血管生成涉及多种细胞和多系统的相互作用，需要在生理相关的环境中进行研究。本研究的目的是展示大鼠肠系膜培养模型在血管生成过程中对完整的微血管网络进行延时比较的能力。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
血管生成是指从已有血管中生长出新血管的过程，涉及内皮细胞、周细胞、平滑肌细胞、免疫细胞，并与淋巴管和神经协同作用。多种细胞和多系统的相互作用要求在生理相关环境中对血管生成进行研究。因此，尽管使用 体外 细胞培养模型虽已提供了一些机制性见解，但常被批评其无法重现与微血管网络相关的复杂性。本实验方案的目的是展示在培养的大鼠肠系膜组织中，于血管生成刺激前后对完整微血管网络进行延时比较的能力。所培养的组织包含维持其层级结构的微血管网络。免疫组织化学标记证实了内皮细胞、平滑肌细胞、周细胞、血管及淋巴管的存在。此外，使用BSI- lectin对组织进行标记，可实现血清或生长因子刺激前后局部网络区域的延时比较，表现为毛细血管出芽增加和血管密度升高。与常见的细胞培养模型相比，该方法为在生理相关性的微血管网络中开展内皮细胞谱系研究及组织特异性促血管生成药物评价提供了有效工具。 关键词：细胞培养模型，微血管网络，血管生成，大鼠肠系膜，延时成像，免疫组织化学，BSI-lectin，内皮细胞，周细胞，平滑肌细胞，淋巴管
引言
微血管网络的生长与重塑是组织功能、伤口愈合及多种病理过程的共同基础，也是关键的生物学过程 是血管生成，定义为从已有血管中生长出新血管的过程1,2对于组织工程中新生血管的构建或血管生成相关疗法的设计，理解血管生成过程中细胞动态变化的重要性至关重要。然而，这一过程十分复杂，可在微血管网络的特定位置表现出差异，并涉及多种细胞类型即 内皮细胞、平滑肌细胞、周细胞、巨噬细胞、干细胞）以及多种系统（淋巴网络和神经网络）。尽管 体外 模型在研究血管生成过程中不同细胞间相互关系方面发挥了巨大作用3，由于其复杂性有限且不能紧密模拟真实生理环境，其生理相关性可能受到影响 体内 情境。为了克服这些局限性，三维培养系统3, 离体 组织模型4，微流控系统5,6和计算模型7 近年来已开发并引入了多种模型。然而，仍需要一种具备延时成像能力的模型，以研究完整微血管网络中的血管生成过程 离体建立具有如此复杂程度的新型延时成像模型，将为理解调控血管....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有动物实验和操作均经杜兰大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。
1. 手术操作设置
- 手术前对器械、手术用品和培养用品进行高压灭菌。每只大鼠的手术用品包括：1 块手术巾、1 块中央带有预切孔（0.5 英寸 × 1.5 英寸）的手术巾、纱布垫和 1 块吸水性垫巾。手术器械包括：1 把带编号 10 刀片的手术刀、2 把镊子和 1 把精细剪刀。培养用品包括：1 块手术巾、1 把镊子，以及带有聚碳酸酯滤膜的预置 6 孔板插入物。
- 使用 70% 乙醇对有机玻璃平台、手术台和手术台面区域进行消毒。将手术台置于无菌容器中，直至使用。
- 通过在 100 mm 培养皿中心钻一个约 2 英寸 × 1 英寸的孔来制作手术台。接着使用砂纸打磨任何锋利的边缘，并在孔的边缘涂上一层硅胶，以形成用于组织支撑的隆起表面。
- 或者，可使用 CAD 软件设计手术台，并通过 3D 打印制作（图 1）。
- 铺上一块无菌吸水垫巾，并在其上方放置有机玻璃平台。将无预切孔的手术巾放置在靠近吸水垫巾的加热垫上。
- 将无菌磷酸盐缓冲液（PBS）、培养基和生理盐水预热至 37 °C。将培养基和 PBS 分别置于加热垫上的培养皿中，将生理盐水置于 50 mL 圆锥形管中，放置在手术装置旁。
- 确保所有包装在手术开始前均已....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
培养3天后，使用活/死细胞活力/细胞毒性检测试剂盒对组织进行标记，以显示大鼠肠系膜培养模型中微血管的活力（图2A）。培养物中大部分存在于肠系膜的细胞保持存活状态，并根据其位于微血管节段的位置鉴定出内皮细胞。内皮细胞的增殖也通过凝集素/BrdU标记得到证实（图 2D）。通过NG2标记确认了血管周围平滑肌细胞和周细胞的存在（图2B）。LYVE1 和 PECAM 的标记鉴定出分支状的淋巴管和血液微血管网络，并证实了淋巴管结构的维持 与 血液内皮细胞表型（图2C).
通过在不同时间点使用 BSI-凝集素标记微血管网络，并对网络中的相同区域进行随时间推移的成像，利用了该模型的时间推移功能；此功能对于研究组织特异性的血管生成反应尤为有价值。在培养基中添加10%血清后，经过3天刺激即引发显著的血管生成反应。此外，在.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本方案记录了一种利用大鼠肠系膜培养模型的方法作为 离体 用于微血管网络生长的延时成像工具。我们实验室先前的研究已确立了本模型在以下方面的应用：1）血管生成8，2）淋巴管生成83）周细胞-内皮细胞相互作用8，以及4）抗血管生成药物测试9对培养的大鼠肠系膜组织进行多时间点成像的能力，为定量评估组织特异性生长反应以及追踪不同促血管生成刺激下细胞间的相互作用提供了有效的方法。血管生成过程中内皮细胞增殖增加以及周细胞的存在，与我们先前的研究结果一致8 并在培养的大鼠肠系膜组织中验证血管生成过程中多种细胞类型之间的动态相互作用。
与常用的组织培养模型相比 体外 细胞培养系统中，大鼠肠系膜培养模型具有独特性，因为其生长发生于一个完整且真实的微血管网络内部。相比之下，主动脉环实验则是为了研究主动脉节段在胶原凝胶中发生血管生成性.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究工作得到了美国国立卫生研究院资助项目5-P20GM103629（授予WLM）以及杜兰大学衰老研究中心的支持。我们感谢Matthew Nice在编辑实验方案文本过程中提供的帮助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 手术巾 | Cardinal Health | 4012 | 12” x 12” Bio-Shield 常规灭菌包装 |
| 手术刀柄 | Roboz Surgical Instrument | RS-9843 | 手术刀柄，#3；实心；4" 长度 |
| 无菌手术刀片 | Cincinnati Surgical | 0110 | 不锈钢；10号规格 |
| 培养皿（60 mm） | Thermo Scientific | 130181 | 每 sleeve 10 个 |
| 格拉费镊（弯头镊子） | Roboz Surgical Instrument | RS-5135 | 显微解剖镊；带齿；轻微弯曲；尖端宽度 0.8 mm；4" 长度 |
| 格拉费镊（直头镊子） | Roboz Surgical Instrument | RS-5130 | 显微解剖镊；带齿，直头；尖端宽度 0.8 mm；4" 长度 |
| 诺伊斯微型剪刀 | Roboz Surgical Instrument | RS-5677 | 诺伊斯微型解剖弹簧剪刀； 直头，尖钝端；切割刃长 13 mm；尖端宽度 0.25 mm，总长度 4 1/2" |
| 纱布垫 | FisherBrand | 13-761-52 | 非无菌棉质纱布海绵；4" x 4"，12层 |
| 棉签 | FisherBrand | 23-400-124 | 长度 6"；木质杆；仅限一次性使用 |
| 6孔板 | Fisher Scientific | 08-772-49 | 平底，低蒸发盖；聚苯乙烯；无热原 |
| 5 mL 无菌注射器 | Fisher Scientific | 14-829-45 | 鲁尔锁接头 |
| 无菌碗 | Medical Action Industries Inc. | 01232 | 32 oz. 剥离袋；蓝色；无菌一次性使用 |
| 6孔板插件（CellCrown 插件） | SIGMA | Z681792-3EA | 6孔板插件；非无菌 |
| 聚碳酸酯滤膜 | SIGMA | TMTP04700 | Isopore 膜滤器；聚碳酸酯；亲水性；5.0 µm，47 mm，白色无纹 |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注/描述 |
| Beuthanasia | Schering-Plough Animal Health Corp. Union（通过 MWI Veterinary Supply 订购） | MWI #: 011168 | 活性成分：每 100 mL 含戊巴比妥钠 390 mg，苯妥英钠 50 mg |
| 氯胺酮 | Fort Dodge Animal Health（通过 MWI Veterinary Supply 订购） | MWI #: 000680 | Kateset 100 mg/mL |
| 赛拉嗪 | LLOYD. Inc.（通过 MWI Veterinary Supply 订购） | MWI #: 000680 | Anased 100 mg/mL |
| 生理盐水 | Baxter | 2F7122 | |
| PBS | Invitrogen | 14040-133 | |
| MEM | Invitrogen | 11095080 | |
| 青霉素-链霉素（PenStrep） | Invitrogen | 15140-122 | |
| 胎牛血清（FBS） | Invitrogen | 16000-044 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| 皂苷 | SIGMA | S7900-100G | |
| 异丙醇 | Fisher Scientific | S25372 | |
| 聚维酮碘 | Operand | 82-226 | |
| 盐酸 | SIGMA | 320331 | |
| 甲醇 | Fisher Scientific | 67-56-1 | |
| 甘油 | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| 异硫氰酸荧光素标记凝集素（FITC-conjugated Lectin） | SIGMA | L9381-2MG | |
| 抗 NG2 硫酸软骨素蛋白聚糖抗体 | SIGMA | AB5320 | |
| PECAM（CD31）抗体 | BD Biosciences | 555026 | |
| LYVE-1 抗体 | AngioBio Co. | 11-034 | |
| 山羊抗兔 Cy2 标记抗体 | Jackson ImmunoResearch | 111-585-144 | |
| 山羊抗小鼠 Cy3 标记抗体 | Jackson ImmunoResearch | 115-227-003 | |
| 链霉亲和素 Cy3 标记抗体 | Jackson ImmunoResearch | 016-160-084 | |
| 活/死细胞活力/细胞毒性检测试剂盒（Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit） | Invitrogen | L3224 | |
| 正常山羊血清 | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| 5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU） | SIGMA | B5002 | |
| 单克隆小鼠抗溴脱氧尿苷抗体，克隆 Bu20a | Dako | M074401-8 | |
| 小鼠抗大鼠 CD11b 抗体 | AbD Serotec | MCA275R |
参考文献
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature. 407 (6801), 249-257 (2000).
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
- Kaunas, R., Kang, H., Bayless, K. J.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
