本文阐述了利用可激活光学成像探针进行荧光成像的应用，以可视化目标分子 体内 两种不同炎症实验模型中关键基质金属蛋白酶的活性。
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本文内容
摘要
摘要
本文介绍了一种利用可激活荧光探针非侵入性成像基质金属蛋白酶（MMP）活性的方法。 通过 体内 荧光光学成像（OI）在两种不同的炎症小鼠模型中的应用：类风湿性关节炎（RA）模型和接触性超敏反应（CHR）模型。与波长低于650 nm的光相比，近红外（NIR）窗口（650 - 950 nm）的光能够实现更深的组织穿透和更小的信号吸收。使用荧光OI的主要优势在于其成本低、速度快，并且易于在不同动物模型中实施。
可激活荧光探针在其非活化状态下无光学信号，但在被蛋白酶激活后会表现出强烈的荧光。活化的基质金属蛋白酶（MMPs）可导致组织破坏，在类风湿关节炎（RA）和慢性接触性超敏反应（CHR）等迟发型超敏反应（DTHRs）的疾病进展中发挥重要作用。此外，MMPs 是引起软骨和骨降解的关键蛋白酶，可由巨噬细胞、成纤维细胞和软骨细胞在促炎性细胞因子刺激下诱导产生。本文采用一种可被关键 MMPs（如 MMP-2、-3、-9 和 -13）激活的探针，描述了一项成像方案：在疾病诱导后第6天，对 RA 模型小鼠和对照小鼠，以及在右耳分别接受一次激发（急性）和五次激发（慢性）的 CHR 小鼠与健康耳朵小鼠，进行近红外荧光光学成像（OI）以检测 MMP 活性。
引言
类风湿关节炎（RA）或寻常型银屑病等自身免疫性疾病被归类为迟发型超敏反应（DTHRs）。1 RA 是一种常见的自身免疫性疾病，其特征是侵蚀性滑膜炎和关节破坏。2 炎症性关节表现为炎性细胞的浸润与增殖，促炎细胞表达增加，导致肉芽组织形成以及软骨和骨的破坏。3,4 基质金属蛋白酶（MMPs）对胶原等细胞外基质分子的裂解，对于组织重塑和血管生成至关重要，同时也造成组织破坏。5,6 接触性超敏反应（CHR）的特征是中性粒细胞聚集，引发氧化爆发。7 与RA类似，CHR中的MMPs参与组织重塑、细胞迁移和血管生成，从而建立慢性炎症。
为研究类风湿性关节炎（RA），采用了葡萄糖-6-磷酸异构酶（GPI）血清注射小鼠模型。8 将含有抗GPI抗体的转基因K/BxN小鼠血清注射至未经处理的BALB/c小鼠体内，注射后24小时内开始出现风湿性炎症，GPI血清注射后第6天踝关节肿胀达到峰值（见1.1节）。为分析慢性接触性超敏反应（CHR），采用三硝基氯苯（TNCB）在腹部对C57....
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方案
本文所述所有实验程序均遵循实验室动物护理与使用的国际准则和标准，并经德国蒂宾根地区委员会动物福利与伦理委员会批准。8至12周龄的BALB/c和C57BL/6小鼠在12小时光照：12小时黑暗循环条件下饲养，置于独立通气笼具（IVC）中，环境温度为22 ± 1 °C，每2至5只一组饲养，自由饮水和进食 随意摄取.
1. 材料准备
- 根据相应产品说明书，在注射前将近红外荧光成像用OI染料进行稀释。用于检测基质金属蛋白酶（MMPs）的可激活OI染料（激发波长680 nm的商用探针） 体内 浓度为 20 nmol 的 OI 染料溶于 1.5 mL 1×PBS 中，可直接使用。使用前请轻轻振荡或涡旋混匀。OI 染料避光保存时可在 2 - 8 °C 条件下储存长达 6 个月。
- 对于 静脉注射的 (i.v.) 注射前准备静脉导管。使用一支装有0.9%生理盐水溶液（每50 mL含10个注射单位肝素）的20 U（0.5 mL）胰岛素注射器，并连接带有30号针头的聚乙烯导管。按每只小鼠2 nmol的推荐剂量注射OI染料。
2. 诱导类风湿性关节炎和慢性接触性超敏反应
- 类风湿关节炎
- 稀释来自 K/BxN 小鼠的 100 µL 血清
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结果
为了在未经处理的 BALB/c 小鼠中诱导类风湿关节炎（RA），于第 0 天通过腹腔注射（i.p.）给予抗 GPI 自身抗体（以 1:1 比例用 1× PBS 稀释）。在此 GPI 血清诱导的 RA 模型中，炎症程度（踝关节肿胀）在注射后第 6 天达到峰值11。因此，在第 5 天，将 2 nmol 的可激活光学成像（OI）染料制备好后，通过尾静脉静脉注射（i.v.）给予关节炎小鼠及健康对照动物。注射后 24 小时（第 6 天），按照第 3 节所述方法对小鼠进行麻醉和成像（图 1A）。
为诱导接触性超敏反应（CHR），于第0天在C57BL/6小鼠脱毛的腹部皮肤上涂抹5% TNCB进行致敏。致敏后第7天，st 从第15天开始，使用1% TNCB对右耳进行激发，最多进行五次激发以诱导慢性炎症。
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讨论
OI是一种非常有用、快速且经济的无创工具 体内 分子成像在临床前研究中的应用。光学成像（OI）的一个显著优势在于其能够监测高度动态的生物学过程，例如炎症反应。此外，OI 还可在较长时间范围内追踪疾病进展，时间跨度从数天至数周。
OI 具有相较于其他方法的多种优势 体内 成像模式如正电子发射断层扫描（PET）或磁共振成像（MRI）具有极高的时间与成本效益。每次采集可实现多达五只动物的高通量分析。此外，已有大量探针可供选择，可靶向多种不同的生物过程。12 为进一步提供解剖学信息，光学成像可与其他成像技术（如 MRI 或 X 射线）结合使用。另一项局限性是其组织穿透深度较浅，相比之下 例如 用于功能PET成像。此外，已有大量针对不同生物靶点的探针可供使用。12
麻醉对活体成像的影响不容忽视。in vivo 成像中，麻醉对光学成像（OI）结果的具体影响尚不明确，但本课题.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Daniel Bukala、Natalie Altmeyer和Funda Cay提供的出色技术支持。感谢Jonathan Cotton、Greg Bowden和Paul Soubiran对稿件的编辑。本工作由Werner Siemens基金会、蒂宾根埃伯哈德·卡尔斯大学医学院（“博士生院”）以及德国研究基金会（DFG）通过CRC 156（项目C3）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Cornergel | Gerhard Mann 公司 | 1224635 | 眼用软膏 |
| 异氟烷 | Abbott GmbH | 4831850 | 异氟烷 |
| U40 胰岛素注射器 | 贝克顿·迪金森公司 | 324876 | |
| 肝素 | Sintetica | 6093089 | |
| 高分子量聚乙烯 0.28 x 0.61 毫米 | Reichelt Chemietechnik GmbH+Co | 28460 | 聚乙烯管，内径 0.28 mm，外径 0.61 mm 毫米 |
| BD常规斜面针头，30 G | Becton Dickinson & Co. Ltd. | 305106 | 30 G 注射套管针 |
| RTA-0011 异氟烷蒸发器 | Vetland Medical Sales and Services LLC | - | |
| Artagain 绘图纸 | 斯特拉思莫尔艺术家用纸 | 446-8 | 煤黑色 |
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | 光学成像系统 |
| BD常规斜面针头，25 G | 贝克顿·迪金森公司 | 305122 | |
| 2-氯-1,3,5-三硝基苯 | Sigma Aldrich GmbH | 7987456F | TNCB |
| MMPSense 680 | Perkin Elmer | NEV10126 | 荧光成像染料 |
| Oditest | Koreplin GmbH | C1X018 | 机械测量 |
| Miglyol 812 | SASOL | - | 油 |
| BALB/C，C57BL/6 | 查尔斯河实验室 | - | 用于实验的小鼠 |
| PBS | Sigma Aldrich GmbH | 用于稀释类风湿性关节炎血清 | |
| 移液器（100 µL | Eppendorf | 用于TNCB涂抹 | |
| 剃须刀 | Wahl | 9962 | 动物毛发修剪器 |
| 活体成像 | Perkin Elmer | 用于测量 OI 的成像软件 |
参考文献
- Veale, D. J., Ritchlin, C., FitzGerald, O. Immunopathology of psoriasis and psoriatic arthritis. Ann Rheum Dis. 64, 26(2005).
- Harris, E. D. Rheumatoid arthritis. Pathophysiology and implications for therapy. N Engl J Med. 322 (18), 1277-1289 (1990).
- Lee, D. M....
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