使用生物正交化学进行预靶向的99mTc标记三齿螯合物的制备与评价

摘要

本文介绍了一种用于前靶向和生物正交化学的三齿^99mTc(I)螯合物-四嗪衍生物的放射性标记及体内测试方案。

摘要

预靶向结合生物正交化学正成为开发新型放射性药物的有效策略。在现有方法中，放射性标记的四嗪与 转反式环辛烯（TCO）与生物分子连接已被证明是一种高效且生物正交的成像特定生物靶点的方法。尽管锝-99m 仍是诊断核医学中最广泛使用的同位素，但目前可用于制备 ^99m锝标记的四嗪。本文报道了一类三齿螯合-四嗪衍生物及其锝(I)配合物的制备。这些此前未知的化合物被放射性标记为 ^99mTc 通过微波辅助法以31%至83%的放射化学产率制备。产物在生理盐水和PBS中稳定，并能快速与TCO衍生物反应。 体外。它们的 体内 通过使用定位于活跃骨代谢或损伤区域的四嗪-双膦酸盐（TCO-BP）衍生物，证明了预靶向能力。在小鼠研究中， ^99mTc-四嗪在膝关节和肩关节中显示出高活性浓度，而在不存在TCO-BP的实验中未观察到该现象。非靶器官的总体摄取情况及药代动力学因连接子的性质和螯合物的极性不同而存在显著差异。

引言

^99mTc 仍是诊断性核医学中使用最广泛的放射性同位素，全球每年进行的影像学检查超过 5000 万例^1,2,3。临床上使用的大多数 ^99mTc 药物属于灌注型放射性药物。目前仅有少数为活性靶向化合物，其中 ^99mTc 通过与靶向结构配体结合，被引导至特异性生物标志物。靶向型 ^99mTc 放射性药物的开发常受到以下因素限制：^99mTc-配体复合物可能影响靶向分子与目标生物标志物的结合能力，或该同位素的半衰期不足以适用于抗体等分子量较高的生物分子。后者通常需要数天时间，以便生物分子从非靶组织中清除后才能进行成像。预靶向技术为此类难题提供了一种替代解决方案。

预靶向策略结合生物正交化学已被证明是开发新型分子成像探针的有效方法，适用于荧光成像和放射性成像^4,5,6,7,8。如图1所示，1,2,4,5-四嗪（Tz）与反式-环辛烯（TCO）衍生物之间的逆电子需求狄尔斯-阿尔德（IEDDA）反应已被证明尤为高效⁶。该反应在磷酸盐缓冲液（PBS）中具有快速的动力学特征（k₂ ≈ 6,000 M^-1 s^-1）和高选择性，因此非常适用于体内预靶向应用^9,10。

最常用的方法是先给予一种由TCO衍生的靶向载体，经过足够的延迟时间后，再给予放射性标记的四嗪。基于放射性标记四嗪的 ¹¹C, ¹⁸F, ⁶⁴铜， ⁸⁹Zr，以及 ¹¹¹已有报道^{11,12,13,14,15}相比之下，仅有一份关于 ^99m使用HYNIC类配体标记的Tc-Tz，该标记过程需加入共配体以防止蛋白质结合与降解 体内¹⁶作为一种替代方法，我们在此报道了 ^99m使用一类可与[Tc(I)]形成稳定三齿配合物的配体来标记四嗪^99mTc(CO)₃]⁺ 核心

图1：四嗪与反式-环辛烯之间的生物正交IEDDA反应。 请点击此处查看此图的放大版本。

所制备的配体家族包含三齿螯合物，其极性以及金属结合区域与Tz之间的连接基团性质各不相同图2目标是鉴定出一个 ^99m可有效定位于并反应TCO标记位点的Tc-四嗪探针 体内 且在未结合时能快速清除，以获得高靶标与非靶标比值。为测试配体，使用了一种双膦酸盐的反式环辛烯衍生物（TCO-BP）¹⁷我们先前已证明，TCO-BP 会定位于骨代谢活跃区域，并可与放射性标记的四嗪发生反应。 体内¹⁸它是一种方便的试剂，可用于测试新的四嗪类化合物，因为它可通过一步反应制备，并可在普通小鼠中进行实验，其在体内的主要富集部位为关节（膝关节和肩关节）。

方案

动物实验已获得麦克马斯特大学动物研究伦理委员会的批准，符合加拿大动物护理委员会（CCAC）的指南要求。

1. 使用^99mTc对Tz-三齿配体进行放射性标记

警告：以下实验步骤涉及放射性化合物的使用。操作必须仅在取得许可的实验室中进行，并严格遵守安全操作和废物处理的相关规定。微波反应必须使用专为化学合成设计的微波反应仪进行。

1. [的合成^99mTc(CO)₃(H₂O₃]^{+ 19,20}
   1. 在微波反应管中，加入 8 mg K₂[BH₃CO₂]，15 mg Na₂CO₃，20 mg Na₂B₄O₇·10H₂O 和 25 mg KOCO[CH(OH)]₂COONa·4H₂O. 用氩气对小瓶吹扫10分钟。
   2. 加入 4 mL 的 ^99mTcO₄^- (~1,100 MBq, ~30 mCi) 的 0.9% 氯化钠溶液加入小瓶中。
   3. 在微波反应器中加热反应液，于110 °C条件下反应3.5分钟，加热前先搅拌10秒以确保试剂充分混匀。
   4. 用约 400 μL 的 1 M HCl 将溶液的 pH 值调节至 3.5–4.0，用 pH 试纸验证。
2. 四嗪配体1-5的放射性标记
   1. 溶解每种配体（化合物）2 mg 1-5) 于 250 μL MeOH 中²¹.
   2. 加入 250 μL 的 [^99mTc(CO)₃(H₂O₃]⁺ （约74 MBq，约2 mCi）加入各溶液中。
   3. 使用微波将反应混合物在 60 °C 下加热 20 分钟。
      注意：此步骤对所有5种四嗪均相同。
   4. 对于化合物 2- 5，蒸发溶剂，将所得产物重新溶解于1 mL体积比为1:1的二氯甲烷:三氟乙酸（DCM:TFA）中。
   5. 加热溶解的反应产物（2-5) 在微波炉中60 °C下加热6分钟（2-4）或 10 分钟（5).
   6. 冷却至室温后，使用蒸发仪（36 °C，8 mbar，3 min，6,000 rpm）蒸发溶剂，并将干燥后的化合物溶解于1:1乙腈:水（ACN:H₂O）中。₂O 或 1:1 甲醇:H₂O，在HPLC纯化之前。
   7. 纯化 ^99mTc标记的化合物（1-5)，包括使用高效液相色谱法（HPLC，C₁₈ 反相）。通常使用 30:70 乙腈:水的洗脱梯度₂O（均含0.1% TFA）至40:60乙腈:水₂O 过 20 分钟（18 分钟）和 C₁₈ 分析柱（4.6 × 100 mm）。同时使用紫外检测（254 nm）和γ检测。
      1. 取每种标记产物的小量样品，将其高效液相色谱（HPLC）保留时间与共注射的非放射性铼标记标准品（0.125 mg溶于20%甲醇-水溶液）进行比较₂O）。在紫外高效液相色谱（UV HPLC）图谱中鉴定重新标记的标准品，其洗脱时间与原始标准品相同。 ^99mγ-HPLC 谱图中Tc标记化合物的共注射结果显示保留时间相近的峰，证实了其同一性 ^99mTc标记化合物
   8. 使用蒸发仪（36 °C，8 mbar，3 min，6,000 rpm）将HPLC组分中的溶剂蒸发除去。
   9. 将纯化后的化合物在含有0.5% BSA和0.01% Tween-80的PBS中配制成7.4 kBq/µL的浓度。
   10. 为确保标记化合物的稳定性，需进行以下操作 体外 稳定性研究。将配制好的化合物在37 °C孵育1、4和6小时，于每个时间点取少量（3.7 MBq）混合物注入HPLC，以评估其稳定性。

2. 预靶向生物分布研究

1. 动物准备
   1. 使用7-9周龄的雌性Balb/c小鼠（n=3），通过尾静脉注射给予生理盐水配制的TCO-BP（20 mg/kg）（5 μg/μL）。
   2. 将小鼠置于物理固定装置中，识别尾部侧面的静脉，并用酒精棉片擦拭。在距尾端约2 cm处，以浅角度平行于静脉插入30号针头。缓慢推动针栓完成注射，拔出针头后在注射部位用干净纱布轻压，直至出血停止。
   3. TCO-BP注射后1小时，通过尾静脉注射给予约0.74 MBq（20 μCi）的^99mTc-四嗪，溶剂为含0.5% BSA和0.01% Tween-80的PBS溶液（100 μL）。
2. 生物分布研究
   1. 在预定时间点（t = 6 h），使用3%异氟烷和2%氧气混合气体对小鼠进行麻醉。对麻醉后的小鼠进行足趾夹捏反射测试，以确认其处于外科麻醉水平。
   2. 使用预先用肝素处理过的注射器经心脏穿刺采集血液（1 mL）。将小鼠仰卧放置，鼻部置于鼻罩中以维持麻醉状态，并定位动物的剑突。
      1. 在动物腹中线略偏左侧、剑突下方插入25 G针头，角度约为20°。完全插入针头后，缓慢回抽针栓，若刺入心脏则可在针座中看到血液。如有必要，在保持针栓不动的同时轻微调整针头位置以刺入心脏，然后缓慢抽取血液至注射器中。
   3. 在麻醉状态下通过颈椎脱位法处死动物。
   4. 将每只动物放入塑料袋中，使用活度计（^99mTc设定）测量整体动物的放射性活度。
   5. 将以下组织和体液收集至预先称重的计数管中：血液、骨骼（膝部和肩部）、胆囊、肾脏、肝脏、胃（含内容物）、小肠（含内容物）、大肠和盲肠（含内容物）、甲状腺和气管、带尿液的膀胱以及尾部。
   6. 将适当组织（不包括血液、胆囊和膀胱）用PBS冲洗以去除残留血液，吸干后放入相应的计数管中。
   7. 将动物尸体放入塑料袋中，使用活度计测量残余的整体放射性活度。
   8. 称量每个含有组织样本的计数管，减去管子的初始重量，得到组织质量。
   9. 使用活度计（^99mTc设定）测量每只小鼠注射时测试样品（100 µL）的放射性活度。
      注：该测试样品体积等于注射体积，因此可反映注射时刻的放射性计数。
   10. 在组织测量时，取之前使用的测试样品5 µL。使用多探头γ计数器（^99mTc设定）进行计数，获得5 µL样品的每分钟计数（CPM）。
   11. 利用步骤2.2.9和2.2.10获得的两个数值，根据公式1计算放射性活度与CPM之间的关系，得出转换因子（CPM µCi^-1）。
       (1)
   12. 使用γ计数器测量每个组织或体液样本的放射性活度。
   13. 使用公式1计算每个组织或体液在测量时刻相对于总注射剂量的放射性活度。该值再根据器官重量进行归一化，以每克组织的注射剂量百分比（即 %ID/g）表示。
   14. 按照步骤2.1.2至2.2.13，开展阴性对照实验：在未给予TCO-BP的情况下，使用^99mTc标记的四嗪配体处理小鼠（n = 3），分别在注射后0.5、1、4和6小时处死动物，并按上述方法采集组织或体液样本。

结果

配体通过不同的连接基团和螯合剂，采用简单的还原胺化策略合成（图2），随后将产物与市售的四嗪偶联^22,23。所有化合物均采用相同的方法进行放射性标记，且结果高度可重复。通过调节pH值、配体用量、反应时间和温度对反应条件进行优化，最终以中等至较高的放射化学产率得到^99mTc标记的化合物1-5：83%（1）、45%（2）、31%（3）、42%（4）和54%（5）。经HPLC纯化除去未反应的配体，并使用蒸发仪蒸发后，将各化合物配制成含0.5% BSA和0.01% Tween80的PBS溶液，用于注射。纯化后的^99mTc标记四嗪的比活度约为1.48 MBq/µg。在进行体内

讨论

制备了一系列具有不同极性的四嗪连接的三齿螯合物，并研究了它们的实用性 ^99mIEDDA反应中与TCO衍生物形成的Tc配合物 体内 进行了评估。一种有效且可重复的方法 ^99mTc标记方法已针对五种四嗪螯合剂开发，其中配体浓度为10^-3 M. 标记步骤之后进行脱保护 t-丁基（用于化合物） 2-5）。使用高浓度配体可提高放射化学产率并缩短反应时间，从而最大限度地减少四嗪的降解²¹通过高效液相色谱法（HPLC）将产物与未标记配体及任何放射性化学杂质分离，得到的放射性化学产率为31–83%，所有产物均具有 >99% 的放射化学纯度以及约 1.48 MBq/µg 的高比活度。所有化合物在含 0.5% BSA 和 0.01% Tween80 的 PBS 中均表现出稳定性，持续时间长达 6 小时（图3).

双膦酸盐类化合物（如 TCO-BP）可定位于骨代谢活跃区域或损伤部位...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氩气	Alphagaz	---	---
Na2CO3	EMD Millipore	106395	---
Na2B4O7·10H2O	Anachemia	S9640	---
KNaC4H4O6·4H2O	Anachemia	217255	---
Technelite 99mTc 发生器	Lantheus medical imaging	---	99mTcO4- 的来源
0.9% 氯化钠溶液	Lantheus medical imaging	---	用于洗脱发生器
1 M HCl	Lab Chem	---	---
MeOH	Caledon	---	---
ACN	Caledon	---	HPLC 级
Millipore H2O	Thermo Fisher Scientific	Barnstead Nanopure	---
DCM	Caledon	---	---
TFA	Caledon	---	---
PBS	Thermo Fisher Scientific	10010023	pH 7.4 1x
BSA	Sigma Aldrich	A7906	---
Tween80	Sigma Aldrich	P8047	---
异氟烷	CDMV	108737	供应商：Fresenius Kabi Animal Health
HPLC	Waters	1525 二元泵，2998 光电二极管阵列检测器，E-SAT/IN，Bioscan Flowcount PMT 检测器（货号 #15590）	---
用于化合物 2-4 分析与纯化的 HPLC 色谱柱	Phenomenex	00G-4435-E0	Gemini® 5 µm C18 110 Å，LC 色谱柱 250 x 4.6 mm
用于化合物 1 和 5 分析与纯化的 HPLC 色谱柱	Waters	186003115	XBridge BEH C18 色谱柱，130 Å，5 µm，4.6 mm x 100 mm
微波反应器	Biotage	Initiator 8	---
Biotage V10 浓缩仪	Biotage	序列号 V1041	---
放射性剂量校准仪	Capintec, Inc.	CRC-25R	---
γ 计数器	Perkin Elmer	Wizard 1470 自动 γ 计数器	---
动物房用天平	Mettler Toledo	XP105 Delta Range	---
微波反应瓶	Biotage	355629	0.5–2 mL