成年小鼠视网膜水平切片用于电生理研究的制备

摘要

我们建立了一种成年哺乳动物视网膜的水平切片制备方法，其切片平面与视网膜表面平行。非放射状取向的视网膜神经元树突野未被截断，从而可利用膜片钳和成像技术研究信号处理过程。

摘要

垂直切片制备是研究成年哺乳动物视网膜神经环路和信号传递的成熟方法。此类制备的切面垂直于视网膜表面，非常适合研究径向排列的神经元，如光感受器和双极细胞。然而，水平细胞、广视野无长突细胞以及神经节细胞的大范围树突分支在切片过程中大多被截断，导致这些细胞的突触活动显著减少。尽管神经节细胞和移位的无长突细胞可在视网膜整体铺片制备中进行研究，但位于内核层的水平细胞和无长突细胞在完整视网膜组织中难以被电极接近。

为了实现最大程度的可接近性和突触完整性，我们建立了一种小鼠视网膜的水平切片制备方法，并研究了光感受器与水平细胞之间突触上的信号传递。水平切片具有以下优势： (1) 可方便且明确地通过视觉识别水平细胞的胞体，便于电极定位；(2) 能够保留水平细胞广泛延伸的树突区域，这是水平细胞树突接收完整且功能性视锥细胞突触输入的前提条件。

在黑暗条件下，来自水平切片的水平细胞表现出紧张性突触活动，并且对短暂闪光刺激产生反应，表现为内向电流减小以及突触活动减弱。免疫细胞化学证据表明，水平细胞树突野内的几乎所有视锥细胞均与其周边树突形成突触连接。因此，水平切片制备方法非常适用于研究具有水平延伸特性的视网膜神经元的生理特性，以及特定突触间感觉信号的传递与整合。

引言

视觉信息被编码为光感受器激活的动态时空模式，而光感受器与二级神经元之间的带状突触决定了视觉信息向下游的传递。哺乳动物视网膜的垂直切片制备是研究垂直通路中信号处理的极为有价值的工具。 即 光感受器细胞与双极细胞之间，以及双极细胞与某些类型的无长突细胞之间^1,2,3,4.

然而，垂直切片总会严重截断许多视网膜神经元的树突区域，导致大量突触连接丢失。尤其是在视网膜外层，由于水平细胞具有广泛侧向延伸的树突区域和轴突终末系统，因而受到显著影响⁵。在垂直切片制备中，数百个视锥光感受器终末向一个水平细胞树突提供的突触输入因此减少为少数稀疏的接触点。这或许足以用于研究单个突触的特性，但完全无法反映光感受器带状突触同步激活背后所依赖的信号处理能力。

因此，我们开发了一种水平切片制备方法，该方法几乎完整保留了视锥光感受器向水平细胞树突的突触输入，并维持其功能。切片平面与视网膜表面平行，理想情况下在水平细胞与无长突细胞之间的内核层进行切割。由此制备出的外视网膜水平切片，在突触前侧包含具有内节和外节以及突触终末的光感受器，在突触后侧则包含水平细胞和双极细胞。该制备方法非常适合研究同一树突支配区域内所有视锥光感受器对水平细胞树突的协同突触输入。因此，该方法可能有助于更深入理解光感受器带状突触的功能机制，而带状突触对于将光感受器激活矩阵中的视觉信息转化为突触后反应至关重要。

方案

所有操作均按照德意志联邦共和国发布的动物实验指南进行。

注意：由于视网膜组织在该实验的较长时间内将处于缺氧状态，所有步骤均应尽快完成。小鼠在解剖前至少需进行3小时的暗适应。为避免视网膜发生光适应，制备和切片过程应在暗红光条件下进行。

1. 培养基及其他化学试剂的准备

1. 配制 Ames 培养基⁶。解剖后，视网膜组织必须始终浸没在 Ames 培养基中。
   1. 将 2.2 g Ames 培养基和 298 mg HEPES 溶解于 250 ml 蒸馏水中，HEPES 的终浓度为 5 mM。轻轻搅拌，直至所有成分完全溶解。
   2. 在室温下用碳氧混合气体（95% 氧气，5% 二氧化碳）向 Ames 培养基中通气至少 5 分钟。使用玻璃巴斯德吸管将气体导入溶液，并通过合适的管路将巴斯德吸管连接至气体调节器的出口。
   3. 向溶液中加入 475 mg 碳酸氢钠。在通气后加入碳酸氢盐可防止碳酸钙沉淀。
2. 配制低凝胶温度琼脂糖。在振动切片过程中，需使用琼脂糖包埋视网膜组织。
   1. 将 180 mg 琼脂糖溶解于 9 ml Ames 培养基和 1 ml 蒸馏水中。使用微波炉缓慢加热琼脂糖溶液，直至所有固体完全溶解。每次加热 5–10 秒，避免溶液溢出。溶液应呈澄清透明状。
   2. 将溶解后的琼脂糖置于 37 °C 水浴中，在整个操作过程中保温保存。

2. 设置振动切片机

注意：所有切片均使用材料表中列出的振动切片机进行。所给出的设置仅适用于此类振动切片机。有关神经组织振动切片的更多细节，请参见参考文献⁷。

1. 将振动切片机注射刀片放入刀片夹持器中。
2. 使用"vibrocheck"装置测量刀片的垂直偏转。利用刀片夹持器上的调节螺钉倾斜刀片，直至其与切削平面平行。精确调整刀片位置对于防止切片表面出现百叶窗效应、并获得表面含有活细胞的平整切片至关重要。
3. 将振动切片机设置为以下参数：振幅 1.00；速度 0.20；切片厚度 180 - 200 µm。

3. 小鼠视网膜的解剖

1. 在密闭容器中汽化约1 ml异氟烷，对成年C57BL/6小鼠进行麻醉。麻醉完成后，通过颈椎脱位法处死动物。小鼠年龄不应超过3个月，否则切片质量将下降。
2. 将弯头镊子置于眼球下方，取出眼球。轻轻提起眼球可暴露视神经。使用弹簧剪刀切断视神经，并将眼球转移至含有2 ml Ames培养基的35 mm培养皿中。
3. 所有后续步骤均在体视显微镜载物台上进行。调节放大倍数，以确保对以下操作步骤（3.4–3.9）实现最佳视觉控制。
4. 用尖头镊子或20 G 针头在角膜与巩膜交界处刺破角膜。操作过程中，用另一把镊子固定眼球。注意避免穿刺工具损伤视网膜。
5. 将弹簧剪刀插入步骤3.3中形成的小孔，沿角膜边缘剪出一圈切口。剪切时仍需用镊子固定眼球。切口应尽量贴近表面，避免切入视网膜。
6. 用镊子小心移除角膜、晶状体和玻璃体。玻璃体仅在眼球后部形成一层薄而透明的结构。然而，为确保振动切片机能顺利切片，必须完全去除玻璃体。
7. 在培养皿中放置眼杯，使其孔洞朝下，便于观察视网膜。切口边缘应仅由巩膜组织构成。若步骤3.4中的环形切口过于靠近眼杯赤道部，则切口附近可能残留视网膜组织。此时在步骤3.8中应特别注意避免损伤视网膜。
8. 用镊子夹住巩膜，小心撕开组织。此步骤中必须避免撕裂视网膜。如有必要，可用镊子固定组织的巩膜部分，同时用另一把镊子轻轻剥离锯齿缘处的视网膜。操作时保持镊子闭合；切勿直接夹持视网膜，因其组织极为柔软，极易受损。
   注意：此时视网膜与其余眼杯组织仅在视神经乳头处相连。
9. 用弹簧剪刀切断视神经乳头处的连接点。此时视网膜应已完全游离，作为单一组织片漂浮于Ames培养基中。
10. 用弯头手术刀片将视网膜切成4–6个大小约为23 mm的小矩形片，操作时用镊子夹住视网膜边缘以调整其位置。避免在矩形区域内夹压视网膜组织。取材应来自视网膜中央区域，而非远周缘区域。
11. 用大口径塑料巴斯德移液管将视网膜组织片转移至一个底部已更换为网格（网格尺寸小于1 mm）的35 mm塑料培养皿中。将培养皿固定于烧杯或锥形瓶的上三分之一位置，并将视网膜组织片浸入经碳氧混合气（carbogen）鼓泡的Ames培养基中。

4. 视网膜组织块在琼脂糖中的包埋

1. 用大口径塑料移液管将2-3块视网膜组织连同部分Ames培养基小心转移至一个35 mm的塑料培养皿中。此步骤中视网膜组织的方向无需特别注意。
2. 用玻璃移液管尽可能吸除残留的Ames培养基。一旦液体被移除，立即进行步骤4.3。切勿让视网膜组织干燥。
3. 立即用2 ml溶解的琼脂糖（37 °C）覆盖视网膜组织。根据步骤3.10中提到的尺寸，组织块在琼脂糖中不会卷曲。
4. 在液态琼脂糖中，轻轻将视网膜组织推至培养皿底部，确保节细胞层朝下。使用体视显微镜判断其准确位置。定位时可用小刮铲操作视网膜组织。由于琼脂糖会迅速凝固，应尽快且精确地完成视网膜的定位。
   1. 将视网膜组织平行排列于玻璃培养皿底部，以避免切片呈切线或斜向。各组织块之间不应相互接触，但也不宜相隔过远。尽量使视网膜组织大致处于同一水平面上。
5. 将含有视网膜组织的玻璃培养皿放入冰箱（4 - 6 °C）中至少2分钟，以使琼脂糖快速凝固，便于后续操作。一旦琼脂糖完成聚合，立即进行下一步。

5. 视网膜组织片的封片

1. 小心地将含有视网膜组织块的琼脂糖凝胶从培养皿中取出。使用刮铲或类似工具从玻璃表面轻轻抬起琼脂糖块。由于存在黏附力，此操作可能较为困难，但应避免琼脂糖块破裂。此步骤及后续所有操作均需在室温下进行。
2. 将琼脂糖块置于玻璃盖玻片上，并用手术刀片修整其大小，使视网膜组织块每侧保留约 1 - 2 mm 的琼脂糖。最终琼脂糖块的尺寸应约为 1,066 mm（其中 10 mm 指块体高度，6 mm 指其边长）。
3. 使用速干胶将琼脂糖块粘附于振动切片机的样品托上。视网膜组织应位于 10 mm 高的琼脂糖块顶部，并与样品托表面平行；琼脂糖块底部则固定于样品托上。
4. 立即向振动切片机的缓冲槽中倒入预先通入气体饱和的 Ames 培养基，以完全覆盖琼脂糖块。

6. 水平式振动切片机切片的制备

1. 开始切片。首先手动设置切片厚度，直至切片中出现视网膜组织碎片，然后切换至步骤2.3中的设置。由于小鼠视网膜厚度仅约200 µm，每块琼脂糖中最多只能获得2–3片切片。
2. 用玻璃棒将切片从缓冲液托盘中取出，并转移至35 mm培养皿中的2 ml Ames'培养基中。
3. 立即将切片置于37 °C孵育箱中（5% CO₂/55% O₂）储存。切片周围的琼脂糖在孵育箱中仍保持固态，可用于操作切片而不损伤视网膜。与在室温下使用充氧Ames'培养基相比，在设定气体环境下37 °C孵育可获得更佳的切片质量。切片可立即使用，或在孵育箱中保存最多4小时，仍可获得良好的生理状态。
4. 将下一批视网膜组织包埋于琼脂糖中，并重复步骤4–6。

结果

在小鼠视网膜的水平切片中，水平细胞的胞体可根据其独特的形态被轻易识别，即从多边形的胞体发出数条初级树突（图1A）。位于切片表面附近的水平细胞胞体通常可被膜片钳电极顺利接触。在记录过程中，细胞内被填充荧光染料，显示出其复杂的树突分支结构，该结构与完整小鼠视网膜中带轴突的水平细胞形态高度相似⁸（图1B）。利用荧光素标记的花生凝集素对视锥细胞终足进行标记，显示视锥细胞终足与水平细胞树突之间存在紧密的空间关系（图1C）。除极少数例外，水平细胞树突野内的所有视锥细胞终足均与树突突起形成接触。

为了证实视锥细胞与水平细胞之间的突触连接具有功能性，对水平细胞胞体进行了膜片钳记录。在暗适应条件下，电流反应表现为一个大幅的内向电流，并伴随中等到高频率的突触活动（图2A）。基线的偏移和兴奋性...

讨论

与垂直切片相比，水平细胞和无长突细胞等径向排列神经元的树突形态得到了良好保存。与整个视网膜制备物相比，这些细胞类型更易于用微电极接触，因而可通过电生理学和成像技术进行研究。本文我们主要关注外层视网膜；然而，已有文献报道采用类似方法研究内层视网膜的无长突细胞¹⁰。

水平切片制备的特性对功能研究具有若干意义。视锥感光细胞与突触后水平细胞之间的突触连接数量几乎与完整视网膜中无法区分。这些突触连接具有功能活性，能够在暗处表现出神经递质的紧张性释放。该突触既可由光/暗转换等内源性刺激激活，也可由外部双极细胞刺激激活。

该技术的一个关键步骤是视网膜本身的分离，应尽可能快速完成，同时避免损伤组织。此外，玻璃体残留物的存在会对切片质量产生负面影响。另一个关键步骤是视网膜组织块的准确定位。尽管已尽最大努力使视网膜组织块与玻璃皿底部保持平行，但切面仍可能略微呈切线方向穿过视网膜。根据角度不同，径向排列神经元的树突野将不同程度地被截断。

本文介绍...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
艾姆斯培养基	Sigma	A1420
碳酸氢钠	Sigma	S5761
HEPES	Sigma	H3375
碳酰气	Air Liquide
琼脂糖	Sigma	A9045
35 mm 培养皿（塑料）	Nunc Thermofisher	150318
玻璃培养皿	Chemoline	50-1470-40
异氟烷	大学医院药房
振动切片机注射刀片	Biosystems	39053250
振动切片机	Leica Microsystems	VT1200
Vibrocheck	Leica Microsystems
微波炉
水浴锅
镊子
20 G 针头
弹簧剪刀
弯头手术刀片
体视显微镜
塑料巴斯德吸管
玻璃巴斯德吸管