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方法文章

健康志愿者内皮祖细胞的分离及其受心脏术后血清样本影响的迁移潜能

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DOI：

10.3791/55192

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2017年2月14日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Intensive Care Medicine, University Hospital Aachen, 2Institute of Biochemistry and Molecular Biology, University Hospital Aachen, 3Department of Radiology, German Cancer Research Center, 4Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, University Hospital Aachen, 5Department of Vascular Biology, Institute for Stroke and Dementia Research (ISD), Klinikum der Universität München, 6Deutsches Zentrum für Herz-/Kreislaufkrankheiten (DZHK), Munich Heart Alliance

本文内容

摘要

内皮祖细胞（EPCs）在缺血组织的新生血管形成中起着至关重要的作用。本方法描述了从外周血中分离人源EPCs，以及鉴定其对心脏外科患者血清样本的迁移潜能。

摘要

内皮祖细胞（EPCs）在缺氧等病理条件下从骨髓中被募集，对缺血组织的新生血管形成具有关键作用。EPCs 的来源、分类与特征界定较为复杂；尽管如此，目前已明确两种主要的 EPC 亚型：所谓的 "早期" EPCs（随后称为早期EPCs）和晚期出生物EPCs（late-EPCs）。可根据其生物学特性以及在培养过程中的形态特征进行分类 体外 培养。虽然 "早期" EPCs在使用内皮细胞特异性培养基培养外周血单个核细胞后不到一周内出现，而晚期集落EPCs可在2-3周后被发现。晚期集落EPCs已被证实直接参与新生血管形成，主要通过分化为成熟内皮细胞的能力，而 "早期" EPCs 表达多种促血管生成因子作为内源性 cargo，以旁分泌方式促进血管生成。在心肌缺血/再灌注（I/R）过程中，多种因素调控 EPCs 向血管形成区域的归巢。

巨噬细胞移动抑制因子（Macrophage migration inhibitory factor, MIF）是一种具有趋化因子样作用的促炎性细胞因子，广泛表达于多种组织，并被最近研究证实可在生理浓度下作为内皮祖细胞（EPCs）迁移的关键调控因子1。有趣的是，MIF 储存于细胞内池中，可在多种刺激（例如 心肌梗死）后迅速释放入血液循环。
本实验方案描述了一种从成人外周血中可靠分离和培养早期EPCs的方法，该方法基于CD34阳性细胞筛选，随后在含有内皮生长因子的培养基中，于纤维连接蛋白包被的培养板上进行培养，用于后续针对心脏外科患者血清样本的体外迁移实验。此外，本方案还展示了MIF对EPCs趋化迁移的影响，并与其他已知的促血管生成细胞因子进行了比较。

引言

内皮祖细胞（EPCs）存在于人体血液中，具有分化为内皮细胞的能力2。它们参与血管发生过程，并可通过多种机制减轻炎症以及缺血/再灌注（I/R）损伤所造成的损害3,4。例如，EPCs表现出较高的细胞内抗氧化酶水平，如过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶或锰超氧化物歧化酶（MnSOD）5。这种对氧化应激的增强耐受性使EPCs能够在缺血损伤后活性氧（ROS）水平升高的微环境中发挥功能6。先前的研究还表明，EPCs的数量可能与血管修复能力相关，循环中EPCs数量减少可预测心血管事件的发生7,8。然而，目前尚未确立EPC的明确定义。迄今为止，尚无特异性的EPC细胞表面标志物或一致的表型特征，且这类细胞在外周血中极为稀少9。人类EPC应被视为一种能够参与受损内皮及新生血管结构重建的循环细胞。

分离和鉴定EPC的一种方法是通过其对纤连蛋白的黏附特性。利用这些细胞对纤连蛋白包被培养皿的黏附能力显著强于I型胶原等基质的特点，可实现分离3,10,11。然而，也有研究发现，将单个核细胞直接接种于纤连蛋白包被的培养皿中，若未经过任何前期或后续纯化步骤，则可能形成包含髓系祖细胞、单核细胞和T淋巴细胞的集落12,13,14。此外，在这种情况下，血小板可能污染单个核细胞（MNC）组分，从而将血浆膜蛋白转移至任何贴壁细胞上15。

除了通过表征手段 体外 黏附实验中，通过组合使用多种细胞表面标志物来定义一种被视为内皮祖细胞（EPC）的细胞类型。在此情况下，细胞经纤维连接蛋白介导黏附后，进一步分析其内皮样特性。该过程中涉及两种内皮细胞相关标志物：乙酰化低密度脂蛋白（acLDL）和血管内皮生长因子受体2（VEGFR-2, KDR）。研究表明，内皮细胞和巨噬细胞可通过一种称为acLDL特异性摄取的过程摄取acLDL。 "清道夫细胞通路"16另一个标志蛋白是KDR，它是内皮细胞上主要的VEGF受体。17然而，由于内皮祖细胞通常在添加了内皮生长因子和胎牛血清的培养基中培养，因此有可能被误分离出的巨噬细胞也会表现出类似内皮细胞的标志物表达谱。如先前研究所示，若在内皮细胞条件培养基中培养，巨噬细胞会表达 "内皮细胞特异性的" 蛋白质18.

通常，内皮祖细胞（EPCs）可分为两大类，下设更多亚型，可在血液中发现或通过培养获得 体外晚期集落形成内皮祖细胞（late-EPCs）在培养2-3周后出现。这些细胞能更快地整合到人脐静脉内皮细胞单层中，并可形成毛细血管样管状结构。19此外，所谓的 "早期内皮祖细胞" 在血液中循环约一周时间，并通过递送血管内皮生长因子（VEGF）或CXCL8等促血管生成分子发挥较为被动的作用19冠状动脉疾病（CAD）患者的早期内皮祖细胞（early-EPCs）数量显著低于无CAD的对照组20有趣的是，该组的晚期EPCs数量较对照组更高。另一项研究表明，早期EPCs可通过旁分泌方式在氧化应激条件下保护已分化的EPCs免于凋亡。6因此，早期EPC可能通过自分泌或旁分泌方式促进外周血中其他细胞的迁移，从而发挥重要的保护作用。

本方案描述了一种纯化早期内皮祖细胞（EPC）的方法，首先从人外周血中分离外周血单个核细胞（PBMC）组分，再从PBMC组分中分离CD34+细胞，以去除该细胞悬液中的非目标细胞。CD34是一种用于分离人造血干细胞的标志物9。随后，将CD34+细胞培养于纤维连接蛋白包被的组织培养表面。培养三天后更换培养基，从而去除所有非贴壁细胞。最后，通过荧光激活细胞分选（FACS）对分离得到的EPC进行染色，以验证其对乙酰化低密度脂蛋白（acLDL）的摄取能力以及内皮细胞标志物KDR的表达。作为额外的标志物，我们还分析了血小板内皮细胞黏附分子（PECAM-1，CD31），该分子亦表达于内皮细胞上。

通过增强内皮祖细胞（EPCs）的募集以修复受损或梗死的心肌组织，是心血管疾病中备受关注的治疗策略之一。然而，由于在不同病理生理条件下人体内复杂的细胞相互作用，将实验结果转化为临床实践仍然面临挑战。此外，心肌缺血/再灌注（I/R）损伤会触发多种细胞因子、激素和生长因子的过度分泌，这些因子调控EPCs向血管形成区域的归巢过程13。已有研究表明，在心肌I/R损伤后，血清样本中CXCL8、基质细胞衍生因子1α（SDF-1α，CXCL12）、VEGF以及巨噬细胞移动抑制因子（MIF）水平显著升高1。在这些因子中，MIF是一种具有多效性的类趋化因子细胞因子，主要表现出促炎特性。与它的历史命名相反，MIF具有促进细胞迁移的功能，可作为真正的趋化因子作用于多种细胞类型1,21,22。MIF介导的细胞募集过程已被证实与趋化因子受体CXCR2和CXCR4相关，MIF以非经典方式结合并激活这两个受体21。值得注意的是，EPCs在其表面表达这两种受体，且在缺氧条件下其表达进一步上调23,24。此外，越来越多的证据表明，MIF在心脏I/R损伤过程中具有整体的心脏保护作用22,25,26。在此背景下，已有研究进一步表明，MIF可能在缺氧应激期间促进新生血管形成，这一点尤为重要，因为受伤心肌的自我修复能力有限27。既往的体外（in vitro）研究及临床前小鼠模型实验已初步揭示了MIF在EPCs募集中的作用4。值得注意的是，MIF也是EPCs中一种重要的 cargo 蛋白，可在EPCs募集至缺血部位时被释放28。然而，关于MIF在临床环境中的研究，特别是与其他（促血管生成）血清细胞因子的比较，目前仍缺乏明确证据。

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方案

用于内皮祖细胞（EPC）分离的血液来自健康志愿者，在获得知情同意后采集，符合当地伦理委员会的规定。迁移实验所用血清样本来自接受常规心脏手术并使用体外循环（CPB）的患者。排除标准包括：急诊手术、已知或疑似妊娠、患者年龄小于18岁以及未能获得知情同意。血清样本在临床常规检测之外额外采集（分别于术前即刻和心肌再灌注后/主动脉阻断钳开放即刻），随后储存于-80 °C，直至最终分析。本研究经机构审查委员会（伦理委员会，亚琛工业大学 RWTH）批准。患者平均年龄为68.6岁，平均体重为81.7 kg。合并基础疾病包括：高血压（65%）、慢性肺部疾病（19%）、心外动脉病变（16%）、脑功能障碍（6%）、不稳定型心绞痛（3%）、近期心肌梗死（90天内占28%）、慢性肾脏病（14%）、肝病（2%）和糖尿病（34%）。

1. T75 培养瓶的包被：

  1. 每T75培养瓶准备5 mL纤连蛋白溶液（1 mg人纤连蛋白溶于15 mL超纯水中）。
  2. 将溶液加入T75培养瓶中，等待水分完全蒸发。为避免因蒸发过程导致细胞分离操作中断，应提前完成此步骤。例如 过夜）及室温条件下。该溶液提供 4.44 µg 纤连蛋白/cm2.
  3. 通过添加生产商提供的生长因子补充剂来配制内皮细胞生长培养基MV2，即在基础MV2培养基中补充相应的生长因子。

2. 从60 mL血液中分离内皮祖细胞（EPCs）：

注意：由于CD34阳性选择试剂盒与磁珠为商业化的组合装试剂，制造商未提供具体浓度。然而，处理最多5 × 108个细胞时，约需100 µL抗体。磁珠以水稀释，表面经葡聚糖包被，其体积约为其他商业化磁珠的1/5000。更多详细信息请参阅制造商说明书。

  1. 将血液（含或不含抗凝剂）按1:1比例与Ca混合2+-Mg2+无PBS
  2. 每支50 mL离心管中加入15 mL密度梯度溶液。更多详情请参见生产商说明书。
  3. 将稀释后的血液缓慢地加在密度梯度溶液上方。
  4. 以2,500 × g离心30分钟，采用慢加速且不刹车。
  5. 仔细收集每支试管中的白膜层图1) 使用无菌塑料移液管将其转移至另一管中。注意避免收集密度梯度液。预期的外周血单个核细胞（PBMC）产量约为 3-4 x 106 细胞/毫升血液

从血沉棕黄层分离示意图，标注有血浆、外周血单个核细胞、菲可液、粒细胞、红细胞。
图1：菲可液密度梯度离心法分离血沉棕黄层。图示为在密度梯度溶液上以2,500 × g离心30分钟后的结果。图中可见红细胞和粒细胞（红色）、单个核细胞层（白色层）、血浆（黄色）以及密度梯度溶液（灰白色）。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 用至少3倍体积的PBS稀释外周血单个核细胞组分，并混匀。在室温下以200 × g离心15分钟。
  2. 重复步骤2.6两次。
  3. 吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于5 mL MV2培养基中。
  4. 每份使用的血沉棕黄层加入100 µL人CD34抗体（足以处理最多5 × 108个细胞），在37 °C、5% CO2条件下旋转孵育15分钟。
  5. 每份使用的血沉棕黄层加入50 µL葡聚糖包被的磁珠，在37 °C、5% CO2条件下旋转孵育10分钟。
  6. 孵育结束后，将悬液转移至FACS管中，每管最多不超过3 mL。超过此量将无法与磁铁兼容。
  7. 将FACS管插入磁铁中，静置5分钟。
  8. 在不将FACS管从磁铁中取出的情况下，弃去上清液。
  9. 将每根FACS管中的细胞在磁铁外用3 mL MV2培养基重悬。
  10. 重复步骤2.12–2.14两次。
  11. 将FACS管从磁铁中取出，并将细胞重悬于3 mL MV2培养基中。
  12. 将细胞悬液转移至预先包被的T75培养瓶中，每瓶加入17 mL MV2培养基。
    注意：培养基应在3天后更换。一周后，细胞呈现纺锤形结构（图2），即可使用。有关分离过程的概览，请参见图3。

细胞形态的显微图像；比例尺 400 µm；细胞结构分析。
图2：分离出的EPCs显微图像。图中显示了T75培养瓶中分离得到的早期EPCs在消化前的代表性图像。EPCs呈现出明显的纺锤形结构。请点击此处查看该图的放大版本。

血液分馏过程示意图，显示了离心和祖细胞PBMC分离步骤。
图3：内皮祖细胞（EPC）分离流程示意图。 图示为EPC分离方案的各个步骤。更详细的方案请参见方案部分的第2节。

3. 迁移实验

  1. 从T75培养瓶中的EPCs中移除培养基。
  2. 加入5 mL PBS，轻轻振荡洗涤。
  3. 移除PBS，加入5 mL商用细胞解离液。等待细胞解离（在显微镜下观察确认）。可通过轻轻敲击培养瓶底部加速细胞解离。
  4. 当细胞完全解离后，迅速加入5 mL MV2完全培养基，并将细胞悬液转移至另一离心管中。
  5. 以2,000 × g离心5分钟。
  6. 用5–10 mL PBS重悬细胞，再次以2,000 × g离心5分钟。
  7. 重复步骤3.6。
  8. 用MV2饥饿培养基重悬细胞沉淀（每个跨膜迁移孔需75 µL中含50,000个细胞）。
    注意：所用迁移系统取决于细胞类型和实验设计。存在不同孔径和板规格（孔数）的选择。对于EPCs，使用96孔系统、孔径为5 µm的迁移板最为适宜。
  9. 向迁移板下室加入235 µL血清样本（用MV2饥饿培养基按1:5比例稀释的血清），以准备迁移板（图4）。

细胞迁移实验示意图，Δt 符号，EPC 通过滤膜系统，上室/下室。
图 4：改良型 Boyden 小室中的迁移实验。 图示为改良型 Boyden 小室的一般设计。细胞培养小室（= 上室）以深蓝色表示，并插入下室中。这些小室的底部（而非侧壁）代表包含孔隙的滤膜系统。（a）显示实验起始时间点的装置。（b）经过选定的时间点后，细胞已通过滤膜向刺激物方向迁移。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 在加入细胞悬液前，立即加入插入片段。
  2. 将75 µL细胞悬液（= 50,000个细胞）加入上室。
  3. 在37 °C和5% CO2条件下孵育3小时，使EPC细胞迁移（迁移时间取决于细胞类型和实验系统）。
    1. 为避免血清自发荧光干扰，可在显微镜下对孔板拍照，并使用半自动软件“ImageJ”计数迁移细胞。
  4. 移除上室（包含所有未迁移的细胞）。
  5. 加入70 µL含Hoechst染料（按1:1,000稀释）的3.6%多聚甲醛溶液。板子可在37 °C和5% CO2条件下过夜保存。
  6. 短暂离心板子，以2,000 × g离心1–2分钟，使所有细胞处于同一焦平面。
  7. 每孔拍摄5张图片（图5和图6），放大倍数为100倍。

显示细菌菌落的培养皿示意图；抗生素敏感性试验装置。
图 5：拍摄图像位置示意图。 该示意图显示了为测定迁移细胞数量而拍摄的五张图像相对于孔的位置。通过拍摄这些图像来计数细胞，并为每个孔计算平均值。请点击此处查看该图的放大版本。

荧光显微镜图像，细胞经DAPI染色，用于细胞核可视化，细胞生物学研究。
图6：用于细胞定量的显微图像。图中显示了一张具有代表性的图像，用于细胞定量分析。细胞使用Hoechst染料在3.6%多聚甲醛中进行染色和固定。图中斑点代表已固定并染色的内皮祖细胞。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 使用美国国立卫生研究院的半自动软件“ImageJ”对迁移的细胞进行计数。

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结果

内皮祖细胞的鉴定

首先，验证了分离细胞群体对乙酰化低密度脂蛋白（acLDL）的摄取能力，以及表面KDR和CD31的表达情况。如图7a所示，85.1%的分离出的内皮祖细胞（EPCs）表现出对acLDL的摄取并表达CD31。图7b和图7c进一步显示这两种标志物分布均一，尽管似乎存在一小部分细胞群体对这两种标志物均为阴性。第二步，进行了acLDL与KDR联合的流式细胞术（FACS）分析。图8a显示，超过80%的分离细胞表现出对acLDL的摄取以及表面KDR的表达。图8b和图8c展示了这些标志物分布的均一性。

为了验证在培养期间使用纤维连接蛋白包...

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讨论

本研究的第一部分包括从健康志愿者的外周血中分离人EPCs，以便对心脏手术患者的血液进行全面评估。因此，采用密度梯度离心法将PBMC组分与血浆、粒细胞和红细胞分离。为了去除大部分污染的血小板，对该细胞组分进行了短暂且低速的洗涤步骤29,30。接下来，从剩余组分中分离CD34+细胞，以将前体细胞与残余的淋巴细胞和单核细胞分开。最后，将细胞悬液接种于纤维连接蛋白包被的培养皿中，使用市售的内皮细胞生长培养基进行培养，从而将内皮祖细胞与其他（前体）髓系细胞分离3。值得注意的是，有研究讨论血小板也可能表达CD34细胞表面标志。尽管先前的研究表明某些抗CD34抗体可与血小板结合，但这可能是由于血小板与其他（CD34阳性）细胞聚集所致的人为假象31,32。然而，大多数血小板可通过重复的低速洗涤步骤得以分离。除血小板外，其前体细胞——巨核细胞——也表达该...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
纤连蛋白Biochrom AGL7117T-75 培养瓶包被
注射用水Fresenius Kabi
内皮细胞生长培养基 MV2Promo CellC-22221
内皮细胞生长培养基 MV2 添加剂混合液Promo CellC-39226
Ficoll-Paque plusGE Healthcare17-1440-03密度梯度离心
EasySep 人 CD34 阳性选择试剂盒Stemcell Technologies18056分离 CD34+ 细胞
EasySep 磁力架Stemcell Technologies18000
AccutaseSigma-AldrichA6964-100ML细胞消化
Corning HTS Transwell 96 孔可渗透支持板Sigma-AldrichCLS3387-8EA细胞迁移系统
Hoechst 溶液ThermoFisher33342迁移细胞染色
ImageJ美国国立卫生研究院xxx迁移细胞计数

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