活细胞中线粒体钙与线粒体膜电位的荧光显微镜同步检测

摘要

线粒体可利用其内膜上的电化学势能（Δ_Ψm）来摄取钙离子（Ca²⁺），从而调控细胞质内的Ca²⁺信号。本文介绍一种利用荧光染料和共聚焦显微镜在活细胞中同时检测线粒体Ca²⁺摄取和ΔΨ_m的方法。

摘要

除了在生成ATP中的关键作用外，线粒体还作为局部钙（Ca²⁺) 缓冲液以严格调控细胞内 Ca²⁺ 浓度。为此，线粒体利用其内膜两侧的电化学势能（ΔΨ_m) 以螯合 Ca²⁺. Ca²⁺的内流²⁺ 进入线粒体后可刺激三类限速脱氢酶，从而增强三羧酸循环中电子通过氧化磷酸化（OXPHOS）复合体的传递。这种刺激作用可维持ΔΨ_m，这种电势会在正钙离子穿过线粒体内膜进入线粒体基质时暂时消散。

本文介绍一种利用共聚焦显微镜在活细胞中同时检测线粒体 Ca²⁺ 摄取和线粒体膜电位（ΔΨ_m）的方法。通过细胞透化处理，可使用荧光 Ca²⁺ 探针 Fluo-4, AM 检测线粒体内的 Ca²⁺ 水平，同时采用荧光染料四甲基罗丹明甲酯高氯酸盐（TMRM）检测 ΔΨ_m。该系统的优势在于两种荧光染料的光谱重叠极少，因而能够实现对线粒体 Ca²⁺ 和 ΔΨ_m 的精确同步测量。通过依次加入定量的 Ca²⁺ 溶液，可实时监测线粒体对 Ca²⁺ 的摄取过程，并确定 Ca²⁺ 诱导线粒体膜通透性转换及 ΔΨ_m 丧失时的临界浓度。

引言

线粒体通过作为细胞内局部 Ca²⁺ 缓冲剂，在调节细胞内 Ca²⁺ 浓度方面发挥重要作用¹。Ca²⁺ 通过 Ca²⁺ 单向转运体进入线粒体，该过程由线粒体内膜两侧存在的电化学梯度（ΔΨ_m）驱动²。一旦进入线粒体基质，Ca²⁺ 可通过激活三羧酸循环中的三种限速脱氢酶来促进氧化磷酸化³。这种激活作用可维持 ΔΨ_m，而该电势在正电性的钙离子跨过线粒体内膜进入基质时会暂时消散。当线粒体内 Ca²⁺ 浓度过高时，可能诱发线粒体通透性转换，导致 ΔΨ_m 消散、氧化磷酸化停止，并激活细胞死亡信号通路⁴。

线粒体在细胞钙离子的空间缓冲中发挥着重要作用，因此准确监测线粒体钙离子水平至关重要。目前已建立多种监测线粒体钙离子的方法，包括使用基于罗丹明的染料。其中一种染料Rhod-2, AM可有效靶向线粒体，用于检测线粒体内的Ca²⁺水平^5,6。然而需谨慎使用，因为部分染料可能在....

方案

1. 细胞的制备

1. 在 10 cm 细胞培养皿或 75 cm² 培养瓶中，使用培养基 [含 5% (v/v) 胎牛血清 (FBS) 和 1× 青霉素/链霉素 (p/s) 的 10 ml DMEM (Dulbecco 改良 Eagle 培养基)] 于 37 °C/5% CO₂ 条件下培养细胞。
2. 收集细胞时，通过抽吸去除培养基，然后用 5 ml 1× 磷酸盐缓冲液 (1× PBS) 洗涤。再次通过抽吸去除 1× PBS，加入 1.5 ml 0.25% (w/v) 胰蛋白酶/0.25% (w/v) 乙二胺四乙酸 (EDTA)，于 37 °C/5% CO₂ 条件下孵育 2 分钟。轻敲培养皿或培养瓶使细胞脱落，然后加入 5 ml 培养基重悬细胞。
3. 取 12 µl 重悬的细胞悬液加入血细胞计数板，进行细胞计数。
4. 将细胞接种于培养皿或带腔室的盖玻片上，用于共聚焦成像。
   注意：所用培养皿或盖玻片应具有适合倒置显微镜观察的塑料或玻璃底材。
5. 接种细胞时，应使成像当天细胞融合度约为 80%。例如，可在成像前一日，将约 2 × 10⁴ 个 143B 骨肉瘤细胞接种至 8 孔腔室载玻片的一个孔中。
6. 将细胞于 37 °C/5% CO₂ 条件下孵育过夜，以使细胞贴壁并恢复状态。

结果

我们已采用该方案研究MT-ND5突变对143B细胞线粒体缓冲钙离子升高能力的影响¹²。本示例中，对照组143B细胞在经皂苷透化前，先加载TMRM和Fluo-4, AM。成像5分钟后，依次加入8次40 mM外源性CaCl₂的1:100稀释液，并计算最终游离Ca²⁺离子浓度[Ca²⁺]。

每次CaCl₂处理后₂ 此外，随着Ca²⁺内流，TMRM信号减弱²⁺ 离子进入线粒体会使线粒体膜电位 ΔΨ 消散_m (图1). ΔΨ_m 随后随着呼吸作用增强以维持ΔΨ而恢复_m。这在每次CaCl之后发生四次₂ 加样。第五次加样后，线粒体 Ca²⁺ 离子浓度达到.......

讨论

钙在许多细胞过程中发挥着关键作用，包括肌肉收缩、神经元信号传导以及细胞增殖¹³。细胞内钙浓度的升高通常与能量需求相关，钙可直接刺激线粒体氧化磷酸化，从而提高ATP的生成³。因此，我们必须具备有效监测线粒体钙积累的能力，并能够比较遗传因素和药理学试剂对这一功能的影响。

方案中的关键步骤

本方案描述了使用 Fluo-4, AM 和 TMRM 同时监测线粒体钙积累和线粒体膜电位（ΔΨ_m）的方法。在染色过程中，关键步骤是在室温下孵育细胞，以优化 Fluo-4, AM 对线粒体钙的检测效果。室温孵育可降低细胞质酯酶的活性，使不带电荷的 Fluo-4, AM 能够穿过线粒体膜进入线粒体基质。相反，在 37 °C 孵育会增强细胞质中酯酶的活性，导致 AM 酯基被切除，生成带电荷的 Fluo-4 荧光染料，从而无法有效穿过线粒体膜。

细胞染色完成后，将细胞浸入线粒体成像溶液（I.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	ThermoFisher	10566016
胎牛血清（FBS）	ThermoFisher	16000044
1×磷酸盐缓冲液（PBS）	ThermoFisher	10010023
100×青霉素/链霉素（p/s）	ThermoFisher	15140122
0.25%胰蛋白酶/0.25% EDTA	ThermoFisher	25200056
8孔腔室盖玻片	ibidi	80826
NaCl	Sigma-Aldrich	793566
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
MgSO4	Sigma-Aldrich	746452
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270
CaCl2	Sigma-Aldrich	746495
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
HEDTA	Sigma-Aldrich	H8126
苹果酸	Sigma-Aldrich	M1000
谷氨酸	Sigma-Aldrich	G1626
ADP	Sigma-Aldrich	A5285
无Ca2+汉克斯平衡盐溶液（HBSS）’	ThermoFisher	14175-095
四甲基罗丹明甲酯高氯酸盐（TMRM）	ThermoFisher	T668
维拉帕米	Sigma-Aldrich	V4629
Fluo-4乙酰甲酯（Fluo-4, AM）	ThermoFisher	F14201
二甲基亚砜（DMSO）	ThermoFisher	D12345
羰基氰化物对-三氟甲氧基苯腙（FCCP）	Sigma-Aldrich	C2920
皂苷	Sigma-Aldrich	D141
毒胡萝卜素	Sigma-Aldrich	T9033
Pluronic F-127	ThermoFisher	P3000MP
血细胞计数板	VWR	631-0925
10 cm细胞培养皿	Corning	COR430167
75 cm2细胞培养瓶	Corning	COR430641