开发了一种简单的红细胞裂解方法用于建立B淋巴母细胞系（B-LCLs），该方法具有高永生化效率，仅需少量血液样本，并可缩短从起始到冻存所需的时间。
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摘要
摘要
存在多种利用爱泼斯坦-巴尔病毒转化B淋巴细胞的方法 体外 建立永生化细胞系。我们开发了一种高效且简便的建立B淋巴母细胞样细胞系（B-LCLs）的新方法——红细胞裂解法。该方法通过去除红细胞简化了外周血单个核细胞（PBMC）的分离步骤，仅需0.5 mL全血即可建立EB病毒（EBV）永生化细胞系，可在相对较短的时间内获得大量增殖的细胞，建系成功率达100%。该方法操作简便、结果可靠、节省时间，适用于大规模临床样本的处理。
引言
静息B细胞可被EB病毒（EBV）转化 体外 转化为活跃增殖的B淋巴母细胞样细胞系（B-LCLs）。B-LCLs在分化与发育方面与生殖细胞相似，其体细胞突变率仅为0.3%1，且遗传和表型改变极小。因此，B淋巴母细胞样细胞系（B-LCLs）作为外周血单个核细胞（PBMCs）的替代物，已显著推动了EBV相关疾病在基因组学、转录组学和蛋白质组学研究中的进展2,3此外，B淋巴母细胞样细胞系（B-LCLs）在单克隆抗体筛选中也具有重要应用。4,5.
已开发出多种利用EBV实现B淋巴细胞永生化的方法。其中最主要的常规操作包括B淋巴细胞的分离以及使用B95-8细胞系产生具有感染性的EBV。从分离到转化，这些方法可分为三种策略。本研究中，通过密度梯度离心法从新鲜血液中分离淋巴细胞，并直接进行EBV转化6-8，该方法称为密度梯度分离法。然而，其他技术克服了新鲜血液运输困难的问题，采用先冷冻纯化的淋巴细胞，再进行后续解冻及EBV感染的流程9-11。冷冻保存的全血也可用于B淋巴细胞的分离与转化12,13。除了密度梯度离心法分离B淋巴细胞外，部分研究人员采用磁性细胞分选仪来富集B淋巴细胞12。然而，磁性分离是一种成本高、操作复杂且耗时的过程。尽管这些方法在高效永生化B淋巴细胞方面具有较高成功率，但在需要处理大量临床样本且血液体积相....
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方案
本研究已获得遗传与发育生物学研究所伦理委员会的批准，且研究方案遵循人类福利的机构指南。
1. EB 病毒的制备
- 第1天，解冻B95-8细胞，将其接种于T25培养瓶中，加入6 mL完全RPMI 1640培养基（含10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺以及抗生素[100 µg/mL链霉素、100 U/mL青霉素]）进行培养。将培养瓶置于5% CO₂培养箱中。2 37 °C 培养箱中孵育。
- 第2天，在显微镜下观察细胞形态。细胞呈明亮且圆形时状态良好。加入10 mL完全RPMI 1640培养基。
- 第4天，加入10 mL新鲜的完全RPMI 1640培养基，然后转移至T75培养瓶中。
- 第8天，加入20 mL完全RPMI 1640培养基。
- 培养细胞8天，期间不添加新鲜培养基， 即，饥饿。
- 第16天，在显微镜下观察细胞。将细胞收集至15 mL离心管中，每管12 mL。
- 在 -80 °C 条件下冷冻保存 1 小时，然后在 37 °C 快速解冻。重复 3 次，直至病毒颗粒从细胞中释放。
- 在室温下以 240 x g 离心 10 分钟。
- 将上清液通过0.22 µm滤器过滤，分装，每管12 mL，于-80 °C保存。
2. 使用红细胞裂解缓冲液处理全血
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结果
在转化过程中，可通过光学显微镜观察细胞的形态学变化（图2）。感染7天后，采用密度梯度分离法可清晰观察到少量细胞簇，而红细胞裂解法则仅可见一层较厚的细胞碎片。然而，在感染后30天，可在细胞碎片厚层下方观察到淋巴母细胞样细胞簇。通过更频繁地更换培养基，细胞碎片逐渐减少，细胞簇变得清晰可见，并呈现出与密度梯度分离法所建立的相同图像。
当细胞系成功建立后，采用MTT法检测B-LCLs的细胞活力。根据文献17，选取不同方法建立的B-LCLs进行细胞活力检测，并以1640培养基作为空白对照。结果显示，采用红细胞裂解法建立的B-LCLs细胞活力显著高于密度梯度离心法建立的B-LCLs（图3）。
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讨论
我们报道了一种通过裂解红细胞从全血中永生化人B细胞的新方法，并采用MTT法评估所建立的B淋巴母细胞样细胞系（B-LCLs）的细胞活力。结果表明，采用红细胞裂解法建立的B-LCLs细胞活力显著高于密度梯度离心分离法。红细胞裂解法的主要优势在于操作简便，仅需少量血液（最少0.5 mL）即可高成功率地建立具有高细胞活力的永生细胞系。
EBV 感染前仅需一个简单的裂解步骤。无需预先纯化淋巴细胞，可避免细胞损失和细胞损伤。密度梯度分离法的另一个问题是溶血。血液在不适宜的温度下长期储存，或在运输过程中发生震荡，可能导致溶血，从而严重影响淋巴细胞的分离。其他研究表明，与密度梯度分离法相比，使用红细胞（RBC）裂解法可获得更高数量的活PBMC18，且对淋巴细胞亚群的影响较小19。与成本较高且操作繁琐的密度梯度分离法相比，红细胞裂解法更为简便，尤其适用于处理大量临床样本，对初学者也更具实用性。
在本研究中，我们采用红细胞裂解法对24个样本进行了永生化，成功率达到100%。与使用2–2.5 mL血液时，.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作得到了中国科学院重点项目的资助（KFZD-SW-205），以及中国科学院战略生物资源技术支撑体系项目（CZBZX-1）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 离心机 | Techcomp | CT6T | 离心 |
| 自动细胞计数仪 | Countstar | IC 1000 | 用于细胞计数 |
| Epoch 微孔板分光光度计 | BioTek Instruments | SN263839 | 用于测定吸光度 |
| 96 孔细胞培养板 | Corning Incorporated | 3599 | 聚苯乙烯板 |
| 24 孔细胞培养板 | Corning Incorporated | 3524 | 聚苯乙烯板 |
| 25 cm2 细胞培养瓶 | Nest | 707001 | 聚苯乙烯 |
| FBS | Gibco | 10270 | B-LCLs 培养基组分 |
| RPMI 1640 培养基 | Gibco | 31800-022 | 用于 B-LCLs 培养基 |
| L-谷氨酰胺 | Amresco | 0374 | B-LCLs 培养基组分 |
| 100x 链霉素-青霉素溶液 BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | B-LCLs 培养基组分 |
| Ficoll paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | 用于 in vitro 淋巴细胞分离 |
| PHA-M | Sigma | L8902 | 用于刺激淋巴细胞增殖 |
| 环孢素 A | Cayman Chemical | 12088 | 用于抑制 T 细胞的细胞毒性作用 |
| 红细胞裂解缓冲液 | Tiangen | RT122-01 | 用于裂解红细胞 |
| MTT | Amresco | 0793 | 用于检测细胞活力 |
| DMSO | Sigma | D2650 | 用于细胞冻存 |
参考文献
- Mohyuddin, A., et al. Genetic instability in EBV-transformed lymphoblastoid cell lines. Biochim Biophys Acta. 1670 (1), 81-83 (2004).
- Hu, V. W., Frank, B. C., Heine, S., Lee, N. H., Quackenbush, J.
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重印与许可
