血管生成涉及多种细胞和多系统的相互作用，需要在生理相关的环境中进行研究。本研究的目的是展示大鼠肠系膜培养模型在血管生成过程中对完整的微血管网络进行延时比较的能力。
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摘要
摘要
血管生成是指从已有血管中生长出新血管的过程，涉及内皮细胞、周细胞、平滑肌细胞、免疫细胞，并与淋巴管和神经协同作用。多种细胞和多系统的相互作用要求在生理相关环境中对血管生成进行研究。因此，尽管使用 体外 细胞培养模型虽已提供了一些机制性见解，但常被批评其无法重现与微血管网络相关的复杂性。本实验方案的目的是展示在培养的大鼠肠系膜组织中，于血管生成刺激前后对完整微血管网络进行延时比较的能力。所培养的组织包含维持其层级结构的微血管网络。免疫组织化学标记证实了内皮细胞、平滑肌细胞、周细胞、血管及淋巴管的存在。此外，使用BSI- lectin对组织进行标记，可实现血清或生长因子刺激前后局部网络区域的延时比较，表现为毛细血管出芽增加和血管密度升高。与常见的细胞培养模型相比，该方法为在生理相关性的微血管网络中开展内皮细胞谱系研究及组织特异性促血管生成药物评价提供了有效工具。 关键词：细胞培养模型，微血管网络，血管生成，大鼠肠系膜，延时成像，免疫组织化学，BSI-lectin，内皮细胞，周细胞，平滑肌细胞，淋巴管
引言
微血管网络的生长与重塑是组织功能、伤口愈合及多种病理过程的共同基础，也是关键的生物学过程 是血管生成，定义为从已有血管中生长出新血管的过程1,2对于组织工程中新生血管的构建或血管生成相关疗法的设计，理解血管生成过程中细胞动态变化的重要性至关重要。然而，这一过程十分复杂，可在微血管网络的特定位置表现出差异，并涉及多种细胞类型即 内皮细胞、平滑肌细胞、周细胞、巨噬细胞、干细胞）以及多种系统（淋巴网络和神经网络）。尽管 体外 模型在研究血管生成过程中不同细胞间相互关系方面发挥了巨大作用3，由于其复杂性有限且不能紧密模拟真实生理环境，其生理相关性可能受到影响 体内 情境。为了克服这些局限性，三维培养系统3, 离体 组织模型4，微流控系统5,6和计算模型7 近年来已开发并引入了多种模型。然而，仍需要一种具备延时成像能力的模型，以研究完整微血管网络中的血管生成过程 离体建立具有如此复杂程度的新型延时成像模型，将为理解调控血管生成的潜在机制以及改进相关治疗方案提供一种极为宝贵的工具。
一种可用于在完整微血管网络中进行血管生成ex vivo研究的潜在模型是大鼠肠系膜培养模型8。在近期的研究中，我们已证明血液和淋巴微血管网络在培养后仍保持活性。更重要的是，大鼠肠系膜培养模型可用于研究功能性周细胞-内皮细胞相互作用、血液与淋巴内皮细胞连接，以及延时成像。本文旨在提供我们关于延时成像方法的实验方案。我们的代表性结果记录了在血清刺激血管生成后仍保持活性的多种细胞类型，并展示了该方法在定量组织特异性血管生成反应以及内皮细胞示踪研究中的应用实例。
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方案
所有动物实验和操作均经杜兰大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。
1. 手术操作设置
- 手术前对器械、手术用品和培养用品进行高压灭菌。每只大鼠的手术用品包括：1 块手术巾、1 块中央带有预切孔（0.5 英寸 × 1.5 英寸）的手术巾、纱布垫和 1 块吸水性垫巾。手术器械包括：1 把带编号 10 刀片的手术刀、2 把镊子和 1 把精细剪刀。培养用品包括：1 块手术巾、1 把镊子，以及带有聚碳酸酯滤膜的预置 6 孔板插入物。
- 使用 70% 乙醇对有机玻璃平台、手术台和手术台面区域进行消毒。将手术台置于无菌容器中，直至使用。
- 通过在 100 mm 培养皿中心钻一个约 2 英寸 × 1 英寸的孔来制作手术台。接着使用砂纸打磨任何锋利的边缘，并在孔的边缘涂上一层硅胶，以形成用于组织支撑的隆起表面。
- 或者，可使用 CAD 软件设计手术台，并通过 3D 打印制作（图 1）。
- 铺上一块无菌吸水垫巾，并在其上方放置有机玻璃平台。将无预切孔的手术巾放置在靠近吸水垫巾的加热垫上。
- 将无菌磷酸盐缓冲液（PBS）、培养基和生理盐水预热至 37 °C。将培养基和 PBS 分别置于加热垫上的培养皿中，将生理盐水置于 50 mL 圆锥形管中，放置在手术装置旁。
- 确保所有包装在手术开始前均已打开，以保证所有材料的无菌操作。本实验中常用工具的完整清单见特定手术材料与工具表。
2. 肠系膜组织的采集
- 使用成年雄性Wistar大鼠（350 ± 25 g；6–8周龄）。也可选用其他品系和年龄的大鼠。
- 麻醉大鼠 通过 腹腔注射氯胺酮（80 mg/kg 体重）和赛拉嗪（8 mg/kg 体重）。通过轻捏足趾间部位检查大鼠是否存在反射反应，以确认麻醉状态；此时应无反射反应。 该终末操作程序无需进行预先镇痛。
- 剃除腹部区域的毛发，并使用脱毛膏清除残留的毛发。用70%异丙醇擦拭腹部皮肤两次，随后使用聚维酮碘进行擦拭。擦拭时，手术者应从手术区域中心开始，以环形方式向外移动，避免用同一块无菌纱布或无菌棉签重复擦拭已清洁过的区域。然后将动物转移至无菌手术装置，并放置在聚甲基丙烯酸甲酯（plexiglass）平台上。
- 使用手术刀片，在胸骨下方约2.54 cm处开始，于肠道上做一1.91–3.18 cm的切口。注意避免刺破肠管或肠系膜（需切开一层皮肤、一层结缔组织和一层肌肉）。
- 在切口上覆盖带有预切孔洞的手术巾，并将无菌手术台置于手术巾上方。确保开口与切口对齐。使用无菌棉签定位回肠，并通过手术台的开口将其轻轻拉出。
- 使用棉签轻轻将6至8个肠系膜窗拉过载物台，注意不要触碰肠系膜窗图1）。通常从小肠的回肠区域开始取材，位置靠近盲肠。必要时，使用无菌注射器滴加温热的无菌生理盐水，以保持暴露组织的湿润。
- 处死大鼠 通过 经心脏注射戊巴比妥钠（每只大鼠0.2 mL）。在取下肠系膜窗之前，需通过触诊心脏确认大鼠已安乐死；应无脉搏。
- 使用镊子夹住脂肪垫，用精细剪刀剪除目标肠系膜组织，留出约2 mm的脂肪边缘。组织先后用预热的无菌PBS和培养基各清洗一次。
- 将外置的回肠还纳至腹腔，并根据机构指南处理动物。
3. 用于延时研究的肠系膜组织培养
- 将已灭菌的培养用品（见第1.1节）和组织转移至无菌超净工作台中。
- 使用镊子将每块组织置于聚碳酸酯滤膜上。抓取组织时应捏住脂肪垫，以避免损伤血管系统。
- 利用脂肪垫迅速铺展组织，注意不要触碰滤膜窗口。将带有组织的滤膜插件倒置放入6孔板底部，并加入3 mL培养基（图1）。该实验常用的培养基包括添加1%青霉素-链霉素（PenStrep）和10%胎牛血清（FBS）的最低必需培养基（MEM）。可根据需要在培养基中添加其他血清和/或生长因子以促进血管生成。
- 对每块组织重复步骤3.2–3.3，在标准培养箱条件（5% CO2，37 °C）下培养最多5天。
4. 肠系膜组织的延时成像
- 成像当天，向每孔培养基中添加偶联的BSI-Lectin，在标准培养条件下孵育30分钟。用不含凝集素的培养基洗涤组织两次。BSI-Lectin染色在培养期间可在肠系膜组织上保持可见达3天。
- 将培养板转移至显微镜载物台上。根据血管和淋巴管的形态学特征及网络结构，区分血流管与淋巴管。
- 在每份组织上定位目标网络区域并采集图像。记录成像位置，以确保后续成像时能捕获相同区域。若使用电动载物台，需记录坐标信息。
- 将组织放回培养箱继续培养，直至达到预定实验终点。根据实验所需的时间点，重复步骤4.1–4.3。
5. 组织免疫标记
- BSI-凝集素标记
- 将组织在37 °C下与1:40的FITC标记凝集素溶液（每孔2.5 mL抗体溶液，置于6孔板中）孵育30分钟，随后用培养基清洗两次。每次清洗时，加入培养基后立即更换。
- 活/死细胞标记
- 将组织在37 °C下与1:500稀释的2 mM乙啶均聚物-1和1:500稀释的1 mM钙黄绿素AM溶液（每孔2.5 mL抗体溶液，置于6孔板中）孵育10分钟，随后用培养基清洗两次。
- BSI-凝集素/NG2标记
- 将组织铺展于显微镜载玻片上（每片1–2个组织），使其自然干燥。用手术刀用力按压以切除多余脂肪组织。
- 将组织在-20 °C的冷甲醇中固定30分钟，随后用PBS洗涤（每次10分钟，共3次）。
- 一抗标记：将组织在室温下与1:100稀释的兔多克隆NG2抗体和5%正常山羊血清（NGS）孵育1小时，随后用PBS洗涤（每次10分钟，共3次）。
- 二抗标记：将组织在室温下与1:100稀释的CY2标记山羊抗兔抗体（GAR-CY2）和5% NGS孵育1小时，随后用PBS洗涤（每次10分钟，共3次）。
- 将组织在室温下与1:40稀释的FITC标记凝集素PBS溶液孵育30分钟，随后用PBS清洗两次。每次清洗时，加入PBS后立即更换。
- 封片：用体积比为50:50的PBS与甘油混合液覆盖组织，盖上盖玻片，用指甲油密封载玻片边缘。
- LYVE-1/PECAM标记
- 将组织铺展于显微镜载玻片上（每片1–2个组织），使其自然干燥。用手术刀用力按压以切除多余脂肪组织。
- 将组织在-20 °C的冷甲醇中固定30分钟，随后用含0.1%皂苷的PBS洗涤（每次10分钟，共3次）。
- 一抗标记：将组织在室温下与1:200稀释的鼠单克隆生物素化CD31抗体和1:100稀释的兔多克隆LYVE-1抗体，溶于含0.1%皂苷、2%牛血清白蛋白（BSA）和5% NGS的PBS中，孵育1小时，随后用含0.1%皂苷的PBS洗涤（每次10分钟，共3次）。
- 二抗标记：将组织在室温下与1:500稀释的CY3标记链霉亲和素抗体和1:100稀释的GAR-CY2抗体，溶于含0.1%皂苷、2% BSA和5% NGS的PBS中，孵育1小时，随后用含0.1%皂苷的PBS洗涤（每次10分钟，共3次）。
- 封片：用体积比为50:50的PBS与甘油混合液覆盖组织，盖上盖玻片，用指甲油密封载玻片边缘。
- BrdU/BSI-凝集素标记
- 向培养基中加入终浓度为1 mg/mL的BrdU，并用该溶液替换组织培养基，在37 °C孵育2小时。
- 将组织铺展于显微镜载玻片上（每片1–2个组织），使其自然干燥。用手术刀用力按压以切除多余脂肪组织。
- 将组织在-20 °C的冷甲醇中固定30分钟，随后用PBS洗涤（每次10分钟，共3次）。
- 将组织在37 °C下用2 M HCl处理1小时以变性DNA，随后用含0.1%皂苷的PBS洗涤（每次10分钟，共3次）。
- 一抗标记：将组织在室温下与1:100稀释的单克隆鼠抗BrdU抗体，溶于含0.1%皂苷、2% BSA和5% NGS的PBS中，孵育1小时，随后用含0.1%皂苷的PBS洗涤（每次10分钟，共3次）。
- 二抗标记：将组织在室温下与1:100稀释的Cy3标记山羊抗鼠抗体（GAM-Cy3），溶于含0.1%皂苷、2% BSA和5% NGS的PBS中，孵育1小时，随后用含0.1%皂苷的PBS洗涤（每次10分钟，共3次）。
- 将组织在室温下与1:40稀释的FITC标记凝集素PBS溶液孵育30分钟，随后用PBS清洗两次。
- 封片：用体积比为50:50的PBS与甘油混合液覆盖组织，盖上盖玻片，用指甲油密封载玻片边缘。
- BSI-凝集素/CD11b标记
- 将组织铺展于显微镜载玻片上（每片1–2个组织），使其自然干燥。用手术刀用力按压以切除多余脂肪组织。
- 将组织在-20 °C的冷甲醇中固定30分钟，随后用含0.1%皂苷的PBS洗涤（每次10分钟，共3次）。
- 一抗标记：将组织在室温下与1:100稀释的鼠抗大鼠CD11b抗体，溶于含0.1%皂苷、2% BSA和5% NGS的PBS中，孵育1小时，随后用含0.1%皂苷的PBS洗涤（每次10分钟，共3次）。
- 二抗标记：将组织在室温下与1:100稀释的GAM-Cy3抗体，溶于含0.1%皂苷、2% BSA和5% NGS的PBS中，孵育1小时，随后用含0.1%皂苷的PBS洗涤（每次10分钟，共3次）。
- 将组织在室温下与1:40稀释的FITC标记凝集素PBS溶液孵育30分钟，随后用PBS清洗两次。
- 封片：用体积比为50:50的PBS与甘油混合液覆盖组织，盖上盖玻片，用指甲油密封载玻片边缘。
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结果
培养3天后，使用活/死细胞活力/细胞毒性检测试剂盒对组织进行标记，以显示大鼠肠系膜培养模型中微血管的活力（图2A）。培养物中大部分存在于肠系膜的细胞保持存活状态，并根据其位于微血管节段的位置鉴定出内皮细胞。内皮细胞的增殖也通过凝集素/BrdU标记得到证实（图 2D）。通过NG2标记确认了血管周围平滑肌细胞和周细胞的存在（图2B）。LYVE1 和 PECAM 的标记鉴定出分支状的淋巴管和血液微血管网络，并证实了淋巴管结构的维持 与 血液内皮细胞表型（图2C).
通过在不同时间点使用 BSI-凝集素标记微血管网络，并对网络中的相同区域进行随时间推移的成像，利用了该模型的时间推移功能；此功能对于研究组织特异性的血管生成反应尤为有价值。在培养基中添加10%血清后，经过3天刺激即引发显著的血管生成反应。此外，在...
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讨论
本方案记录了一种利用大鼠肠系膜培养模型的方法作为 离体 用于微血管网络生长的延时成像工具。我们实验室先前的研究已确立了本模型在以下方面的应用：1）血管生成8，2）淋巴管生成83）周细胞-内皮细胞相互作用8，以及4）抗血管生成药物测试9对培养的大鼠肠系膜组织进行多时间点成像的能力，为定量评估组织特异性生长反应以及追踪不同促血管生成刺激下细胞间的相互作用提供了有效的方法。血管生成过程中内皮细胞增殖增加以及周细胞的存在，与我们先前的研究结果一致8 并在培养的大鼠肠系膜组织中验证血管生成过程中多种细胞类型之间的动态相互作用。
与常用的组织培养模型相比 体外 细胞培养系统中，大鼠肠系膜培养模型具有独特性，因为其生长发生于一个完整且真实的微血管网络内部。相比之下，主动脉环实验则是为了研究主动脉节段在胶原凝胶中发生血管生成性...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究工作得到了美国国立卫生研究院资助项目5-P20GM103629（授予WLM）以及杜兰大学衰老研究中心的支持。我们感谢Matthew Nice在编辑实验方案文本过程中提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 手术巾 | Cardinal Health | 4012 | 12” x 12” Bio-Shield 常规灭菌包装 |
| 手术刀柄 | Roboz Surgical Instrument | RS-9843 | 手术刀柄，#3；实心；4" 长度 |
| 无菌手术刀片 | Cincinnati Surgical | 0110 | 不锈钢；10号规格 |
| 培养皿（60 mm） | Thermo Scientific | 130181 | 每 sleeve 10 个 |
| 格拉费镊（弯头镊子） | Roboz Surgical Instrument | RS-5135 | 显微解剖镊；带齿；轻微弯曲；尖端宽度 0.8 mm；4" 长度 |
| 格拉费镊（直头镊子） | Roboz Surgical Instrument | RS-5130 | 显微解剖镊；带齿，直头；尖端宽度 0.8 mm；4" 长度 |
| 诺伊斯微型剪刀 | Roboz Surgical Instrument | RS-5677 | 诺伊斯微型解剖弹簧剪刀； 直头，尖钝端；切割刃长 13 mm；尖端宽度 0.25 mm，总长度 4 1/2" |
| 纱布垫 | FisherBrand | 13-761-52 | 非无菌棉质纱布海绵；4" x 4"，12层 |
| 棉签 | FisherBrand | 23-400-124 | 长度 6"；木质杆；仅限一次性使用 |
| 6孔板 | Fisher Scientific | 08-772-49 | 平底，低蒸发盖；聚苯乙烯；无热原 |
| 5 mL 无菌注射器 | Fisher Scientific | 14-829-45 | 鲁尔锁接头 |
| 无菌碗 | Medical Action Industries Inc. | 01232 | 32 oz. 剥离袋；蓝色；无菌一次性使用 |
| 6孔板插件（CellCrown 插件） | SIGMA | Z681792-3EA | 6孔板插件；非无菌 |
| 聚碳酸酯滤膜 | SIGMA | TMTP04700 | Isopore 膜滤器；聚碳酸酯；亲水性；5.0 µm，47 mm，白色无纹 |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注/描述 |
| Beuthanasia | Schering-Plough Animal Health Corp. Union（通过 MWI Veterinary Supply 订购） | MWI #: 011168 | 活性成分：每 100 mL 含戊巴比妥钠 390 mg，苯妥英钠 50 mg |
| 氯胺酮 | Fort Dodge Animal Health（通过 MWI Veterinary Supply 订购） | MWI #: 000680 | Kateset 100 mg/mL |
| 赛拉嗪 | LLOYD. Inc.（通过 MWI Veterinary Supply 订购） | MWI #: 000680 | Anased 100 mg/mL |
| 生理盐水 | Baxter | 2F7122 | |
| PBS | Invitrogen | 14040-133 | |
| MEM | Invitrogen | 11095080 | |
| 青霉素-链霉素（PenStrep） | Invitrogen | 15140-122 | |
| 胎牛血清（FBS） | Invitrogen | 16000-044 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| 皂苷 | SIGMA | S7900-100G | |
| 异丙醇 | Fisher Scientific | S25372 | |
| 聚维酮碘 | Operand | 82-226 | |
| 盐酸 | SIGMA | 320331 | |
| 甲醇 | Fisher Scientific | 67-56-1 | |
| 甘油 | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| 异硫氰酸荧光素标记凝集素（FITC-conjugated Lectin） | SIGMA | L9381-2MG | |
| 抗 NG2 硫酸软骨素蛋白聚糖抗体 | SIGMA | AB5320 | |
| PECAM（CD31）抗体 | BD Biosciences | 555026 | |
| LYVE-1 抗体 | AngioBio Co. | 11-034 | |
| 山羊抗兔 Cy2 标记抗体 | Jackson ImmunoResearch | 111-585-144 | |
| 山羊抗小鼠 Cy3 标记抗体 | Jackson ImmunoResearch | 115-227-003 | |
| 链霉亲和素 Cy3 标记抗体 | Jackson ImmunoResearch | 016-160-084 | |
| 活/死细胞活力/细胞毒性检测试剂盒（Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit） | Invitrogen | L3224 | |
| 正常山羊血清 | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| 5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU） | SIGMA | B5002 | |
| 单克隆小鼠抗溴脱氧尿苷抗体，克隆 Bu20a | Dako | M074401-8 | |
| 小鼠抗大鼠 CD11b 抗体 | AbD Serotec | MCA275R |
参考文献
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