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方法文章

局部场荧光显微技术：在完整心脏中成像细胞信号

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DOI：

10.3791/55202

⸱

2017年3月8日

 ,  ,  , 
1School of Natural Sciences, University of California, Merced, 2Centro de Investigaciones Cardiovasculares, Universidad de la Plata and Conicet, 3Facultad de Ingenieria, Universidad Nacional de Entre Rios, 4Department of Physiology, Midwestern University, 5School of Engineering, University of California, Merced

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

在心脏中，分子事件协调着器官的电活动和收缩功能。本文介绍了一系列局部场荧光显微技术，可用于在完整心脏中记录细胞水平的变量。明确调控心脏功能的机制，对于理解心脏在病理状态下的工作方式至关重要。

摘要

在心脏研究中，分子信号研究通常在分离的心肌细胞中进行。然而，许多病理情况（如缺血和心律失常）只有在完整器官水平上才能得到充分理解。本文介绍了局部场荧光显微技术（LFFM），该技术可在完整心脏中检测细胞信号。该技术结合了Langendorff灌流心脏系统与光纤，用于记录荧光信号。LFFM在心血管生理学领域具有多种应用，可用于研究正常和病理状态下的心脏功能。通过使用不同的荧光指示剂，可同时监测多种心脏变量，包括胞质[Ca2+]、肌浆网内[Ca2+]以及膜电位。本文介绍了三种不同的LFFM落射荧光技术配置，用于激发外源性荧光探针并检测其发射荧光。这些技术的主要区别在于激发光源的类型以及激发光的调制方式。脉冲式LFFM（PLFFM）采用激光脉冲进行激发，而连续波LFFM（CLFFM）则使用连续激光进行激发。此外，还使用发光二极管（LED）作为第三种光源。这种非相干光源配置称为脉冲LED荧光显微技术（PLEDFM）。

引言

心脏是心血管系统的核心器官。心脏的收缩由细胞内[Ca2+]升高所启动。电兴奋性与细胞内Ca2+释放变化之间的关系，传统上是在酶解分离的细胞中进行研究的1,2。然而，心肌细胞在电学、代谢和机械方面是相互耦合的3,4。当细胞被分离后，不仅失去了物理上的连接，而且在解离过程中来自不同心肌层的细胞也会混合在一起5。此外，尽管在电压钳条件下研究分离细胞带来了巨大优势6,7,8，但心脏作为电合胞体的固有特性始终引发一个问题：与组织中的心肌细胞相比，分离后的细胞在功能上是否存在差异3。

在本文中，我们描述了利用完整心脏中的局部场荧光显微技术（LFFM）在心脏生理学知识方面取得的进展。LFFM 使用荧光指示剂来测量多种生理变量，如胞质 Ca2+、肌浆网（SR）内 Ca2+ 以及膜电位。这些测量可与心室压力9,10、心电图9、电动作电位（APs）、离子电流记录以及笼锁化合物的闪光光解4,11 同时结合进行。此外，这些测量可通过以更接近生理频率的较高频率起搏完整心脏来实现。尽管我们课题组已发表多篇文章9,11,12,13,14 介绍 LFFM 技术的应用，但由于该技术被认为存在技术复杂性，限制了其在研究心脏及其他器官离体（ex vivo）生理现象中的广泛应用。

LFFM 技术（图1）基于使用与组织接触的多模光纤获取的落射荧光测量。与所有接触式荧光成像技术一样，光学分辨率取决于光纤的直径和数值孔径（NA）。光纤的 NA 越高、直径越小，测量的空间分辨率就越高。NA 的范围通常为 0.22 至 0.66，光纤直径的范围为 50 µm 至 1 mm。增大 NA 可通过接收来自更大立体角的光子来提高信噪比（S/N）。为了实现落射荧光功能，需使用非球面透镜或落射荧光物镜将光束聚焦进入光纤，且透镜与光纤的 NA 应相匹配。这种匹配可使激发光的能量传递效率最大化，并最大限度地收集荧光团发射的光子。

为了激发组织中加载的外源性荧光指示剂，可以采用不同的光源和照明模式。我们早期利用脉冲局域场荧光显微技术3,12（PLFFM）的研究使用了一种低成本的皮秒激光器（图1a，PLFFM）。这类光源具有显著优势：由于脉冲持续时间极短，可在照明区域内激发大量荧光分子，同时不会对染料造成明显的光漂白12。此外，使用超短脉冲还能够评估染料的荧光寿命12。荧光寿命是一种可用于量化与Ca2+结合的染料分子比例的特性。然而，脉冲之间存在的时间抖动以及脉冲幅度的变化，限制了该实验策略的应用范围，仅适用于配体与染料结合所引起的荧光变化较大的情况。

连续波（CW）激光器通常用作LFFM的主要照明光源（图1b，CLFFM）。激光束可连续照射组织，也可通过铁电调制实现控制。该铁电调制可产生微秒级的光脉冲，并可通过外部硬件进行调控。此方法不仅显著降低了光脉冲的时间抖动，还可实现不同波长光束的混合。光束混合通过多路复用来自不同激光器的光束完成，从而可激发多种具有不同光谱特性的染料，用于测量多种生理参数，例如使用Rhod-2检测胞质Ca2+，使用MagFluo4检测肌浆网内Ca2+，以及使用di-8-ANEPPS检测膜电位。

尽管激光器作为线性荧光激发显微镜（LFFM）中的光源具有多种优势，但也可使用其他类型的光源，包括发光二极管（LED）。在此情况下，激发光源采用了一个氮化铟镓（InGaN）LED（图1c，PLEDFM）。在LED中，当导带中的电子与价带中的空穴复合时，会自发发射光子。与固态激光器不同的是，这种发射过程并非由其他光子激发产生，因此LED发出的光束是非相干的，且光谱发射范围更宽。

可使用不同类型的高功率LED。在使用Di-8-ANEPPS记录动作电位以及使用Fluo-4或Mag-Fluo-4记录Ca2+瞬变时，我们采用的LED典型峰值发射波长为485 nm（蓝色），半高宽为20 nm（图1d）。在使用Rhod-2记录Ca2+瞬变时，LED的典型峰值发射波长为540 nm（绿色），半高宽为35 nm（图1d）。LED发射的光处于一定波长范围内，因此需要使用滤光片来缩小其光谱发射范围。此外，LED可产生频率达1.6 kHz、持续时间为20 µs的脉冲光。LED通过快速功率MOSFET场效应晶体管进行脉冲驱动。通过时间复用方式，可实现不同荧光指示剂的同步记录。然而，与激光束相比，LED发出的光更难以聚焦到光纤上。因此，使用LED的主要缺点是其发射光束相对于主轴存在角度偏移（±15°），必须使用辅助光学元件进行校正。

在前述所有光学配置中，激发光借助二向色镜进行反射。光束随后通过非球面透镜和显微物镜聚焦，照射至置于组织上的多模光纤上。与任何落射荧光装置类似，二向色镜还用于将激发光与发射光分离。发射光谱经由屏障滤光片返回，以去除任何反射的激发光。最后，发射光通过物镜聚焦到光电探测器上（图1）。

光信号到电流的转换由硅雪崩光电二极管完成。这类二极管响应速度快、灵敏度高，可实现弱光检测。雪崩光电二极管产生的光电流可通过两种方式放大：一种是采用电阻反馈元件的跨阻放大器（图1e）或通过积分器将电流转换为电压（图1f）。采用第一种方法时，输出电压与光电流和反馈电阻成正比。图中展示了利用电阻检测皮秒激光脉冲的一个典型示例。 图2a，图2b 和 2c. 面板 2a 展示了跨阻放大器的输出及面板 2b 显示用星号（*）标示区间的时域扩展。采用峰值追踪算法检测荧光响应的峰值（红色）和基线（绿色）12基础荧光的测量可提供关于雪崩光电二极管暗电流以及环境光和电磁耦合引入干扰的信息。峰和基线的示意图如图所示。 图2c。 该图展示了染料（Rhod-2）与Ca结合后发出的荧光2+ 在一只跳动的鹦鹉心脏的心动周期中。

在第二种方法中，积分器的输出电压是电流和电容反馈的函数（图2d，图2e 和 2f). 图 2f 显示了两个连续的积分周期：第一个周期无外部光照，第二个周期施加了来自脉冲LED的光脉冲。详细描述见于 图2g 和 2 h. 这种方法虽然更为费力，但由于反馈电容中不存在热噪声，因而可提供更高的信噪比。该仪器包含一个时序模块，用于生成激发光的所有控制和多路复用信号，并控制前置放大器的积分和复位周期。该功能通常由数字信号处理电路实现，该电路还通过对积分输出信号进行数字微分计算来完成 在线 数据回归。在使用电阻反馈的情况下，可采用任何A/D采集板。

最后，我们的LFFM技术具有高度的通用性，可进行调整以同时记录多个区域的信号。在光路中加入一个分束器，可将光线分成两束，分别导入两根光学纤维。每根光纤可放置于组织的不同区域，独立地激发并记录外源性荧光探针的发射信号。这种改进使得我们能够评估解剖学上不同区域对生理参数的影响。图3展示了使用分束器将连续波（CW）激发光分束，从而利用两根光纤以微侵入方式测量心室壁跨壁电活动或细胞内[Ca2+]水平。通过将一根光纤置于心内膜，另一根置于心室外膜，即可记录跨壁信号。因此，LFFM技术能够测量不同区域细胞信号的时间进程，并可用于检测在病理状态下是否存在区域性变化。

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方案

本实验方案及所有小鼠操作均经加州大学默塞德分校机构动物照护与使用委员会批准（编号：2008-201）。1999年进行的鹦鹉实验遵循委内瑞拉科学研究所（IVIC）科学委员会制定的动物使用一般政策。

1. 兰格多夫装置的准备

  1. 配制含有以下溶质浓度（单位为 mM）的 Tyrode 溶液：140 NaCl、5.4 KCl、2 CaCl2、1 MgCl2、0.33 Na2HPO4、10 葡萄糖、10 HEPES。用 NaOH 将 Tyrode 溶液的 pH 值调节至 7.4，并通过 0.22 µm 滤器过滤溶液。
  2. 将 Tyrode 溶液装入 60 mL 注射器中，并灌注水平 Langendorff 装置11,12 的所有管路，装置示意图见图 4。确保排除所有气泡。
  3. 使用浸没在溶液中的塑料"气石"，用 100% O2 对 Tyrode 溶液进行平衡，如图 4 所示。
    1. 将塑料管路连接至 O2 气瓶。
    2. 添加一个塑料三通接头，将一根 5" 管插入 60 mL 注射器中的 Tyrode 溶液内。
    3. 在 5" 管末端安装一个塑料气石，使 O2 能以气泡形式进入 Tyrode 溶液中。
  4. 将不可吸收的外科缝线缠绕在用作插管的针头上。该针头连接至多通管（见图 4），用于不同溶液的逆行灌注。最后，将心脏的主动脉插至该针头中。

2. 动物准备与心脏解剖

  1. 在通过颈椎脱位实施安乐死后15分钟前，称重并给小鼠注射肝素（例如，体重20 g的小鼠注射20单位或200 µL）。根据您所在机构IACUC方案的动物使用指南对鹦鹉进行麻醉，然后实施颈椎脱位。
    ​注意：使用8周龄的小鼠或体重20 g的鹦鹉。
  2. 安乐死后从胸腔中取出心脏。鹦鹉心脏的提取方法与小鼠完全相同。
    1. 用乙醇清洁小鼠胸部。
    2. 使用解剖剪刀在下腹部做切口，然后沿两侧向上剪至颈部。
    3. 将切开的组织向后拉开并用针固定。
    4. 剪开膈肌。剪膈肌时需小心，避免损伤心脏。
    5. 移除肺部及周围组织。
    6. 使用镊子轻轻托起心脏，避免挤压。尽可能保留较长的主动脉并进行剪断。
  3. 将心脏置于含有约1 mL台氏液的小型称量皿中运输。
  4. 使用不可吸收的外科缝线，通过针头将主动脉固定在水平式兰格多夫装置上。在两把精细镊子的辅助下绑紧心脏主动脉。打开串联连接装有台氏液的60 mL注射器的阀门，开始逆行灌注。
  5. 让心脏稳定10分钟。利用此时间在加载染料前清除心脏周围的血液和脂肪组织。用镊子夹住心脏基部附近的脂肪组织，并用小型解剖剪刀剪除。务必在解剖显微镜下进行此操作。

3. 胞质 Ca​2+ 测定：Rhod-2AM 染料的配制

  1. 将20 µL的20% Pluronic（一种非离子型表面活性剂）DMSO溶液加入染料制造商提供的特殊包装塑料小瓶中，该小瓶内含50 µg染料。
  2. 通过移液器反复吹打混合，避免产生气泡。
  3. 将已混合的含非离子型表面活性剂和染料的DMSO溶液从特殊包装塑料小瓶转移至透明玻璃小瓶中，再向透明玻璃小瓶中加入1 mL Tyrode溶液。
  4. 在水浴超声仪中进行15–20分钟的超声处理。
  5. 使用蠕动泵在室温下灌注染料30分钟。
    1. 将染料放入染料室中。
    2. 使用机械夹夹闭连接到多通管的所有其他管路，夹子置于多通管上方，以防止液体倒流进入连接60 mL注射器的管路中。
    3. 启动灌注用蠕动泵，开始循环染料；立即关闭60 mL注射器下方的三通阀。
    4. 将连接至吸力蠕动泵的小管置于心脏附近，以回收已灌注进入心脏的染料并实现循环。

4. 肌浆网内 Ca​2+ 测定：Mag-Fluo4AM 染料的配制

  1. 以与Rhod-2AM相同的方式配制Mag-Fluo4AM。逐步操作说明请参见第3节。
  2. 染料负载后，打开与装有Tyrode溶液的60 mL注射器串联的阀门，开始逆行灌注。务必移除 manifold 上方的夹子。
  3. 向水平 chamber 中加入Tyrode溶液，并加热至37 °C。
  4. 用Tyrode溶液逆行灌注45分钟，以去除胞质中的染料。

5. 膜电位测量：Di-8-ANEPPS 染料的配制

  1. 向含有 5 mg 染料的染料瓶中加入 5 mL 的 99% 乙醇。
  2. 使用重复移液器将 10 µL 分装至 500 个独立的 1 mL 塑料小瓶中。
  3. 在真空浓缩仪中干燥，并于 -20 °C 保存。
  4. 向含有 10 µg 干燥染料的塑料小瓶中加入 20 µL 的 20% Pluronic DMSO 溶液。
  5. 通过上下吹打混合，避免产生气泡。
  6. 将含有 DMSO、Pluronic 和染料的混合液从塑料小瓶转移至量筒（10 mL），并用 Tyrode 溶液定容至 5 mL。
  7. 在水浴超声仪中超声处理 20–25 分钟。
  8. 使用蠕动泵灌注心脏 30 分钟。具体操作步骤参见第 3.5 节。

6 . 记录心外膜信号

  1. 加载染料后，通过移除多通管上方的夹子，用Tyrode溶液逆行灌注心脏。打开与装有Tyrode溶液的60 mL注射器串联的阀门。逆行灌注Tyrode溶液10分钟，以稳定心脏。
  2. 用Tyrode溶液填充水平浴槽，并打开帕尔贴装置，使浴槽温度升至37 °C。
  3. 将光纤置于心脏表面。
    1. 将光纤放入一支2 mL移液器内，然后将移液器固定在显微操作器上。
    2. 使用显微操作器将光纤轻轻压在左心室（LV）表面。
  4. 使用由波形发生器控制的刺激器对外部起搏心脏。
    1. 设置波形发生器输出宽度为1 ms的方波脉冲。
    2. 将刺激器设为外部同步模式，并将外部输入端连接至波形发生器。
    3. 将每根刺激器输出端连接一根导线，导线末端焊接有针灸针。
    4. 将两根针灸针插入心脏心尖部位，彼此相距约3 mm。
    5. 只有在针灸针插入组织后，方可打开刺激器输出，以防触电。
  5. 在采集软件中，将采集频率调整为10 kHz。

7 . 记录心内膜信号

  1. 参照步骤 6.1 和 6.2，在加载染料后稳定心脏。
  2. 使用一个尖锐的 23 号针头（大小与光纤相近），在左心室靠近室间隔的心脏表面打一个小孔。
  3. 放置玻璃体手术巩膜切口适配器，借助显微操作器将第一根光纤准确定位至心内膜。
  4. 对外部起搏心脏。参见步骤 6.4。
  5. 在采集软件中，将采集频率调整为 10 kHz。

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结果

心内膜和心外膜中的动作电位和Ca2+瞬变

为了比较心室壁跨壁的信号，将一根光纤置于心内膜，另一根置于心外膜。通过比较从心内膜和心外膜记录的动作电位形态，是评估跨壁功能的最佳方法。心室壁具有高度异质性，因此这两个区域的动作电位形态差异显著。众所周知，心内膜的 I到 比心外膜17,18,19越少我到 使心内膜1期复极化在末期变慢18,20. 图 5b 显示了从心内...

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讨论

本文重点介绍用于评估离体心脏肌细胞功能的局部场荧光技术。ex vivo条件下研究这些细胞不仅更具生理相关性，而且非常适合评估器官水平的病理状态。通过使用监测细胞内Ca​2+ 动态变化（如Rhod 2检测胞质Ca2+，Mag-Fluo4检测肌浆网Ca2+）和电活动（如di-8-ANEPPs）的分子探针，可在完整器官水平上评估兴奋-收缩耦联（ECC）相关的细胞事件。本文介绍了三种局部光纤荧光显微（LFFM）落射荧光技术，均采用光学纤维激发荧光指示剂并收集其发射光信号。这些技术根据所用光源和光调制类型的不同而有所区别：PLFFM使用脉冲激光光源，CLFFM使用连续激光光源，而LEDFM则使用LED光源，在PLEDFM中LED也可实现脉冲工作模式。所有这三种配置均在图1中作为一个整体系统展示，但也可仅选用其中一种落射荧光装置独立构建。此外，检测到的光信号可通过不同方式进行处理。例如，图2展示了两种不同情况：光电流可被积分处理，或通过电流-电压转换器直接转换为电压信号。总体而言，LFF...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢Alicia Mattiazzi博士对本研究工作的深入讨论。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助（项目编号：R01 HL-084487），资助对象为ALE。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
氯化钠Sigma7647-14-5
D-(+)-葡萄糖Sigma50-99-7
氯化钾Sigma7447-40-7
HEPESSigma7365-45-9
磷酸钠Sigma10049-21-5
氯化钙溶液Sigma10043-52-4
氯化镁溶液Sigma7786-30-3
氢氧化钠SigmaS-8045
0.2 μm 尼龙膜过滤器Whatman7402-004
Manifold MPPWarner64-0216 
21G1.5 精密滑动针头B-D305167
黑色编织丝线（不可吸收外科缝合线）AllMech TechLOOK-SP105
肝素钠注射液 1000USP/mLAllMech TechNDC63323-540-11
DMSO D8779Sigma67-68-5
BlebbistatinSigma856925-71-8
Pluronic F-127 20% 溶液Biotium59004
Materflex C/L 蠕动泵Cole-Parmer77122-26
Isostim 刺激器World Precision InstrumentsA320RC
波形发生器Teledyne LecroyWaveStation 2012
超声波清洗机 FS20Fisher Scientific1533530
Tygon 管道 内径:1/32" 外径:3/32" 壁厚 1/32"Component SupplyTET-031A
Tygon 管道 内径:3/32" 外径:5/32" 壁厚 1/32"Component SupplyTET-094A
鲁尔锁接头转三通阀Cole-ParmerEW-31200-80
三通接头和塑料连接件Cole-Parmer6365-90
塑料夹WaterZoo2465
帕尔贴元件TE TechnologyTE-127-2.0-2.5
Rhod-2AMThermoFisher ScientificR1245MP
Di-8-ANEPPSThermoFisher ScientificD3167
Mag-Fluo-4AMThermoFisher ScientificM14206
针灸针LHASATC1.20x13
60 mL BD 鲁尔锁注射器Fisher Scientific14-820-11
LabViewNational Instruments
离心式真空浓缩仪 Eppendorf VagufugeFisher Scientific07-748-13
数字信号处理电路 DSP TMS 320Texas Instrument
长通二向色镜 567 nmThorLabsDMLP567L
物镜 10X 数值孔径 0.25 DIN 消色差有限远国际标准物镜Edmund OpticsStock# 33-437
物镜 20X 数值孔径 0.40 DIN 消色差有限远国际标准物镜Edmund OpticsStock# 33-438
长通彩色玻璃滤光片 590 nm ThorLabsFGL590
绿色 Nd-YAG 激光器 532 nm，500 mW
激光用显微操作器SiskiyouMX130R
多模光纤 200 µm 数值孔径 0.39ThorLabsFT200UMT
蓝色 LEDLumiledsL135-B475003500000
绿色 LEDLumiledsL135-G525003500000
非偏振立方分束器ThorLabsBS007
36" 长度，燕尾槽光学导轨Edmund Optics54-402
2.5" 宽度，燕尾槽滑块Edmund Optics54-404
0.75" 行程，千分尺载物台Edmund Optics37-983
燕尾槽光学导轨 3"ThorLabsRLA075/M
燕尾槽导轨滑块 1"ThorLabsRC1
雪崩光电二极管 Helix 902Digi-KeyHELIX-902-200
物镜支架 XY 平移台 ThorLabsST1XY-S
铝制光学平台板 6" x 6"ThorLabsMB6
Nexus 光学平台 4' x 6'ThorLabsT46HK
不锈钢内六角圆柱头螺钉ThorLabsHW-KIT5/M
丙烯酸  板材Home Depot/Lowes
Sylgard 硅橡胶弹性体套件Dow CorningSylgard 184
环氧凝胶 Walmart/Home Depot2组分 5分钟固化 透明 1盎司
21G1.5 精密滑动针头B-D305167
23G 精密滑动针头B-D305145
安装底座，25 mm x 75 mm x 10 mmThorLabsBA1/M
金属丝层架立柱 36"AleraAALESW59PO36SR
金属丝层架AleraALESW582424SR
立柱和角度夹ThorLabsSWC/M-P5
染料室用玻璃注射器WheatonW851020
橡胶塞Home Science ToolsCE-STOP01C

参考文献

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