靶向液相晶体纳米颗粒载体包封疏水性货物的质膜递送

摘要

利用液晶纳米颗粒（LCNP）纳米载体作为载体，将疏水性货物可控地递送至活细胞的质膜。

摘要

将药物/成像剂可控地递送至细胞，对于治疗手段的开发以及细胞信号传导过程的研究至关重要。近年来，纳米颗粒（NPs）在递送系统的开发中展现出巨大潜力。本文采用基于液晶纳米颗粒（LCNP）的递送系统，实现了将一种水不溶性染料——高氯酸3,3′-二十八烷基氧杂羰花青（DiO）——从NP核心可控地递送至质膜双分子层的疏水区域。在NP合成过程中，通过多种光谱分析证实，该染料被高效地包载于疏水性LCNP核心中。通过将聚乙二醇化胆固醇衍生物偶联至NP表面（DiO-LCNP-PEG-Chol），实现了载染料NP与HEK 293T/17细胞质膜的结合。时间分辨激光扫描共聚焦显微镜和荧光共振能量转移（FRET）成像证实了DiO从LCNP核心被动流出并插入质膜双分子层的过程。最后，以LCNP-PEG-Chol形式递送DiO可减轻DiO的细胞毒性；与从体相溶液中直接递送的游离DiO（DiO_free）相比，NP形式的DiO毒性降低了约30–40%。该方法展示了LCNP平台作为疏水性分子货物靶向细胞膜递送与调控的有效手段的应用价值。

引言

自从纳米材料（至少在一个维度上尺寸≤100 nm）与活细胞相互作用的研究兴起以来，持续的目标一直是利用纳米颗粒（NPs）独特的尺寸依赖性特性，以实现多种应用。这些应用包括细胞和组织标记/成像（两者 体外 和 体内）、实时传感，以及药物和其他载荷的可控递送¹此类相关纳米颗粒特性的实例包括：半导体纳米晶体（量子点，QDs）的尺寸依赖性发射特性；金纳米颗粒的光热特性；脂质体水核的大载药容量；以及碳同素异形体（如单壁碳纳米管和石墨烯）的弹道导电性。

近年来，人们对于利用纳米颗粒（NPs）对药物及其他载荷（如对比剂/成像剂）进行可控调节产生了浓厚兴趣。其原理在于通过将药物以纳米颗粒制剂的形式递送，显著提高或优化药物载荷的整体溶解度、递送剂量、循环时间以及最终的清除特性。这一策略被称为纳米颗粒介导的药物递送（NMDD）。目前已有七种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的纳米颗粒药物制剂在临床中用于治疗多种癌症，另有数百种正处于不同阶段的临床试验中。本质上，其目标是 "以更少实现更多" 即利用纳米颗粒（NP）作为载体，通过其较大的表面积与体积比，实现单次给药输送更多药物，从而减少给药次数例如，硬质颗粒，如量子点和金属氧化物）的纳米颗粒，或利用其较大的内部空间来装载大量货物例如，脂质体或胶束）。其目的在于减少多次全身给药的需求，同时提高水相稳定性和循环时间....

方案

1. DiO-LCNP 和 DiO-LCNP-PEG-Chol 的制备

1. 将液晶二丙烯酸酯交联剂（DACTP11，45 mg）、3,3′-二十八烷基氧羰花青高氯酸盐（DiO，2 mg）和自由基引发剂（偶氮二异丁腈，1 mg）溶于2 ml氯仿中用于聚合反应。将此溶液加入含丙烯酸酯化表面活性剂（AC10COONa，13 mg溶于7 ml水）的水溶液中。
2. 搅拌混合物1小时，然后以80%的振幅超声处理5分钟，形成微乳液，其中有机材料的小液滴被水中的可聚合表面活性剂包围。
3. 将混合物在油浴中加热至 64 °C 在氯仿缓慢蒸发的过程中，引发交联剂和表面活性剂的聚合，形成由表面活性剂稳定的含DiO的纳米颗粒悬浮液。
4. 将纳米颗粒悬液通过0.2 µm注射器滤器过滤3次，以去除任何聚集物。将过滤后的纳米颗粒溶液于4 °C保存，待后续使用。
5. 通过EDC偶联将PEG-Chol与DiO-LCNP偶联。
   1. 溶解 Chol-PEG-NH₂·HCl（PEG-Chol，0.9 mM）溶于25 mM HEPES缓冲液（pH 7.0）中。
   2. 配制含有以下成分的工作液 N羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐（NHSS，40 mM）和盐酸1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺（EDC，400 mM）溶于HEPES缓冲液，由浓缩储备液配制。
   ....

结果

制备了液态结晶纳米颗粒（LCNPs），其纳米颗粒（NP）的疏水核心负载了一种典型的膜标记探针，以证明LCNP作为疏水性货物高效递送载体的实用性。为此，选择的货物是高度不溶于水的电位敏感性膜标记染料DiO。采用两相微乳液法制备了负载DiO的LCNPs（DiO-LCNPs），所用化学组分包括DACTP11、AC10COONa和DiO，如图 1¹⁸所示。在此NP体系中，结晶交联剂DACTP11形成的共价连接的聚合物网络构成了稳定的疏水核心，DiO即位于交联网络的间隙空间内。NP表面的羧酸根团可在水相介质中提供胶体稳定性，同时作为功能基团“把手”，用于连接细胞靶向配体（及其他生物分子）。为了将DiO-LCNPs锚定在质膜上，通过EDC偶联反应将胺端修饰的聚乙二醇化胆固醇分子（PEG-Chol）共价连接至LCNP表面（图 1）。在完成NP合成并确认生物偶联成功后，评估了DiO-LCNPs标记活细胞质膜的能力，以及相较于从本体溶液中直接递送的游离形式（DiO_.......

讨论

NMDD 的一个持续目标是实现药物制剂向细胞和组织的可控靶向递送，同时提高药物疗效。其中，疏水性药物/成像剂是一类面临重大挑战的药物分子，它们在水相介质中溶解度极低甚至完全不溶。这一问题长期阻碍了高效药物从 体外 细胞培养系统向临床应用的转化过程中，导致许多有前景的药物分子被“搁置”或放弃，未能进一步进入临床研究。例如，渥曼青霉素（Wtmn）是一种强效的磷脂酰肌醇3′激酶和磷脂酰肌醇3′激酶相关激酶抑制剂，具有良好的抗癌潜力，但因其水溶性差，阻碍了其在临床试验中的进一步推进。

最近，Karve 等 研究表明，当白桦脂醇（Wtmn）被制备为脂质-聚合物纳米颗粒（NP）组装体时，其水溶性得到显著改善¹⁹。此类以纳米颗粒形式实现的改进型、可控递送系统在多个领域具有应用潜力，尤其适用于将疏水性药物和成像剂递送至质膜。因此，本研究的目标是解决这一技术难题，并建立一种克服该技术瓶颈的方法学。

在开发该方法时，选择了一种模型膜靶向染料DiO，该染料在水相介质.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDCA）	ThermoFisher	E2247
3,3′-二十八烷基氧杂羰花青高氯酸盐（DiO）	Sigma Aldrich	D4292-20MG	有害；用DMSO配制储备液
胆固醇聚乙二醇胺盐酸盐	Nanocs, Inc.	PG2-AMCS-2k
Countess 自动细胞计数仪	ThermoFisher	C10227
二十八烷基-3,3,3′⁠,3′-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐（DiI）	Sigma Aldrich	468495-100MG	有害；用DMSO配制储备液
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	ThermoFisher	21063045	使用前于37 °C预热
杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）	ThermoFisher	14040182	使用前于37 °C预热
动态光散射仪	ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)
牛纤维连接蛋白，血浆来源	ThermoFisher	33010018	使用DPBS配制1 mg/ml储备液。包被MatTek培养皿时使用20–30 µg/ml，37 °C孵育2小时
甲醛（16%，W/V）	ThermoFisher	28906	有害；用DPBS稀释至4%
人胚胎肾细胞（HEK 293T/17）	美国模式培养物集存库	ATCC® CRL-11268™
活细胞成像溶液（LCIS）	ThermoFisher	A14291DJ	使用前于37 °C预热
MatTek 14 mm #1.0 盖玻片插件细胞培养皿	MatTek corporation	P35G-1.0-14-C
含25 mM HEPES的改良伊格尔培养基（DMEM）	ThermoFisher	21063045	使用前于37 °C预热
N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐（NHSS）	ThermoFisher	24510
Nikon A1si 光谱共聚焦显微镜	Nikon Instruments
台盼蓝染液（0.4%）	ThermoFisher	T10282	计数细胞前按50%比例与细胞悬液混合
Zeta电位仪	ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)
超声波处理器	Sonics and Materials Inc	GEX 600-5
迷你离心机	Benchmark	Mini-fuge-04477
PD-10 Sephadex™ G-25 Medium	GE Healthcare	17-0851-01
Bio-Rad ChemiDoc XRS 成像系统	Bio-RAD	76S/07434
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红	ThermoFisher	25200056