES（pH 7.35）。将 RS 分装后于  -20 ºC
2. 配制含有 6 mM NaCl、130 mM KCl、7.8 mM MgCl₂ 的细胞内液（IM）₂，1 mM KH₂PO₄，0.4 mM CaCl₂，2 mM EGTA，10 mM HEDTA，2 mM 苹果酸，2 mM 谷氨酸，2 mM ADP 和 20 mM HEPES（pH 7.1）。苹果酸、谷氨酸和 ADP 可分别配制成 200 mM 储存液，分装后于 -20 °C 保存。使用前可将这些储存液直接加入 IM 中。
3. Ca²⁺ 无钙 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）可从商业供应商处购买预配制成品。加入乙二醇双（β-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA），使其终浓度为 500 µM。
4. 配制10 mM四甲基罗丹明甲酯高氯酸盐（TMRM）的甲醇（100%）储备液。从中配制2 µM的工作液，使用蒸馏水稀释H₂O.
5. 用100%乙醇配制10 mM维拉帕米储备液。
6. 配制 1 mg/ml (w/v) 的 Fluo-4 乙酰甲氧基酯（Fluo-4, AM）在二甲基亚砜（DMSO）中的储备液。
   注意：Fluo-4, AM 是一种钙离子指示剂，与 Ca²⁺ 结合后荧光增强²⁺Fluo-4 是 fluo-3 的一种类似物，其两个氯取代基被氟原子取代。这使得 Fluo-4 在 488 nm 处的荧光激发效率提高，并产生更强的荧光信号。AM 酯基团使 Fluo-4 分子呈电中性，因而能够穿透细胞膜。进入细胞后，AM 酯基被非特异性酯酶水解，生成带电荷的 Fluo-4 形式，从而被滞留在细胞内。
7. 在100%乙醇中配制1 mM羰基氰化对-三氟甲氧基苯腙（FCCP）储备液。
8. 配制 25 mg/ml (w/v) 的皂苷素（digitonin）蒸馏水储备液₂O.
9. 在DMSO中配制100 µM毒胡萝卜素储备液。
10. 配制 40 mM 氯化钙（CaCl₂）储备液₂) 于蒸馏 H₂O.

3. 使用TMRM和Fluo-4, AM对细胞进行染色

1. 在RS溶液中配制RS染色液，其中含20 nM TMRM、5 µg/ml (w/v) Fluo-4, AM 和0.005%的表面活性剂（如Pluronic F-127）。
   注意：该表面活性剂为非离子型聚醇，有助于Fluo-4, AM的溶解。若所分析的细胞类型表达质膜多药耐药转运蛋白，可额外加入10 µM维拉帕米以抑制TMRM的外排。
2. 用移液器吸除细胞培养基，并用100 µl 1× PBS洗涤细胞。
3. 用移液器吸除1× PBS，将细胞置于250 µl RS染色液中，在室温下孵育45分钟。
   注意：Fluo-4, AM进入细胞后，其AM酯键会被细胞内的酯酶水解。在室温下孵育可抑制酯酶活性，从而使Fluo-4, AM得以进入线粒体。
4. 用移液器吸除RS染色液，并用100 µl无Ca²⁺ HBSS洗涤细胞，以去除多余的Fluo-4, AM和TMRM。
5. 在IM溶液中配制IM成像液，其中含25 µg/ml (w/v) 皂苷（digitonin）、200 nM TMRM 和1 µM毒胡萝卜素（thapsigargin）。
   注意：皂苷的浓度可能需要调整，以确保不导致线粒体内膜通透化。可通过在不同皂苷浓度下评估TMRM信号强度，凭经验确定最佳浓度。
6. 用移液器吸除无Ca²⁺ HBSS，并向细胞中加入300 µl IM成像液。将细胞在室温下平衡10分钟。此时细胞已准备好进行添加CaCl₂后的成像实验。

4. 细胞成像

1. 将含有细胞的培养皿或带孔盖玻片置于倒置激光扫描共聚焦显微镜上，加入IM成像溶液。
2. 调整显微镜激光设置，以匹配TMRM和Fluo-4的激发与发射光谱。例如，分别使用543 nm的He-Ne激光和473 nm的氩离子激光激发TMRM和Fluo-4。使用约5%的低激光功率，以尽量减少对细胞的光损伤。
3. 设置显微镜每25秒扫描一次图像。连续扫描细胞10分钟，以建立TMRM和Fluo-4信号的基础值。
   注意：在静息钙浓度下，Fluo-4信号可能较弱或无法检测。
4. 在300 μl的IM成像溶液中，直接加入3 μl的40 mM CaCl₂储备液（1:100稀释），并用移液器轻轻混匀。如需，可在添加和混匀CaCl₂时暂停图像扫描。
   注意：IM成像溶液中游离Ca²⁺离子的最终浓度[Ca²⁺]可通过Maxchelator WEBMAXC EXTENDED（http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html）或Chelator¹¹等软件计算。第6节中详细描述了如何计算最终游离Ca²⁺离子浓度[Ca²⁺]。
5. 继续图像扫描约4分钟，之后每隔4分钟重复一次CaCl₂添加，直至达到所需的TMRM或Fluo-4信号，通常需添加8至10次。
6. 使用移液器，直接向细胞中加入1 mM FCCP的1:100稀释液（终浓度为10 μM），以消除ΔΨ_m。再继续成像5分钟。实验至此结束。

5. 图像分析

1. 成像完成后，使用图像分析软件（例如安装了 Bio-Formats 插件的 ImageJ 软件）测定 Fluo-4 和 TMRM 信号的强度（从 http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/ 下载 'bioformats_package.jar' 文件，并将其保存至 'C:\Program Files\ImageJ\plugins' 文件夹中）。
2. 在 ImageJ 中打开成像文件（例如 .oif 文件）。点击选择工具，选取包含线粒体的感兴趣区域（ROI）。使用初始的 TMRM 信号来确定 ROI。
3. 打开“分析>工具>ROI 管理器”，点击“添加”以将选定的 ROI 加入强度测量列表。可在单张图像上选择多个 ROI 进行测量。重复前述步骤，直至所有 ROI 均已添加至 ROI 管理器。
4. 点击“更多>多测量”，确保勾选“测量所有切片”且未勾选“每切片一行”，然后点击“确定”，以获得每个时间点各 ROI 的 TMRM 和 Fluo-4 信号平均荧光强度数据表。
5. 利用所有 ROI 的数据，计算 TMRM 和 Fluo-4 信号的平均强度及其标准差。

6. 计算最终游离 Ca²⁺ 离子浓度 [Ca²⁺]

1. IM成像溶液中游离Ca²⁺离子浓度[Ca²⁺]可通过软件（如Maxchelator WEBMAXC EXTENDED（http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html）或Chelator¹¹）进行计算。例如，在WEBMAXC EXTENDED中设置以下变量：温度 = 24 °C，pH = 7.1，离子强度 = 0.162，EGTA = 0.002 M，HEDTA = 0.01 M，Ca²⁺ = 0.0004 M，Mg²⁺ = 0.0078 M。由此计算得到最终游离Ca²⁺离子浓度[Ca²⁺]为62 nM。需注意，这些程序无法考虑所有变量，例如试剂纯度、测量准确性和pH测定的误差。测定游离Ca²⁺浓度最准确的方法是使用经校准的Ca²⁺选择性电极。

结果

我们已采用该方案研究MT-ND5突变对143B细胞线粒体缓冲钙离子升高能力的影响¹²。本示例中，对照组143B细胞在经皂苷透化前，先加载TMRM和Fluo-4, AM。成像5分钟后，依次加入8次40 mM外源性CaCl₂的1:100稀释液，并计算最终游离Ca²⁺离子浓度[Ca²⁺]。

每次CaCl₂处理后₂ 此外，随着Ca²⁺内流，TMRM信号减弱²⁺ 离子进入线粒体会使线粒体膜电位 ΔΨ 消散_m (图1). ΔΨ_m 随后随着呼吸作用增强以维持ΔΨ而恢复_m。这在每次CaCl之后发生四次₂ 加样。第五次加样后，线粒体 Ca²⁺ 离子浓度达到...

讨论

钙在许多细胞过程中发挥着关键作用，包括肌肉收缩、神经元信号传导以及细胞增殖¹³。细胞内钙浓度的升高通常与能量需求相关，钙可直接刺激线粒体氧化磷酸化，从而提高ATP的生成³。因此，我们必须具备有效监测线粒体钙积累的能力，并能够比较遗传因素和药理学试剂对这一功能的影响。

方案中的关键步骤

本方案描述了使用 Fluo-4, AM 和 TMRM 同时监测线粒体钙积累和线粒体膜电位（ΔΨ_m）的方法。在染色过程中，关键步骤是在室温下孵育细胞，以优化 Fluo-4, AM 对线粒体钙的检测效果。室温孵育可降低细胞质酯酶的活性，使不带电荷的 Fluo-4, AM 能够穿过线粒体膜进入线粒体基质。相反，在 37 °C 孵育会增强细胞质中酯酶的活性，导致 AM 酯基被切除，生成带电荷的 Fluo-4 荧光染料，从而无法有效穿过线粒体膜。

细胞染色完成后，将细胞浸入线粒体成像溶液（I...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	ThermoFisher	10566016
胎牛血清（FBS）	ThermoFisher	16000044
1×磷酸盐缓冲液（PBS）	ThermoFisher	10010023
100×青霉素/链霉素（p/s）	ThermoFisher	15140122
0.25%胰蛋白酶/0.25% EDTA	ThermoFisher	25200056
8孔腔室盖玻片	ibidi	80826
NaCl	Sigma-Aldrich	793566
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
MgSO4	Sigma-Aldrich	746452
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270
CaCl2	Sigma-Aldrich	746495
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
HEDTA	Sigma-Aldrich	H8126
苹果酸	Sigma-Aldrich	M1000
谷氨酸	Sigma-Aldrich	G1626
ADP	Sigma-Aldrich	A5285
无Ca2+汉克斯平衡盐溶液（HBSS）’	ThermoFisher	14175-095
四甲基罗丹明甲酯高氯酸盐（TMRM）	ThermoFisher	T668
维拉帕米	Sigma-Aldrich	V4629
Fluo-4乙酰甲酯（Fluo-4, AM）	ThermoFisher	F14201
二甲基亚砜（DMSO）	ThermoFisher	D12345
羰基氰化物对-三氟甲氧基苯腙（FCCP）	Sigma-Aldrich	C2920
皂苷	Sigma-Aldrich	D141
毒胡萝卜素	Sigma-Aldrich	T9033
Pluronic F-127	ThermoFisher	P3000MP
血细胞计数板	VWR	631-0925
10 cm细胞培养皿	Corning	COR430167
75 cm2细胞培养瓶	Corning	COR430641