一种简单的红细胞裂解方法用于建立B淋巴母细胞样细胞系

摘要

开发了一种简单的红细胞裂解方法用于建立B淋巴母细胞系（B-LCLs），该方法具有高永生化效率，仅需少量血液样本，并可缩短从起始到冻存所需的时间。

摘要

存在多种利用爱泼斯坦-巴尔病毒转化B淋巴细胞的方法 体外 建立永生化细胞系。我们开发了一种高效且简便的建立B淋巴母细胞样细胞系（B-LCLs）的新方法——红细胞裂解法。该方法通过去除红细胞简化了外周血单个核细胞（PBMC）的分离步骤，仅需0.5 mL全血即可建立EB病毒（EBV）永生化细胞系，可在相对较短的时间内获得大量增殖的细胞，建系成功率达100%。该方法操作简便、结果可靠、节省时间，适用于大规模临床样本的处理。

引言

静息B细胞可被EB病毒（EBV）转化 体外 转化为活跃增殖的B淋巴母细胞样细胞系（B-LCLs）。B-LCLs在分化与发育方面与生殖细胞相似，其体细胞突变率仅为0.3%¹，且遗传和表型改变极小。因此，B淋巴母细胞样细胞系（B-LCLs）作为外周血单个核细胞（PBMCs）的替代物，已显著推动了EBV相关疾病在基因组学、转录组学和蛋白质组学研究中的进展^2,3此外，B淋巴母细胞样细胞系（B-LCLs）在单克隆抗体筛选中也具有重要应用。^4,5.

已开发出多种利用EBV实现B淋巴细胞永生化的方法。其中最主要的常规操作包括B淋巴细胞的分离以及使用B95-8细胞系产生具有感染性的EBV。从分离到转化，这些方法可分为三种策略。本研究中，通过密度梯度离心法从新鲜血液中分离淋巴细胞，并直接进行EBV转化^6-8，该方法称为密度梯度分离法。然而，其他技术克服了新鲜血液运输困难的问题，采用先冷冻纯化的淋巴细胞，再进行后续解冻及EBV感染的流程^9-11。冷冻保存的全血也可用于B淋巴细胞的分离与转化^12,13。除了密度梯度离心法分离B淋巴细胞外，部分研究人员采用磁性细胞分选仪来富集B淋巴细胞¹²。然而，磁性分离是一种成本高、操作复杂且耗时的过程。尽管这些方法在高效永生化B淋巴细胞方面具有较高成功率，但在需要处理大量临床样本且血液体积相对较小的情况下，仍需建立一种更为简便的方法以获得稳定的永生细胞系。

另一种较少使用的方法是采用全血作为EBV感染和建立B淋巴母细胞样细胞系（B-LCLs）的有核细胞来源。这些方法通过省略细胞分离步骤而使操作更为简便。仅需少量全血，无论是新鲜¹⁴还是冻存^15,16的样本，均足以获得细胞系。然而，根据文献^15,16记载及我们多项验证实验的结果，该方法的成功率存在较大差异。此外，由于存在大量杂质污染，显微镜下难以识别已转化的细胞克隆。因此，亟需一种更为可靠的转化方法。

基于上述考虑，我们开发了一种无需预先纯化淋巴细胞即可建立B淋巴母细胞样细胞系（B-LCLs）的新方法，称为红细胞裂解法。该方法操作简便、节省时间，适用于大量样本。仅需0.5 mL全血即可获得B-LCLs，尤其适用于婴幼儿和老年人，对其健康无明显损害。

方案

本研究已获得遗传与发育生物学研究所伦理委员会的批准，且研究方案遵循人类福利的机构指南。

1. EB 病毒的制备

1. 第1天，解冻B95-8细胞，将其接种于T25培养瓶中，加入6 mL完全RPMI 1640培养基（含10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺以及抗生素[100 µg/mL链霉素、100 U/mL青霉素]）进行培养。将培养瓶置于5% CO₂培养箱中。₂ 37 °C 培养箱中孵育。
2. 第2天，在显微镜下观察细胞形态。细胞呈明亮且圆形时状态良好。加入10 mL完全RPMI 1640培养基。
3. 第4天，加入10 mL新鲜的完全RPMI 1640培养基，然后转移至T75培养瓶中。
4. 第8天，加入20 mL完全RPMI 1640培养基。
5. 培养细胞8天，期间不添加新鲜培养基， 即，饥饿。
6. 第16天，在显微镜下观察细胞。将细胞收集至15 mL离心管中，每管12 mL。
7. 在 -80 °C 条件下冷冻保存 1 小时，然后在 37 °C 快速解冻。重复 3 次，直至病毒颗粒从细胞中释放。
8. 在室温下以 240 x g 离心 10 分钟。
9. 将上清液通过0.22 µm滤器过滤，分装，每管12 mL，于-80 °C保存。

2. 使用红细胞裂解缓冲液处理全血

1. 取0.5 mL经EDTA·K₂抗凝的全血加入至15 mL离心管中。
2. 向全血中加入1 mL红细胞裂解液（使用前经0.22 µm滤器过滤并解冻至室温），充分混匀。室温放置4分钟，随后迅速加入5–7 mL 1×PBS以终止反应。
3. 在室温下以240 × g离心5分钟，白细胞将沉淀于管底。
4. 弃去上清液，加入7 mL 1640基础培养基重悬沉淀，于室温下以240 × g离心5分钟。重复洗涤两次。
5. 用300 µL转化培养基（RPMI 1640培养基，含20%胎牛血清和10 µg/mL植物血凝素（PHA））重悬细胞沉淀。

3. EBV 感染

1. 向细胞悬液中加入 60 µL 浓度为 20 µg/mL 的环孢素 A（CsA）。
2. 将一份 EBV 样本在 37 °C 下快速解冻，然后向细胞悬液中加入 240 µL EBV。
3. 充分混匀后，将细胞悬液转移至 96 孔板中，每孔 200 µL。为防止蒸发，在 96 孔板周围每孔加入 200 µL 1× PBS。将该板置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中。

4. B-LCL 的扩增与冷冻保存

1. EBV 感染后的第一个月内，每周更换一次半量培养基。感染第 7 天时，显微镜下仅可见较厚的细胞碎片层（图 2）。EBV 感染一个月后，显微镜下可在较厚的细胞碎片层下方观察到淋巴母样细胞簇（图 2）。
2. 每 3 天更换半量培养基，直至显微镜下清晰可见细胞簇（图 2）。该过程通常需要 10 至 20 天。
3. 混匀后，用移液器吸取细胞并转移至 24 孔板。当培养基变黄时，使用完全 RPMI 1640 培养基将培养液体积加倍。此过程取决于细胞生长速度。
4. 随后将细胞转移至 T25 培养瓶。当培养基变黄时即加倍培养液体积，直至培养基总体积达到 10 - 15 mL。
5. 冻存前 24 小时更换培养基。将细胞悬液以 240 × g 离心 5 分钟。使用细胞计数仪计数细胞，并以 5 - 10 × 10⁶/mL 的密度悬浮于含 90% 胎牛血清和 10% 二甲基亚砜（DMSO）的冻存液中。以每分钟 1 °C 的速率降温至 -80 °C，然后直接转移至液氮中保存。

5. 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）实验¹⁷

1. 用含10%胎牛血清的1640培养基制备B-LCLs单细胞悬液。每孔接种3 × 10⁴ 个细胞至96孔板，每孔100 µL。
2. 将培养板置于37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育12–16小时。
3. 向细胞生长的孔中加入MTT（5 mg/mL），于37 °C避光孵育4小时。
4. 以168 × g离心细胞板10分钟。
5. 移除上清液，每孔加入100 µL DMSO。
   注意：操作需小心，避免触碰针状染料结晶。
6. 以低速振荡培养板10分钟，使结晶充分溶解。
7. 使用酶标仪在570 nm波长处测定吸光度。

结果

在转化过程中，可通过光学显微镜观察细胞的形态学变化（图2）。感染7天后，采用密度梯度分离法可清晰观察到小簇状细胞，而红细胞裂解法则仅可见一层较厚的细胞碎片。然而，在感染后30天，可在细胞碎片厚层下方观察到淋巴母细胞样细胞簇。通过更频繁地更换培养基，细胞碎片逐渐减少，细胞簇变得清晰可见，并呈现出与密度梯度分离法所建立的相同图像。

当细胞系成功建立后，采用MTT法检测B-LCLs的细胞活力。根据文献¹⁷，选取不同方法建立的B-LCLs进行细胞活力检测，并以1640培养基作为空白对照。结果显示，采用红细胞裂解法建立的B-LCLs细胞活力显著高于密度梯度离心法建立的B-LCLs（图3）。

讨论

我们报道了一种通过裂解红细胞从全血中永生化人B细胞的新方法，并采用MTT法评估所建立的B淋巴母细胞样细胞系（B-LCLs）的细胞活力。结果表明，采用红细胞裂解法建立的B-LCLs细胞活力显著高于密度梯度离心分离法。红细胞裂解法的主要优势在于操作简便，仅需少量血液（最少0.5 mL）即可高成功率地建立具有高细胞活力的永生细胞系。

EBV 感染前仅需一个简单的裂解步骤。无需预先纯化淋巴细胞，可避免细胞损失和细胞损伤。密度梯度分离法的另一个问题是溶血。血液在不适宜的温度下长期储存，或在运输过程中发生震荡，可能导致溶血，从而严重影响淋巴细胞的分离。其他研究表明，与密度梯度分离法相比，使用红细胞（RBC）裂解法可获得更高数量的活PBMC¹⁸，且对淋巴细胞亚群的影响较小¹⁹。与成本较高且操作繁琐的密度梯度分离法相比，红细胞裂解法更为简便，尤其适用于处理大量临床样本，对初学者也更具实用性。

在本研究中，我们采用红细胞裂解法对24个样本进行了永生化，成功率达到100%。与使用2–2.5 mL血液时，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
离心机	Techcomp	CT6T	离心
自动细胞计数仪	Countstar	IC 1000	用于细胞计数
Epoch 微孔板分光光度计	BioTek Instruments	SN263839	用于测定吸光度
96 孔细胞培养板	Corning Incorporated	3599	聚苯乙烯板
24 孔细胞培养板	Corning Incorporated	3524	聚苯乙烯板
25 cm2 细胞培养瓶	Nest	707001	聚苯乙烯
FBS	Gibco	10270	B-LCLs 培养基组分
RPMI 1640 培养基	Gibco	31800-022	用于 B-LCLs 培养基
L-谷氨酰胺	Amresco	0374	B-LCLs 培养基组分
100x 链霉素-青霉素溶液 BioRoYeeBRY-2309	BioRoYee	BRY-2309	B-LCLs 培养基组分
Ficoll paque plus	GE  Healthcare	17-1440-03	用于 in vitro 淋巴细胞分离
PHA-M	Sigma	L8902	用于刺激淋巴细胞增殖
环孢素 A	Cayman  Chemical	12088	用于抑制 T 细胞的细胞毒性作用
红细胞裂解缓冲液	Tiangen	RT122-01	用于裂解红细胞
MTT	Amresco	0793	用于检测细胞活力
DMSO	Sigma	D2650	用于细胞冻存