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方法文章

使用生物正交化学进行预靶向的99mTc标记三齿螯合物的制备与评价

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DOI：

10.3791/55188

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2017年2月4日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Chemical Biology, McMaster University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于前靶向和生物正交化学的三齿99mTc(I)螯合物-四嗪衍生物的放射性标记及体内测试方案。

摘要

预靶向结合生物正交化学正成为开发新型放射性药物的有效策略。在现有方法中，放射性标记的四嗪与 转反式环辛烯（TCO）与生物分子连接已被证明是一种高效且生物正交的成像特定生物靶点的方法。尽管锝-99m 仍是诊断核医学中最广泛使用的同位素，但目前可用于制备 99m锝标记的四嗪。本文报道了一类三齿螯合-四嗪衍生物及其锝(I)配合物的制备。这些此前未知的化合物被放射性标记为 99mTc 通过微波辅助法以31%至83%的放射化学产率制备。产物在生理盐水和PBS中稳定，并能快速与TCO衍生物反应。 体外。它们的 体内 通过使用定位于活跃骨代谢或损伤区域的四嗪-双膦酸盐（TCO-BP）衍生物，证明了预靶向能力。在小鼠研究中， 99mTc-四嗪在膝关节和肩关节中显示出高活性浓度，而在不存在TCO-BP的实验中未观察到该现象。非靶器官的总体摄取情况及药代动力学因连接子的性质和螯合物的极性不同而存在显著差异。

引言

99m锝-99m 仍是诊断核医学中使用最广泛的放射性同位素，全球每年进行的显像检查超过5000万例。1,2,3. 大部分 99m临床上使用的锝（Tc）药物属于灌注型放射性药物。目前仅有少数几种为活性靶向化合物，其中 99mTc通过与靶向构建体连接而被引导至特异性生物标志物。靶向构建体的制备 99mTc放射性药物常受到以下因素的影响： 99m靶向分子与生物标志物结合能力可能受到锝-配体复合物的影响，或者同位素的半衰期不足以适用于抗体等分子量较高的生物分子。后者通常需要数天时间才能获得图像，以便使生物分子从非靶组织中清除。预靶向技术为此提供了一种替代策略以克服这些挑战。

预靶向策略结合生物正交化学已被证明是开发新型分子成像探针的有效方法，适用于荧光成像和放射性成像4,5,6,7,8。如图1所示，1,2,4,5-四嗪（Tz）与反式-环辛烯（TCO）衍生物之间的逆电子需求狄尔斯-阿尔德（IEDDA）反应已被证明尤为高效6。该反应在磷酸盐缓冲液（PBS）中具有快速的动力学特征（k2 ≈ 6,000 M-1 s-1）和高选择性，因此非常适用于体内预靶向应用9,10。

最常用的方法是先给予一种由TCO衍生的靶向载体，经过足够的延迟时间后，再给予放射性标记的四嗪。基于放射性标记四嗪的 11C, 18F, 64铜， 89Zr，和 111已有报道11,12,13,14,15相比之下，仅有一份关于 99m使用HYNIC类配体标记的Tc-Tz，该标记过程需加入共配体以防止蛋白质结合与降解 体内16. 作为替代方法，本文报道了 99m使用一类可与[Tc(I)形成稳定三齿配合物的配体对四嗪进行Tc(I)标记99mTc(CO)3]+ 核心

化学反应示意图；叠氮-炔烃环加成，氮气释放。
图1：四嗪与 转-cyclooctene 请点击此处以查看此图的放大版本。

所制备的配体家族包含三齿螯合物，其极性以及金属结合区域与Tz之间的连接基团性质各不相同图2目标是鉴定出一个 99m可有效定位于并反应于 TCO 标记位点的 Tc-四嗪探针 体内 且在未结合时能快速清除，以获得较高的靶标与非靶标比值。为测试配体，使用了一种双膦酸盐的反式环辛烯衍生物（TCO-BP）17我们先前已证明，TCO-BP 可定位于骨代谢活跃区域，并能与放射性标记的四嗪发生反应。 体内18它是一种用于测试新型四嗪的便捷试剂，因其可通过单步合成制备，且可在正常小鼠体内进行实验，其定位主要发生在关节（膝关节和肩关节）。

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方案

动物实验已获得麦克马斯特大学动物研究伦理委员会的批准，符合加拿大动物护理委员会（CCAC）的指南要求。

1. 使用99mTc对Tz-三齿配体进行放射性标记

警告：以下实验步骤涉及放射性化合物的使用。操作仅可在取得许可的实验室中进行，并须严格遵守安全操作与废物处理的相关规定。微波反应必须使用专为化学合成设计的微波反应仪进行。

  1. [的合成99mTc(CO)3(H2O3]+ 19,20
    1. 在微波反应管中，加入 8 mg K2[苯并羟基3CO2]，15 mg Na2CO3，20 mg Na2B4O7·10H2O 和 25 mg KOCO[CH(OH)]2COONa·4H2O. 用氩气吹扫小瓶10分钟。
    2. 加入 4 mL 的 99mTcO4- (~1,100 MBq, ~30 mCi) 的生理盐水加入小瓶中。
    3. 在微波炉中加热反应 3.5 分钟 110 °C 搅拌10秒以确保试剂充分混匀。
    4. 将溶液的 pH 值调节至 3.5–4，使用约 ~400 μL 1 M HCl。使用pH试纸验证。
  2. 四嗪配体1-5的放射性标记
    1. 溶解每种配体（化合物）2 mg 1-5) 在 250 μL MeOH21.
    2. 添加 250 μL 的 [99mTc(CO)3(H2O3]+ （约74 MBq，约2 mCi）加入各溶液中。
    3. 使用微波加热反应混合物，20 分钟，温度为 60 °C.
      注意：此步骤对全部5种四嗪化合物均相同。
    4. 对于化合物 2- 5，蒸发溶剂，并将所得产物重新溶解于1 mL体积比为1:1的二氯甲烷:三氟乙酸（DCM:TFA）中。
    5. 加热溶解的反应产物（2-5) 在 60 °C 在微波炉中加热 6 分钟（2-4）或 10 分钟（5).
    6. 冷却至室温后，使用蒸发仪蒸发溶剂（36 °C，8 mbar，3 分钟，6,000 rpm）并将干燥的化合物溶解于 1:1 ACN:H2O 或 1:1 甲醇:H2O，在HPLC纯化之前。
    7. 纯化 99mTc标记的化合物（1-5)，包括使用高效液相色谱法（HPLC，C18 反相）。通常使用 30:70 乙腈：水的洗脱梯度2O（均含0.1% TFA）调整为40:60乙腈:水2O 超过 20 分钟（18 分钟）和 C18 分析型色谱柱，4.6 x 100 mm。同时使用紫外检测（254 nm）和γ射线检测。
      1. 取每种标记产物的少量样品，将其HPLC保留时间与共同进样的非放射性Re标记标准品（0.125 mg溶于20%甲醇-H₂O）的保留时间进行比较2O）。在紫外HPLC图谱中鉴定重新标记的标准品，其洗脱时间与原标准品相同 99mγ-HPLC 谱图中 Tc 标记化合物的共注射。该共注射在相近的保留时间出现峰，证实了二者的一致性 99mTc标记化合物
    8. 使用蒸发仪将高效液相色谱（HPLC）组分中的溶剂蒸发除去36 °C，8 mbar，3 min，6,000 rpm。
    9. 将纯化后的化合物配制成浓度为 7.4 kBq/µL 在含0.5% BSA和0.01% Tween-80的PBS中。
    10. 为确保标记化合物的稳定性，需进行以下操作 体外 稳定性研究。将配制好的化合物在 37 °C 分别在1、4和6小时，每次向HPLC注入少量（3.7 MBq）混合物以评估其稳定性。

2. 预靶向生物分布研究

  1. 动物准备
    1. 使用7-9周龄的雌性Balb/c小鼠（n=3），通过尾静脉注射给予用生理盐水配制的TCO-BP（20 mg/kg）（5 μg/μL）。
    2. 将小鼠置于物理固定装置中，识别位于尾部侧面的静脉，并用酒精棉片擦拭。在距尾端约2 cm处，以浅角度平行于静脉插入30号针头。缓慢推动注射器活塞完成注射，拔出针头后在注射部位用干净纱布轻压，直至出血停止。
    3. 在TCO-BP注射后1小时，通过尾静脉注射给予约0.74 MBq（20 μCi）的99mTc-四嗪，该溶液配制于100 μL含0.5% BSA和0.01% Tween-80的PBS中。
  2. 生物分布研究
    1. 在预定时间点（t = 6 h），使用3%异氟烷和2%氧气混合气体对小鼠进行麻醉。对麻醉后的小鼠实施足趾夹捏试验，确认其处于外科麻醉水平。
    2. 使用预先用肝素处理的注射器经心脏穿刺采集血液（1 mL）。将小鼠仰卧放置，鼻部置于鼻罩中以维持麻醉状态，并定位动物的剑突。
      1. 在动物腹中线左侧剑突下方插入25 G针头，角度约为20°。完全插入针头后，缓慢回抽活塞，若针头进入心脏则可在针座中观察到血液。如有必要，在保持活塞不动的同时轻微调整针头位置以穿刺心脏，然后缓慢将血液吸入注射器。
    3. 在麻醉状态下通过颈椎脱位处死动物。
    4. 将每只动物放入塑料袋中，使用剂量校准仪（99mTc设置）测量其整体放射性活度。
    5. 采集以下组织和体液样本至预先称重的计数管中：血液、骨骼（膝部和肩部）、胆囊、肾脏、肝脏、胃（含内容物）、小肠（含内容物）、大肠和盲肠（含内容物）、甲状腺和气管、含尿液的膀胱以及尾部。
    6. 用PBS冲洗适当组织（不包括血液、胆囊和膀胱）以去除残留血液，吸干后放入相应的计数管中。
    7. 将动物尸体放入塑料袋中，使用剂量校准仪测量残余的整体放射性活度。
    8. 称量每个含有组织样本的计数管，减去计数管初始重量，得到各组织的实际质量。
    9. 使用剂量校准仪（99mTc设置）测量每只小鼠注射时所用测试样品（100 µL）的放射性活度。
      注：该测试样品体积等于注射体积，因此可反映注射时刻的放射性计数。
    10. 在组织测量时，取之前使用的测试样品5 µL进行分装。使用多探头γ计数器（99mTc设置）测定该5 µL样品的每分钟计数（CPM）。
    11. 利用步骤2.2.9和2.2.10获得的两个数值，通过公式1计算放射性活度与CPM之间的关系，从而获得转换因子（CPM µCi-1）。
      (1) 放射性示踪剂定量公式，包含每分钟计数、剂量校准、γ计数器
    12. 使用γ计数器测定每个组织或体液样本中的放射性活度。
    13. 使用公式1计算在测量时刻各组织或体液中的放射性活度相对于总注射剂量的比例。该数值再根据器官重量进行归一化处理，并以每克组织的注射剂量百分比（即 %ID/g）表示。
    14. 重复步骤2.1.2至2.2.13，开展阴性对照实验：在未给予TCO-BP的情况下，使用99mTc标记的四嗪配体进行实验。分别在注射后0.5、1、4和6小时处死小鼠（n = 3），并按上述方法采集组织或体液样本。

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结果

配体通过不同的连接剂和螯合剂，采用简单的还原胺化策略合成（图2），随后将产物与市售的四嗪进行偶联22,23放射性标记对所有化合物均采用相同方法进行，且具有高度可重复性。通过调节pH值、配体用量、反应时间和温度对过程进行优化，随后 99mTc-放射性标记化合物 1-5 以中等到较高的放射化学产率获得：83%（1), 45% (2), 31% (3), 42% (4)，以及54%（5）经HPLC除去未反应配体并使用蒸发仪蒸发后，将化合物配制于含0.5% BSA和0.01% Tween80的PBS中，用于注射。纯化产物的放射化学活度为 99mTc标记的四嗪约为1.48 MBq/µg. ...

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讨论

制备了一系列具有不同极性的四嗪连接的三齿螯合物，并研究了它们的实用性 99mIEDDA反应中与TCO衍生物形成的Tc配合物 体内 进行了评估。一种有效且可重复的方法 99mTc标记方法已针对五种四嗪螯合剂开发，其中配体浓度为10-3 M. 标记步骤之后进行脱保护 t-丁基（用于化合物） 2-5）。使用高浓度配体可提高放射化学产率并缩短反应时间，从而最大限度地减少四嗪的降解21通过高效液相色谱法（HPLC）将产物与未标记配体及任何放射性化学杂质分离，得到的放射性化学产率为31–83%，所有产物均具有 >99% 的放射化学纯度以及约 1.48 MBq/µg 的高比活度。所有化合物在含 0.5% BSA 和 0.01% Tween80 的 PBS 中均表现出稳定性，持续时间长达 6 小时（图3).

双膦酸盐类化合物（如 TCO-BP）可定位于骨代谢活跃区域或损伤部位...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本研究工作得到了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）、安大略癌症研究所（OICR，#P.SI.015.8）以及加拿大癌症协会（CCS，#703857）的研究资助。作者感谢Denis Snider博士在准备稿件过程中提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
氩气Alphagaz------
Na2CO3EMD Millipore106395---
Na2B4O7·10H2OAnachemiaS9640---
KNaC4H4O6·4H2OAnachemia217255---
Technelite 99mTc 发生器Lantheus medical imaging---99mTcO4- 的来源
0.9% 氯化钠溶液Lantheus medical imaging---用于洗脱发生器
1 M HClLab Chem------
MeOHCaledon------
ACNCaledon---HPLC 级
Millipore H2OThermo Fisher ScientificBarnstead Nanopure---
DCMCaledon------
TFACaledon------
PBSThermo Fisher Scientific10010023pH 7.4 1x
BSASigma AldrichA7906---
Tween80Sigma AldrichP8047---
异氟烷CDMV108737供应商：Fresenius Kabi Animal Health
HPLCWaters1525 二元泵，2998 光电二极管阵列检测器，E-SAT/IN，Bioscan Flowcount PMT 检测器（货号 #15590）---
用于化合物 2-4 分析与纯化的 HPLC 色谱柱Phenomenex00G-4435-E0Gemini® 5 µm C18 110 Å，LC 色谱柱 250 x 4.6 mm
用于化合物 1 和 5 分析与纯化的 HPLC 色谱柱Waters 186003115XBridge BEH C18 色谱柱，130 Å，5 µm，4.6 mm x 100 mm
微波反应器 Biotage Initiator 8---
Biotage V10 浓缩仪Biotage 序列号 V1041---
放射性剂量校准仪Capintec, Inc. CRC-25R---
γ 计数器Perkin ElmerWizard 1470 自动 γ 计数器---
动物房用天平 Mettler ToledoXP105 Delta Range---
微波反应瓶 Biotage 3556290.5–2 mL 

参考文献

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