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方法文章

非侵入性 体内 利用可激活荧光成像探针进行炎症性基质金属蛋白酶活性的荧光光学成像

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DOI：

10.3791/55180

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2017年5月8日

 ,  ,  ,  , 
1Werner Siemens Imaging Center, Department of Preclinical Imaging and Radiopharmacy, Eberhard Karls University of Tübingen, 2Department of Nuclear Medicine, Eberhard Karls University of Tübingen, 3Department of Dermatology, Eberhard Karls University of Tübingen

本文内容

摘要

本文阐述了利用可激活光学成像探针进行荧光成像的应用，以可视化目标分子 体内 两种不同炎症实验模型中关键基质金属蛋白酶的活性。

摘要

本文介绍了一种利用可激活荧光探针非侵入性成像基质金属蛋白酶（MMP）活性的方法。 通过 体内 荧光光学成像（OI）在两种不同的炎症小鼠模型中的应用：类风湿性关节炎（RA）模型和接触性超敏反应（CHR）模型。与波长低于650 nm的光相比，近红外（NIR）窗口（650 - 950 nm）的光能够实现更深的组织穿透和更小的信号吸收。使用荧光OI的主要优势在于其成本低、速度快，并且易于在不同动物模型中实施。

可激活荧光探针在其非活化状态下无光学信号，但在被蛋白酶激活后会表现出强烈的荧光。活化的基质金属蛋白酶（MMPs）可导致组织破坏，在类风湿关节炎（RA）和慢性接触性超敏反应（CHR）等迟发型超敏反应（DTHRs）的疾病进展中发挥重要作用。此外，MMPs 是引起软骨和骨降解的关键蛋白酶，可由巨噬细胞、成纤维细胞和软骨细胞在促炎性细胞因子刺激下诱导产生。本文采用一种可被关键 MMPs（如 MMP-2、-3、-9 和 -13）激活的探针，描述了一项成像方案：在疾病诱导后第6天，对 RA 模型小鼠和对照小鼠，以及在右耳分别接受一次激发（急性）和五次激发（慢性）的 CHR 小鼠与健康耳朵小鼠，进行近红外荧光光学成像（OI）以检测 MMP 活性。

引言

类风湿关节炎（RA）或寻常型银屑病等自身免疫性疾病被归类为迟发型超敏反应（DTHRs）。1 RA 是一种常见的自身免疫性疾病，其特征是侵蚀性滑膜炎和关节破坏。2 炎症性关节表现为炎性细胞的浸润与增殖，促炎细胞表达增加，导致肉芽组织形成以及软骨和骨的破坏。3,4 基质金属蛋白酶（MMPs）对胶原等细胞外基质分子的裂解，对于组织重塑和血管生成至关重要，同时也造成组织破坏。5,6 接触性超敏反应（CHR）的特征是中性粒细胞聚集，引发氧化爆发。7 与RA类似，CHR中的MMPs参与组织重塑、细胞迁移和血管生成，从而建立慢性炎症。

为研究类风湿性关节炎（RA），采用了葡萄糖-6-磷酸异构酶（GPI）血清注射小鼠模型。8 将含有抗GPI抗体的转基因K/BxN小鼠血清注射至未经处理的BALB/c小鼠体内，注射后24小时内开始出现风湿性炎症，GPI血清注射后第6天踝关节肿胀达到峰值（见1.1节）。为分析慢性接触性超敏反应（CHR），采用三硝基氯苯（TNCB）在腹部对C57BL/6小鼠进行致敏。致敏1周后，对右耳进行最多5次的激发攻击（另见1.1和1.2节）。

非侵入性小型动物OI是一种基于以下原理的技术 体内 荧光、化学发光和生物发光信号的检测，这些信号主要应用于临床前研究。所获得的半定量数据可揭示健康及疾病实验动物模型器官和组织中的分子机制，并支持纵向的连续监测测量。例如 评估治疗反应谱型 体内纵向研究的一大优势在于能够减少实验动物的使用数量，因为可以在多个时间点对同一动物进行随访测量，而无需在每个时间点使用不同的小鼠。光学成像（OI）的分辨率能够实现对实验动物器官甚至更小组织结构的详细功能成像。

使用具有窄透射光谱的特定激发和发射滤光片、通过不透光的"暗箱"防止杂散光干扰，以及采用灵敏度高且在许多设备中可冷却至-70 °C的电荷耦合器件（CCD）相机，可实现对荧光信号的高度特异性和高灵敏度检测。

通过使用激发和发射光谱位于近红外荧光窗口（650 - 950 nm）的荧光试剂，可显著提高信噪比。近红外荧光窗口的特点是血红蛋白和水对该波段信号的吸收较低，同时背景自发荧光也较弱。9 这使得信号在小动物组织中的穿透深度可达2 cm。光学成像探针（OI探针）可直接靶向目标（例如通过荧光标记的抗体），也可在目标组织中被激活（例如由蛋白酶激活）。可激活型OI探针在其非活性状态下由于弗斯特共振能量转移（Förster resonance energy transfer, FRET）至一个淬灭基团而呈光学静默状态，该过程将分子内的激发能转移至另一结构域。当染料被切割（例如被蛋白酶切割）后，分子内的能量转移不再发生，从而可通过光学成像检测到荧光信号。这使得设计具有高特异性识别特定生物过程能力且信噪比优异的OI探针成为可能。

以下方案详细说明了动物准备以及使用可激活的光学成像探针检测 MMP-2、-3、-9 和 -13 活性的光学成像（OI）测量方法 体内 以及两种炎症实验模型（RA，CHR）。

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方案

本文所述所有实验程序均遵循实验室动物护理与使用的国际准则和标准，并经德国蒂宾根地区委员会动物福利与伦理委员会批准。8至12周龄的BALB/c和C57BL/6小鼠在12小时光照：12小时黑暗循环条件下饲养，置于独立通气笼具（IVC）中，环境温度为22 ± 1 °C，每2至5只一组饲养，自由饮水和进食 随意摄取.

1. 材料准备

  1. 根据相应产品说明书，在注射前将近红外荧光成像用OI染料进行稀释。用于检测基质金属蛋白酶（MMPs）的可激活OI染料（激发波长680 nm的商用探针） 体内 浓度为 20 nmol 的 OI 染料溶于 1.5 mL 1×PBS 中，可直接使用。使用前请轻轻振荡或涡旋混匀。OI 染料避光保存时可在 2 - 8 °C 条件下储存长达 6 个月。
  2. 对于 静脉注射的 (i.v.) 注射前准备静脉导管。使用一支装有0.9%生理盐水溶液（每50 mL含10个注射单位肝素）的20 U（0.5 mL）胰岛素注射器，并连接带有30号针头的聚乙烯导管。按每只小鼠2 nmol的推荐剂量注射OI染料。

2. 诱导类风湿性关节炎和慢性接触性超敏反应

  1. 类风湿关节炎
    1. 稀释来自 K/BxN 小鼠的 100 µL 血清10) 加入针对葡萄糖-6-磷酸异构酶（GPI）的抗体（AB），与1×PBS按1:1比例混合（200 µL），用于诱导类风湿关节炎（RA）。将稀释后的血清储存于-80 °C。RA诱导的详细步骤由Monach描述 等8.
    2. 为诱导类风湿关节炎（RA），轻轻抓住每只小鼠的尾巴将其提起，然后向腹腔注射200 µL稀释后的血清i.p.在实验第0天进行注射后，立即将小鼠放回其笼中。
    3. 可选：在踝关节注射前测量每侧踝关节的直径，并定义一个 "关节炎评分" (图1A）。使用机械测量装置（千分尺）在注射GPI血清后每天继续测量踝关节肿胀，直至第6天。
    4. 注射可激活的OI染料（步骤1.1–1.2），以进行测量 体内 MMP 活性 i.v. 到类风湿性关节炎小鼠的尾静脉中 在GPI血清注射后第5天，向对照小鼠尾静脉注射。尾静脉注射24小时后进行光学成像实验。
  2. 接触性超敏反应：
    1. 为对 C57BL/6 小鼠进行致敏，配制 5% TNCB 溶液，溶于丙酮/油（4:1）混合液中。
    2. 使用1.5%异氟烷（溶于100%氧气，流速1.5 L/min）对C57BL/6小鼠进行麻醉。小鼠麻醉后，将其置于自制鼻罩（由截断的5 mL聚乙烯注射器制成，并连接至1.5 vol%异氟烷供气管）中以维持麻醉状态。对麻醉动物涂抹兽用眼膏，以防止麻醉期间眼睛干涩。
    3. 小心使用小型动物毛发修剪器剃除腹部毛发（2 cm × 2 cm），避免损伤皮肤，以免引起动物体内非特异性荧光信号，影响研究结果。
    4. 使用100 µL移液器将80 µL的5% TNCB溶液缓慢滴加至小鼠脱毛的腹部区域，以进行致敏。将小鼠轻柔放回笼中，注意避免其眼睛接触垫料，以防角膜损伤，并在恢复期间防止体温过低。
    5. 致敏后第6天，配制1% TNCB溶液（溶于9:1的丙酮/油混合液中），用移液器取20 µL涂抹于右耳，以诱导急性和慢性接触性超敏反应（CHSR）。1
      1. 从第1步开始st 用100 µL移液器在右耳两侧各给予20 µL的1% TNCB溶液进行激发，此后每两天重复激发一次，共进行五次（致敏后第15天），以诱导接触性超敏反应（CHR）图1B每日使用千分尺测量耳部厚度。
    6. 注射可激活的OI染料（一种激发波长为680 nm的商业探针）（步骤1.1–1.2），以检测MMP活性 体内 在攻击后12小时的CHR小鼠中。尾静脉注射后24小时进行光学成像实验（i.v.).

3. 光学成像的动物准备

  1. 将小鼠饲料（成像前至少3天）更换为低荧光或无荧光饲料（例如，无锰）以避免自发荧光（约700 nm）对所用光学成像试剂荧光信号的干扰。
  2. 将动物放入麻醉箱中，使用1.5 vol%异氟烷与氧气（1.5 L/min）混合气体进行麻醉（氧气可被空气替代，但须在同一次实验中保持一致）。
  3. 当小鼠明显进入麻醉状态后，将其放入自制的鼻罩（由剪去前端的5 mL聚乙烯注射器连接1.5 vol%异氟烷管路制成）中以维持麻醉。
  4. 使用小型动物毛发修剪器，在目标区域（2 cm × 2 cm）小心剃毛。避免损伤皮肤，以免在动物体内产生非特异性荧光信号，影响研究结果。
    注意：毛发可能会吸收光学成像（OI）过程中的荧光信号（吸收程度取决于小鼠品系以及感兴趣区域（ROI）的位置，吸收情况因部位而异）。
  5. 对于 i.v. 注射时，将小鼠尾巴置于温水中以诱导血管扩张，用酒精轻轻清洁注射部位的皮肤，从尾巴远端开始插入导管。 "切割" 将针头以20°角插入尾静脉，然后重新连接注射器以测试导管位置是否正确。
  6. 若导管位置正确，更换注射器并注入OI探针（2 nmol）。注射后，再次更换注射器并注入25 µL 0.9%生理盐水溶液，以彻底冲洗聚乙烯管路的死腔体积。
    注意：用于检测基质金属蛋白酶（MMP）活性的OI染料（一种激发波长为680 nm的商用探针）的组织半衰期时间 体内 为72小时。为确保染料完全清除，不建议在前次注射后7天内再次注射染料。

4. 光学成像

  1. 在OI扫描仪的黑色盒子内，将一张黑色塑料或纸张置于视野（FOV）中心位置。
  2. 设置测量方案，选择合适的波长（激发光：680 ± 10 nm，发射光：700 ± 10 nm）和成像参数。
    注意：在某些 OI 系统中，多种成像染料的设置已预先定义。
  3. 为选择正确的荧光成像方案，打开成像软件（由制造商提供）并初始化系统。大多数CCD相机需要冷却至工作温度，此过程可能需要10分钟。为获得可靠结果，请等待系统准备就绪后再进行操作。
  4. 观察 体内 成像系统采集控制面板弹出后，每个选定的滤光片组合将在序列中代表一幅图像。在此情况下，使用商用染料的滤光片组合采集一幅图像，其激发波长和发射波长分别为680 ± 10 nm和700 ± 10 nm，并开始测量（按下 "获取序列"）。有关更详细的说明，请参阅制造商提供的使用手册。
  5. 适当标记图像，并将信息保存在 "编辑图像标签" 窗口，将在后续弹出 "获取序列".
  6. 在注射OI染料前，对每只动物进行基线扫描，或使用未经处理的对照动物以区分背景信号。
  7. 尾静脉注射OI染料后h，将动物置于视场中心，调整位置以在OI系统中获得最强信号，然后开始测量。
    注意：低体温会显著影响显像剂的分布。务必将成像平台预热至 37 °C，以避免动物出现低体温。可同时对 1 至 5 只小鼠进行成像。根据同时检测的动物数量选择合适的视场大小。可拍摄明场图像以确认每只小鼠是否清晰可见。

5. 数据分析

注意：按照制造商的方案，使用图像软件进行数据分析。

  1. 测量相对活度（RA）时，使用光子发射的校准单位，如图2所示；而慢性CHSR则以百分比形式的信号强度（效率）表示。
  2. 若需手动绘制感兴趣区域（ROI），请使用工具面板。分析RA图像时，采用标准化圆形，在每只动物的所有踝关节和足部围绕信号最强的区域绘制。分析CHSR时，根据明场图像在左右耳的整个区域周围绘制ROI。
  3. 要测量特定绘制ROI内的光子发射或信号强度值，请点击"测量"。系统将提供所绘ROI内的数值，用于描述性统计分析。

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结果

为了在未经处理的 BALB/c 小鼠中诱导类风湿性关节炎（RA），于第 0 天通过腹腔注射（i.p.）给予针对 GPI 的自身抗体（以 1×PBS 1:1 稀释）。在此 GPI 血清诱导的 RA 模型中，炎症最显著（踝关节肿胀）出现在注射后第 6 天11。因此，在第 5 天，将 2 nmol 的可激活光学成像（OI）染料制备好后通过尾静脉静脉注射（i.v.）给予关节炎小鼠及健康对照动物。注射后 24 小时（第 6 天），对小鼠进行麻醉，并按照第 3 节所述方法进行成像（图 1A）。

为诱导接触性超敏反应（CHR），于第0天在C57BL/6小鼠脱毛的腹部用5% TNCB进行致敏。致敏后第7天，st 从第15天开始，使用1% TNCB对右耳进行激发，最多进行五次激发以诱导慢性炎症。7...

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讨论

OI是一种非常有用、快速且经济的无创工具 体内 分子成像在临床前研究中的应用。光学成像（OI）的一个显著优势在于其能够监测高度动态的生物学过程，例如炎症反应。此外，OI 还可在较长时间范围内追踪疾病进展，时间跨度从数天至数周。

OI 具有相较于其他方法的多种优势 体内 成像模式如正电子发射断层扫描（PET）或磁共振成像（MRI）具有极高的时间与成本效益。每次采集可实现多达五只动物的高通量分析。此外，已有大量探针可供选择，可靶向多种不同的生物过程。12 为进一步提供解剖学信息，光学成像可与其他成像技术（如 MRI 或 X 射线）结合使用。另一项局限性是其组织穿透深度较浅，相比之下 例如 用于功能PET成像。此外，已有大量针对不同生物靶点的探针可供使用。12

麻醉对活体成像的影响不容忽视。in vivo 成像中，麻醉对光学成像（OI）结果的具体影响尚不明确，但本课题...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢Daniel Bukala、Natalie Altmeyer和Funda Cay提供的出色技术支持。感谢Jonathan Cotton、Greg Bowden和Paul Soubiran对稿件的编辑。本工作由Werner Siemens基金会、蒂宾根埃伯哈德·卡尔斯大学医学院（“博士生院”）以及德国研究基金会（DFG）通过CRC 156（项目C3）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CornergelGerhard Mann 公司1224635眼用软膏 
异氟烷Abbott GmbH4831850异氟烷
U40 胰岛素注射器贝克顿·迪金森公司324876
肝素Sintetica6093089
高分子量聚乙烯 0.28 x 0.61 毫米Reichelt Chemietechnik GmbH+Co28460聚乙烯管，内径 0.28 mm，外径 0.61 mm 毫米 
BD常规斜面针头，30 GBecton Dickinson & Co. Ltd.30510630 G 注射套管针
RTA-0011 异氟烷蒸发器Vetland Medical Sales and Services LLC-
Artagain 绘图纸斯特拉思莫尔艺术家用纸446-8煤黑色
IVIS SpectrumPerkin Elmer124262光学成像系统
BD常规斜面针头，25 G贝克顿·迪金森公司305122
2-氯-1,3,5-三硝基苯Sigma Aldrich GmbH7987456FTNCB
MMPSense 680Perkin Elmer NEV10126荧光成像染料
Oditest Koreplin GmbHC1X018机械测量
Miglyol 812SASOL-油
 BALB/C，C57BL/6查尔斯河实验室 -用于实验的小鼠
PBSSigma Aldrich GmbH用于稀释类风湿性关节炎血清 
移液器（100 µLEppendorf 用于TNCB涂抹 
剃须刀 Wahl 9962动物毛发修剪器
活体成像 Perkin Elmer 用于测量 OI 的成像软件

参考文献

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