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靶向液相晶体纳米颗粒载体包封疏水性货物的质膜递送

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DOI：

10.3791/55181

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2017年2月8日

 ,  ,  ,  , 
1Center for Biomolecular Science and Engineering, Naval Research Laboratory, 2Optical Sciences Division, Naval Research Laboratory, 3Sotera Defense Solutions

本文内容

摘要

利用液晶纳米颗粒（LCNP）纳米载体作为载体，将疏水性货物可控地递送至活细胞的质膜。

摘要

将药物/成像剂可控地递送至细胞，对于治疗手段的开发以及细胞信号传导过程的研究至关重要。近年来，纳米颗粒（NPs）在递送系统的开发中展现出巨大潜力。本文采用基于液晶纳米颗粒（LCNP）的递送系统，实现了将一种水不溶性染料——高氯酸3,3′-二十八烷基氧杂羰花青（DiO）——从NP核心可控地递送至质膜双分子层的疏水区域。在NP合成过程中，通过多种光谱分析证实，该染料被高效地包载于疏水性LCNP核心中。通过将聚乙二醇化胆固醇衍生物偶联至NP表面（DiO-LCNP-PEG-Chol），实现了载染料NP与HEK 293T/17细胞质膜的结合。时间分辨激光扫描共聚焦显微镜和荧光共振能量转移（FRET）成像证实了DiO从LCNP核心被动流出并插入质膜双分子层的过程。最后，以LCNP-PEG-Chol形式递送DiO可减轻DiO的细胞毒性；与从体相溶液中直接递送的游离DiO（DiOfree）相比，NP形式的DiO毒性降低了约30–40%。该方法展示了LCNP平台作为疏水性分子货物靶向细胞膜递送与调控的有效手段的应用价值。

引言

自从纳米材料（至少在一个维度上尺寸≤100 nm）与活细胞相互作用的研究兴起以来，持续的目标一直是利用纳米颗粒（NPs）独特的尺寸依赖性特性，以实现多种应用。这些应用包括细胞和组织标记/成像（两者 体外 和 体内）、实时传感，以及药物和其他载荷的可控递送1此类相关纳米颗粒特性的实例包括：半导体纳米晶体（量子点，QDs）的尺寸依赖性发射特性；金纳米颗粒的光热特性；脂质体水核的大载药容量；以及碳同素异形体（如单壁碳纳米管和石墨烯）的弹道导电性。

近年来，人们对于利用纳米颗粒（NPs）对药物及其他载荷（如对比剂/成像剂）进行可控调节产生了浓厚兴趣。其原理在于通过将药物以纳米颗粒制剂的形式递送，显著提高或优化药物载荷的整体溶解度、递送剂量、循环时间以及最终的清除特性。这一策略被称为纳米颗粒介导的药物递送（NMDD）。目前已有七种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的纳米颗粒药物制剂在临床中用于治疗多种癌症，另有数百种正处于不同阶段的临床试验中。本质上，其目标是 "以更少实现更多" 即利用纳米颗粒（NP）作为载体，通过其较大的表面积与体积比，实现单次给药输送更多药物，从而减少给药次数例如，硬质颗粒，如量子点和金属氧化物）的纳米颗粒，或利用其较大的内部空间来装载大量货物例如，脂质体或胶束）。其目的在于减少多次全身给药的需求，同时提高水相稳定性和循环时间，尤其针对那些虽具高药效但水溶性极差的疏水性药物载体。

因此，本研究旨在确定利用一种新型纳米颗粒（NP）支架将疏水性货物特异性且可控地递送至亲脂性细胞质膜双分子层的可行性。本研究的动因在于疏水性分子在水相介质中固有的溶解度低以及向细胞递送困难的问题。通常，递送此类疏水性分子需要使用有机溶剂（例如，DMSO）或两亲性表面活性剂（例如，Poloxamers），这些物质可能具有毒性，影响细胞和组织的活力2，或使用胶束载体，但其内部载药能力有限。本研究选用的NP载体是一种此前开发的新型液晶纳米颗粒（LCNP）制剂3，先前研究已表明该制剂在培养细胞中可使抗癌药物阿霉素的疗效提高约40倍4。

在本研究中，选用的代表性货物为电位敏感膜染料高氯酸-3,3'-二辛基氧杂羰花青（DiO）。DiO是一种水不溶性染料，已被用于活体或固定神经元的顺行和逆行示踪、膜电位测量以及细胞膜的一般性标记5,6,7,8,9。由于其疏水特性，DiO通常以结晶形式直接加入细胞单层或组织中10，或从高浓度储备液稀释后，以非常高的浓度（约1–20 µM）孵育使用 11,12。

在此，采用LCNP平台作为DiO的递送载体。LCNP是一种多功能纳米颗粒，其内核完全疏水，表面则兼具亲水性并可进行生物偶联。DiO在LCNP合成过程中被包载于其内核中，随后通过在纳米颗粒表面功能化修饰聚乙二醇化胆固醇分子，促进DiO-LCNP复合物与质膜的结合。该方法所构建的递送系统，相较于从体相溶液中直接递送游离DiO（DiOfree），能更精确地将DiO分配至质膜，并显著延长其在膜上的驻留时间。此外，该方法还表明，通过LCNP介导的DiO递送可显著调控并驱动染料向亲脂性质膜双层的特异性分配速率。同时，将DiO以LCNP制剂形式递送，可使游离药物的细胞毒性降低约40%。

预计本文所述的方法将成为一种强有力的技术手段，适用于其研究涉及或需要将高度疏水性货物递送至细胞内的科研人员，这类货物在水溶液中溶解性极差或完全不溶。

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方案

1. DiO-LCNP 和 DiO-LCNP-PEG-Chol 的制备

  1. 将液晶二丙烯酸酯交联剂（DACTP11，45 mg）、3,3′-二十八烷基氧羰花青高氯酸盐（DiO，2 mg）和自由基引发剂（偶氮二异丁腈，1 mg）溶于2 ml氯仿中用于聚合反应。将此溶液加入含丙烯酸酯化表面活性剂（AC10COONa，13 mg溶于7 ml水）的水溶液中。
  2. 搅拌混合物1小时，然后以80%的振幅超声处理5分钟，形成微乳液，其中有机材料的小液滴被水中的可聚合表面活性剂包围。
  3. 将混合物在油浴中加热至 64 °C 在氯仿缓慢蒸发的过程中，引发交联剂和表面活性剂的聚合，形成由表面活性剂稳定的含DiO的纳米颗粒悬浮液。
  4. 将纳米颗粒悬液通过0.2 µm注射器滤器过滤3次，以去除任何聚集物。将过滤后的纳米颗粒溶液于4 °C保存，待后续使用。
  5. 通过EDC偶联将PEG-Chol与DiO-LCNP偶联。
    1. 溶解 Chol-PEG-NH2·HCl（PEG-Chol，0.9 mM）溶于25 mM HEPES缓冲液（pH 7.0）中。
    2. 配制含有以下成分的工作液 N羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐（NHSS，40 mM）和盐酸1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺（EDC，400 mM）溶于HEPES缓冲液，由浓缩储备液配制。
    3. 立即向1.0 ml HEPES缓冲液中的DiO-LCNP加入20 µl新配制的NHSS/EDC工作溶液，搅拌5分钟。
    4. 加入20 µl的Chol-PEG-NH储备液2·将 HCl 加入该混合物中，搅拌 2 小时。
    5. 使用台式小型离心机将反应混合物在最大速度（约2,000 × g）下短暂离心30秒，然后将上清液通过PD-10凝胶过滤层析柱13 用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS，0.1×）平衡。

2.  DiO-LCNP 和 DiO-LCNP-PEG-Chol 的表征

  1. 通过凝胶电泳确认 PEG-Chol 成功共价偶联至 DiO-LCNP 表面。
    1. 将 0.5 g 琼脂糖溶解于 50 ml（1×）三羟甲基氨基甲烷-硼酸电泳（TBE；89 mM Tris（pH 7.6）、89 mM 硼酸和 2 mM EDTA）缓冲液中。将溶液放入微波炉加热以溶解琼脂糖。待溶液稍冷却后，倒入电泳槽中的凝胶板内。插入梳子以形成加样孔。
    2. 待凝胶完全凝固后，向电泳槽中加入足量的 TBE 电泳缓冲液（足以浸没凝胶）。
    3. 将 35 µl DiO-LCNP 样品（加入甘油，终浓度为 5% v/v）加入凝胶孔中，并在 110 V 电压下电泳 20 分钟。
    4. 使用凝胶成像系统对凝胶进行成像，激发波长为 488 nm，发射波长范围为 500–550 nm。
  2. 通过将 DiO-LCNP 溶液在 PBS（pH ~8，0.1×）中稀释约 200 倍后，采用动态光散射（DLS）法测定颗粒大小及分布14。使用合适的仪器测定 DiO-LCNPs 的 zeta 电位。

3. 递送实验与成像用细胞培养皿的制备

注意：DiO-LCNP 标记在传代 5 至 15 代之间的 HEK 293T/17 人胚胎肾细胞上进行，细胞培养方法如前所述4。递送实验及后续细胞成像操作如下所述。

  1. 在37 °C条件下，用牛纤维连接蛋白（约100 µl，浓度为20 µg/ml）的DPBS溶液对直径35 mm的组织培养皿（配有14 mm 1号盖玻片插件）进行包被处理，持续2小时。
  2. 移除培养皿中的纤维连接蛋白包被液。从T-25培养瓶中收获HEK 293 T1/7细胞：先用3 ml DPBS洗涤细胞单层，然后加入2 ml胰蛋白酶-EDTA溶液（0.5%胰蛋白酶-0.25% EDTA）。
  3. 将培养瓶在37 °C孵育约3分钟。吸除胰蛋白酶-EDTA溶液后，将培养瓶放回孵箱。待细胞从瓶壁脱落时，向瓶中加入4 ml完全培养基（DMEM高糖培养基；Dulbecco改良Eagle培养基；添加10%胎牛血清、5%丙酮酸钠和5%抗生素/抗真菌剂）以中和胰蛋白酶活性。使用细胞计数仪对细胞悬液中的细胞浓度进行计数测定。
  4. 用生长培养基将细胞浓度调整至约8 × 104 个细胞/ml。向培养皿中加入3 ml细胞悬液，于孵箱中培养过夜；次日细胞应达到约70%汇合度，即可用于实验。适当的细胞密度对于实现高比例细胞的强效且高效的标记至关重要。

4. DiO 和 DiO-LCNPs 的细胞递送及固定细胞成像

  1. 在递送培养基（HEPES-DMEM；含25 mM HEPES的DMEM）中稀释DiO储备液，配制1 ml的DiO、DiO-LCNP和DiO-LCNP-PEG-Chol溶液自由 以及DiO-LCNPs；与细胞孵育的合适DiO浓度约为1–10 µM（以DiO的浓度表示）自由 或以 DiO-LCNP 形式存在的 DiO。
  2. 使用移液管从培养皿中移除生长培养基，并用 HEPES-DMEM 洗涤细胞单层（见步骤 3）两次（每次 2 ml）。洗涤时，用移液管沿培养皿边缘轻轻加入和吸出 HEPES-DMEM。
  3. 加入 0.2 ml 制备好的 DiO自由 或将DiO-LCNP递送溶液加入培养皿中央，然后将培养皿放回培养箱中孵育适当时间（通常为15或30分钟，具体时间根据实验需求而定）。较长的孵育时间会增加非膜区域的非特异性细胞标记。例如，细胞质）
  4. 孵育结束后，使用血清移液管移除递送溶液。用DPBS洗涤细胞单层两次（每次2 ml）。洗涤时，沿培养皿边缘轻柔地加入并吸出DPBS。
  5. 使用4%多聚甲醛（以DPBS配制）在室温下固定细胞单层15分钟。
    警告：多聚甲醛具有可燃性，可刺激呼吸道，并可能具有致癌性。
  6. 使用移液器吸除多聚甲醛溶液，然后沿培养皿边缘用移液器加入并吸出2 ml DPBS，轻柔洗涤细胞1次。
  7. 固定后的细胞已准备好使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）检测膜性荧光信号。应立即进行成像，或者 alternatively，用含有0.05% NaN₃的DPBS替换培养基3并将培养皿置于 4 °C 保存。
    警告：NaN3有剧毒；使用 NaN₃ 时需格外小心3.
    注意：以这种方式保存的固定样品应在48小时内进行成像，以获得最佳结果。

5. DiO 和 DiO-LCNPs 的细胞递送及活细胞中的 FRET 成像

注意：在此方法中，细胞使用 6 µM 的 DiO-LCNP-PEG-Chol（其中 DiO 为 FRET 供体）和 6 µM 的 1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐（DiIfree，其中 DiI 为 FRET 受体）进行共标记。通过观察到 DiO 供体向 DiI 受体的能量转移增加，证实了 DiO 从 DiO-LCNP-PEG-Chol 释放并掺入细胞质膜的过程。

  1. 使用步骤4中所述方法，依次用DiO-LCNP-PEG-Chol和DiIfree对细胞进行标记。
  2. 染色后，用移液管以2 ml DPBS洗涤细胞1次，并将洗涤液替换为2 ml活细胞成像溶液（LCIS）。
  3. 在配备加热培养室的显微镜载物台上，使用共聚焦显微镜（60倍物镜）以FRET成像模式对活细胞样本进行成像，在4小时内每30分钟采集一次图像；激发DiO供体波长为488 nm，并使用32通道光谱探测器收集DiO供体和DiI受体在490–700 nm范围内的完整发射光谱。
  4. 注：有关FRET成像的更多详细信息，请参见参考文献15。
  5. 确定经DiO-LCNP-PEG-Chol和DiI染色的细胞中DiO供体与DiI受体的时间分辨发射强度，并计算图像中受体/供体FRET比值（DiIemi/DiOemi）；该比值将随时间逐渐升高，直至DiO供体在细胞膜中分布达到最大量后趋于平稳16。

6. DiO 和 DiO-LCNPs 对 HEK 293T/17 细胞的细胞毒性检测

注意：采用基于四唑盐染料的增殖实验评估 DiO-LCNP 材料的细胞毒性17。将细胞在多孔板中培养，并在模拟递送/标记条件的环境下加入不同浓度的材料。随后将细胞继续培养 72 小时，以允许细胞增殖。向各孔中加入染料（MTS，即 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑），代谢活跃的细胞会将该染料转化为蓝色的甲臜产物。显色程度与活细胞数量成正比。

  1. 按照步骤3.2中所述方法，从T-25培养瓶中收获HEK 293 T1/7细胞。将HEK 293T/17细胞以每孔5,000个细胞/100 µl的密度接种至96孔组织培养板的各孔中，培养24小时。
  2. 使用微量移液器完全吸除各孔中的培养基，向重复孔中加入50 µl含DiOfree、DiO-LCNPs或DiO-LCNP-PEG-Chol的HEPES-DMEM，浓度梯度递增。在37 °C条件下孵育30分钟。
    注意：通常设置三复孔或四复孔即可获得具有统计学可靠性的数据。
    1. 孵育结束后，用微量移液器移除含有材料的递送介质，并替换为100 µl新鲜生长培养基。继续培养细胞72小时。
  3. 向每孔加入20 µl四唑盐底物，将培养板放回孵箱，在37 °C下反应4小时以显色。使用酶标仪测定甲臜产物在570 nm（本研究所用DiO-LCNPs的吸收最小值）和650 nm（用于扣除非特异性背景吸收）处的吸光度（abs）。
  4. 以材料浓度为横坐标，以差分吸光度值（abs570 - abs650）为纵坐标作图，并将结果表示为对照组细胞增殖率的百分比（即仅在细胞培养基中培养的细胞的增殖程度）。

7. 数据分析

  1. 采用单因素方差分析（ANOVA）对数据进行统计分析。对于多重比较，应用Bonferroni事后检验。除非另有说明，所有平均值均以±均值标准误（SEM）表示。
    注：显著性检验的可接受概率为 p < 0.05。

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结果

制备了LCNP，其中NP的疏水核心负载了一种典型的膜标记探针，以证明LCNP作为疏水性货物高效递送载体的实用性。为此，选择的货物是高度不溶于水的电位敏感性膜标记染料DiO。采用两相微乳液法制备了负载DiO的LCNP（DiO-LCNPs），所用化学组分包括DACTP11、AC10COONa和DiO，如图 118所示。在此NP体系中，结晶交联剂DACTP11形成的共价连接聚合物网络构成了稳定的疏水核心，DiO即位于交联网络的间隙空间内。NP表面的羧酸根赋予颗粒在水相介质中的胶体稳定性，同时也作为功能基团“把手”，用于连接细胞靶向配体（及其他生物分子）。为了将DiO-LCNPs锚定在质膜上，通过EDC偶联反应将胺端化的聚乙二醇化胆固醇分子（PEG-Chol）共价连接至LCNP表面（图 1）。在完成NP合成并确认生物偶联成功后，评估了DiO-LCNPs标记活细胞质膜的能力，及其将嵌入的DiO货物递送至质膜双分子层亲脂区域的效果，与从体相溶液中直接递送的游离形式（D...

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讨论

NMDD 的一个持续目标是实现药物制剂向细胞和组织的可控靶向递送，同时提高药物疗效。其中，疏水性药物/成像剂是一类面临重大挑战的药物分子，它们在水相介质中溶解度极低甚至完全不溶。这一问题长期阻碍了高效药物从 体外 细胞培养系统向临床应用的转化过程中，导致许多有前景的药物分子被“搁置”或放弃，未能进一步进入临床研究。例如，渥曼青霉素（Wtmn）是一种强效的磷脂酰肌醇3′激酶和磷脂酰肌醇3′激酶相关激酶抑制剂，具有良好的抗癌潜力，但因其水溶性差，阻碍了其在临床试验中的进一步推进。

最近，Karve 等 研究表明，当白桦脂醇（Wtmn）被制备为脂质-聚合物纳米颗粒（NP）组装体时，其水溶性得到显著改善19。此类以纳米颗粒形式实现的改进型、可控递送系统在多个领域具有应用潜力，尤其适用于将疏水性药物和成像剂递送至质膜。因此，本研究的目标是解决这一技术难题，并建立一种克服该技术瓶颈的方法学。

在开发该方法时，选择了一种模型膜靶向染料DiO，该染料在水相介质...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本研究由美国海军研究实验室基础资助项目（项目编号 MA041-06-41-4943）资助。ON 获得国家研究委员会博士后研究协会资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDCA）ThermoFisherE2247
3,3′-二十八烷基氧杂羰花青高氯酸盐（DiO）Sigma AldrichD4292-20MG有害；用DMSO配制储备液
胆固醇聚乙二醇胺盐酸盐Nanocs, Inc.PG2-AMCS-2k
Countess 自动细胞计数仪ThermoFisherC10227
二十八烷基-3,3,3′⁠,3′-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐（DiI）Sigma Aldrich468495-100MG有害；用DMSO配制储备液
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）ThermoFisher21063045使用前于37 °C预热
杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）ThermoFisher14040182使用前于37 °C预热
动态光散射仪ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)
牛纤维连接蛋白，血浆来源ThermoFisher33010018使用DPBS配制1 mg/ml储备液。包被MatTek培养皿时使用20–30 µg/ml，37 °C孵育2小时
甲醛（16%，W/V）ThermoFisher28906有害；用DPBS稀释至4%
人胚胎肾细胞（HEK 293T/17）美国模式培养物集存库ATCC® CRL-11268™
活细胞成像溶液（LCIS）ThermoFisherA14291DJ使用前于37 °C预热
MatTek 14 mm #1.0 盖玻片插件细胞培养皿MatTek corporationP35G-1.0-14-C
含25 mM HEPES的改良伊格尔培养基（DMEM）ThermoFisher21063045使用前于37 °C预热
N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐（NHSS）ThermoFisher24510
Nikon A1si 光谱共聚焦显微镜Nikon Instruments
台盼蓝染液（0.4%） ThermoFisherT10282计数细胞前按50%比例与细胞悬液混合
Zeta电位仪ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)
超声波处理器Sonics and Materials IncGEX 600-5
迷你离心机BenchmarkMini-fuge-04477
PD-10 Sephadex™ G-25 MediumGE Healthcare17-0851-01
Bio-Rad ChemiDoc XRS 成像系统Bio-RAD76S/07434
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红ThermoFisher25200056

参考文献

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FRET PEG HEK 293T

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