健康志愿者内皮祖细胞的分离及其受心脏术后血清样本影响的迁移潜能

摘要

内皮祖细胞（EPCs）在缺血组织的新生血管形成中起着至关重要的作用。本方法描述了从外周血中分离人源EPCs，以及鉴定其对心脏外科患者血清样本的迁移潜能。

摘要

内皮祖细胞（EPCs）在缺氧等病理条件下从骨髓中被募集，对缺血组织的新生血管形成具有关键作用。EPCs 的来源、分类与特征界定较为复杂；尽管如此，目前已明确两种主要的 EPC 亚型：所谓的 "早期" EPCs（随后称为早期EPCs）和晚期出生物EPCs（late-EPCs）。可根据其生物学特性以及在培养过程中的形态特征进行分类 体外 培养。虽然 "早期" EPCs在使用内皮细胞特异性培养基培养外周血单个核细胞后不到一周内出现，而晚期集落EPCs可在2-3周后被发现。晚期集落EPCs已被证实直接参与新生血管形成，主要通过分化为成熟内皮细胞的能力，而 "早期" EPCs 表达多种促血管生成因子作为内源性 cargo，以旁分泌方式促进血管生成。在心肌缺血/再灌注（I/R）过程中，多种因素调控 EPCs 向血管形成区域的归巢。

巨噬细胞移动抑制因子（Macrophage migration inhibitory factor, MIF）是一种具有趋化因子样作用的促炎性细胞因子，广泛表达于多种组织，并被最近研究证实可在生理浓度下作为内皮祖细胞（EPCs）迁移的关键调控因子¹。有趣的是，MIF 储存于细胞内池中，可在多种刺激（例如 心肌梗死）后迅速释放入血液循环。
本实验方案描述了一种从成人外周血中可靠分离和培养早期EPCs的方法，该方法基于CD34阳性细胞筛选，随后在含有内皮生长因子的培养基中，于纤维连接蛋白包被的培养板上进行培养，用于后续针对心脏外科患者血清样本的体外迁移实验。此外，本方案还展示了MIF对EPCs趋化迁移的影响，并与其他已知的促血管生成细胞因子进行了比较。

引言

内皮祖细胞（EPCs）存在于人体血液中，具有分化为内皮细胞的能力²。它们参与血管发生过程，并可通过多种机制减轻炎症以及缺血/再灌注（I/R）损伤所造成的损害^3,4。例如，EPCs表现出较高的细胞内抗氧化酶水平，如过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶或锰超氧化物歧化酶（MnSOD）⁵。这种对氧化应激的增强耐受性使EPCs能够在缺血损伤后活性氧（ROS）水平升高的微环境中发挥功能⁶。先前的研究还表明，EPCs的数量可能与血管修复能力相关，循环中EPCs数量减少可预测心血管事件的发生^7,8。然而，目前尚未确立EPC的明确定义。迄今为止，尚无特异性的EPC细胞表面标志物或一致的表型特征，且这类细胞在外周血中极为稀少⁹。人类EPC应被视为一种能够参与受损内皮及新生血管结构重建的循环细胞。

分离和鉴定EPC的一种方法是通过其对纤连蛋白的黏附特性。利用这些细胞对纤连蛋白包被培养皿的黏附能力显著强于I型胶原等基质的特点，可实现分离³

方案

用于内皮祖细胞（EPC）分离的血液来自健康志愿者，在获得知情同意后采集，符合当地伦理委员会的规定。迁移实验所用血清样本来自接受常规心脏手术并使用体外循环（CPB）的患者。排除标准包括：急诊手术、已知或疑似妊娠、患者年龄小于18岁以及未能获得知情同意。血清样本在临床常规检测之外额外采集（分别于术前即刻和心肌再灌注后/主动脉阻断钳开放即刻），随后储存于-80 °C，直至最终分析。本研究经机构审查委员会（伦理委员会，亚琛工业大学 RWTH）批准。患者平均年龄为68.6岁，平均体重为81.7 kg。合并基础疾病包括：高血压（65%）、慢性肺部疾病（19%）、心外动脉病变（16%）、脑功能障碍（6%）、不稳定型心绞痛（3%）、近期心肌梗死（90天内占28%）、慢性肾脏病（14%）、肝病（2%）和糖尿病（34%）。

1. T75 培养瓶的包被：

1. 每T75培养瓶准备5 mL纤连蛋白溶液（1 mg人纤连蛋白溶于15 mL超纯水中）。
2. 将溶液加入T75培养瓶中，等待水分完全蒸发。为避免因蒸发过程导致细胞分离操作中断，应提前完成此步骤。例如 过夜）及室温条件下。该溶液提供 4.44 µg 纤连蛋白/cm².
3. 通过添加生产商提供的生长因子补充剂来配制内皮细胞生长培养基MV2，即在基础MV2培养基中补充相应的生长因子。

2. 从60....

结果

内皮祖细胞的鉴定

首先，验证了分离细胞群体对乙酰化低密度脂蛋白（acLDL）的摄取能力，以及表面KDR和CD31的表达情况。如图7a所示，85.1%的分离出的内皮祖细胞（EPCs）表现出对acLDL的摄取并表达CD31。图7b和图7c进一步显示这两种标志物分布均一，尽管似乎存在一小部分细胞群体对这两种标志物均为阴性。第二步，进行了acLDL与KDR联合的流式细胞术（FACS）分析。图8a显示，超过80%的分离细胞表现出对acLDL的摄取以及表面KDR的表达。图8b和图8c展示了这些标志物分布的均一性。

为了验证在培养期间使用纤维连接蛋白包.......

讨论

本研究的第一部分包括从健康志愿者的外周血中分离人EPCs，以便对心脏手术患者的血液进行全面评估。因此，采用密度梯度离心法将PBMC组分与血浆、粒细胞和红细胞分离。为了去除大部分污染的血小板，对该细胞组分进行了短暂且低速的洗涤步骤^29,30。接下来，从剩余组分中分离CD34⁺细胞，以将前体细胞与残余的淋巴细胞和单核细胞分开。最后，将细胞悬液接种于纤维连接蛋白包被的培养皿中，使用市售的内皮细胞生长培养基进行培养，从而将内皮祖细胞与其他（前体）髓系细胞分离³。值得注意的是，有研究讨论血小板也可能表达CD34细胞表面标志。尽管先前的研究表明某些抗CD34抗体可与血小板结合，但这可能是由于血小板与其他（CD34阳性）细胞聚集所致的人为假象^31,32。然而，大多数血小板可通过重复的低速洗涤步骤得以分离。除血小板外，其前体细胞——巨核细胞——也表达该.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
纤连蛋白	Biochrom AG	L7117	T-75 培养瓶包被
注射用水	Fresenius Kabi
内皮细胞生长培养基 MV2	Promo Cell	C-22221
内皮细胞生长培养基 MV2 添加剂混合液	Promo Cell	C-39226
Ficoll-Paque plus	GE Healthcare	17-1440-03	密度梯度离心
EasySep 人 CD34 阳性选择试剂盒	Stemcell Technologies	18056	分离 CD34+ 细胞
EasySep 磁力架	Stemcell Technologies	18000
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964-100ML	细胞消化
Corning HTS Transwell 96 孔可渗透支持板	Sigma-Aldrich	CLS3387-8EA	细胞迁移系统
Hoechst 溶液	ThermoFisher	33342	迁移细胞染色
ImageJ	美国国立卫生研究院	xxx	迁移细胞计数