方法文章

局部场荧光显微技术：在完整心脏中成像细胞信号

DOI：

10.3791/55202

⸱

2017年3月8日

 ,  ,  , 
1School of Natural Sciences, University of California, Merced, 2Centro de Investigaciones Cardiovasculares, Universidad de la Plata and Conicet, 3Facultad de Ingenieria, Universidad Nacional de Entre Rios, 4Department of Physiology, Midwestern University, 5School of Engineering, University of California, Merced

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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在心脏中，分子事件协调着器官的电活动和收缩功能。本文介绍了一系列局部场荧光显微技术，可用于在完整心脏中记录细胞水平的变量。明确调控心脏功能的机制，对于理解心脏在病理状态下的工作方式至关重要。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在心脏研究中，分子信号研究通常在分离的心肌细胞中进行。然而，许多病理情况（如缺血和心律失常）只有在完整器官水平上才能得到充分理解。本文介绍了局部场荧光显微技术（LFFM），该技术可在完整心脏中检测细胞信号。该技术结合了Langendorff灌流心脏系统与光纤，用于记录荧光信号。LFFM在心血管生理学领域具有多种应用，可用于研究正常和病理状态下的心脏功能。通过使用不同的荧光指示剂，可同时监测多种心脏变量，包括胞质[Ca2+]、肌浆网内[Ca2+]以及膜电位。本文介绍了三种不同的LFFM落射荧光技术配置，用于激发外源性荧光探针并检测其发射荧光。这些技术的主要区别在于激发光源的类型以及激发光的调制方式。脉冲式LFFM（PLFFM）采用激光脉冲进行激发，而连续波LFFM（CLFFM）则使用连续激光进行激发。此外，还使用发光二极管（LED）作为第三种光源。这种非相干光源配置称为脉冲LED荧光显微技术（PLEDFM）。

引言

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心脏是心血管系统的核心器官。心脏的收缩由细胞内[Ca2+]升高所启动。电兴奋性与细胞内Ca2+释放变化之间的关系，传统上是在酶解分离的细胞中进行研究的1,2。然而，心肌细胞在电学、代谢和机械方面是相互耦合的3,4。当细胞被分离后，不仅失去了物理上的连接，而且在解离过程中来自不同心肌层的细胞也会混合在一起5。此外，尽管在电压钳条件下研究分离细胞带来了巨大优势6,7,8，但心脏作为电合胞体的固有特性始终引发一个问题：与组织中的心肌细胞相比，分离后的细胞在功能上是否存在差异3。

在本文中，我们描述了利用完整心脏中的局部场荧光显微技术（LFFM）在心脏生理学知识方面取得的进展。LFFM 使用荧光指示剂来测量多种生理变量，如胞质 Ca2+、肌浆网（SR）内 Ca2+ 以及膜电位。这些测量可....

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方案

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本实验方案及所有小鼠操作均经加州大学默塞德分校机构动物照护与使用委员会批准（编号：2008-201）。1999年进行的鹦鹉实验遵循委内瑞拉科学研究所（IVIC）科学委员会制定的动物使用一般政策。

1. 兰格多夫装置的准备

  1. 配制含有以下溶质浓度（单位为 mM）的 Tyrode 溶液：140 NaCl、5.4 KCl、2 CaCl2、1 MgCl2、0.33 Na2HPO4、10 葡萄糖、10 HEPES。用 NaOH 将 Tyrode 溶液的 pH 值调节至 7.4，并通过 0.22 µm 滤器过滤溶液。
  2. 将 Tyrode 溶液装入 60 mL 注射器中，并灌注水平 Langendorff 装置11,12 的所有管路，装置示意图见图 4。确保排除所有气泡。
  3. 使用浸没在溶液中的塑料"气石"，用 100% O2 对 Tyrode 溶液进行平衡，如图 4 所示。
    1. 将塑料管路连接至 O2 气瓶。
    2. 添加一个塑料三通接头，将一根 5" 管插入 6....

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结果

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心内膜和心外膜中的动作电位和 Ca2+瞬变

为了比较心室壁不同区域的信号，将一根光纤置于心内膜，另一根置于心外膜。通过比较从心内膜和心外膜记录的动作电位（AP）形态，是评估跨壁功能的最佳方法。心室壁具有高度异质性，因此这两个区域的动作电位形态存在显著差异。众所周知，心内膜的Ito电流小于心外膜17,18,19。较弱的Ito电流导致心内膜1相复极化过程较慢18,20。图5b

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讨论

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本文重点介绍用于评估离体心脏肌细胞功能的局部场荧光技术。ex vivo条件下研究这些细胞不仅更具生理相关性，而且非常适合评估器官水平的病理状态。通过使用监测细胞内Ca​2+ 动态变化（如Rhod 2检测胞质Ca2+，Mag-Fluo4检测肌浆网Ca2+）和电活动（如di-8-ANEPPs）的分子探针，可在完整器官水平上评估兴奋-收缩耦联（ECC）相关的细胞事件。本文介绍了三种局部光纤荧光显微（LFFM）落射荧光技术，均采用光学纤维激发荧光指示剂并收集其发射光信号。这些技术根据所用光源和光调制类型的不同而有所区别：PLFFM使用脉冲激光光源，CLFFM使用连续激光光源，而LEDFM则使用LED光源，在PLEDFM中LED也可实现脉冲工作模式。所有这三种配置均在图1中作为一个整体系统展示，但也可仅选用其中一种落射荧光装置独立构建。此外，检测到的光信号可通过不同方式进行处理。例如，图2展示了两种不同情况：光电流可被积分处理，或通过电流-电压转换器直接转换为电压信号。总体而言，LFF.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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感谢Alicia Mattiazzi博士对本研究工作的深入讨论。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助（项目编号：R01 HL-084487），资助对象为ALE。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
氯化钠Sigma7647-14-5
D-(+)-葡萄糖Sigma50-99-7
氯化钾Sigma7447-40-7
HEPESSigma7365-45-9
磷酸钠Sigma10049-21-5
氯化钙溶液Sigma10043-52-4
氯化镁溶液Sigma7786-30-3
氢氧化钠SigmaS-8045
0.2 μm 尼龙膜过滤器Whatman7402-004
Manifold MPPWarner64-0216 
21G1.5 精密滑动针头B-D305167
黑色编织丝线（不可吸收外科缝合线）AllMech TechLOOK-SP105
肝素钠注射液 1000USP/mLAllMech TechNDC63323-540-11
DMSO D8779Sigma67-68-5
BlebbistatinSigma856925-71-8
Pluronic F-127 20% 溶液Biotium59004
Materflex C/L 蠕动泵Cole-Parmer77122-26
Isostim 刺激器World Precision InstrumentsA320RC
波形发生器Teledyne LecroyWaveStation 2012
超声波清洗机 FS20Fisher Scientific1533530
Tygon 管道 内径:1/32" 外径:3/32" 壁厚 1/32"Component SupplyTET-031A
Tygon 管道 内径:3/32" 外径:5/32" 壁厚 1/32"Component SupplyTET-094A
鲁尔锁接头转三通阀Cole-ParmerEW-31200-80
三通接头和塑料连接件Cole-Parmer6365-90
塑料夹WaterZoo2465
帕尔贴元件TE TechnologyTE-127-2.0-2.5
Rhod-2AMThermoFisher ScientificR1245MP
Di-8-ANEPPSThermoFisher ScientificD3167
Mag-Fluo-4AMThermoFisher ScientificM14206
针灸针LHASATC1.20x13
60 mL BD 鲁尔锁注射器Fisher Scientific14-820-11
LabViewNational Instruments
离心式真空浓缩仪 Eppendorf VagufugeFisher Scientific07-748-13
数字信号处理电路 DSP TMS 320Texas Instrument
长通二向色镜 567 nmThorLabsDMLP567L
物镜 10X 数值孔径 0.25 DIN 消色差有限远国际标准物镜Edmund OpticsStock# 33-437
物镜 20X 数值孔径 0.40 DIN 消色差有限远国际标准物镜Edmund OpticsStock# 33-438
长通彩色玻璃滤光片 590 nm ThorLabsFGL590
绿色 Nd-YAG 激光器 532 nm，500 mW
激光用显微操作器SiskiyouMX130R
多模光纤 200 µm 数值孔径 0.39ThorLabsFT200UMT
蓝色 LEDLumiledsL135-B475003500000
绿色 LEDLumiledsL135-G525003500000
非偏振立方分束器ThorLabsBS007
36" 长度，燕尾槽光学导轨Edmund Optics54-402
2.5" 宽度，燕尾槽滑块Edmund Optics54-404
0.75" 行程，千分尺载物台Edmund Optics37-983
燕尾槽光学导轨 3"ThorLabsRLA075/M
燕尾槽导轨滑块 1"ThorLabsRC1
雪崩光电二极管 Helix 902Digi-KeyHELIX-902-200
物镜支架 XY 平移台 ThorLabsST1XY-S
铝制光学平台板 6" x 6"ThorLabsMB6
Nexus 光学平台 4' x 6'ThorLabsT46HK
不锈钢内六角圆柱头螺钉ThorLabsHW-KIT5/M
丙烯酸  板材Home Depot/Lowes
Sylgard 硅橡胶弹性体套件Dow CorningSylgard 184
环氧凝胶 Walmart/Home Depot2组分 5分钟固化 透明 1盎司
21G1.5 精密滑动针头B-D305167
23G 精密滑动针头B-D305145
安装底座，25 mm x 75 mm x 10 mmThorLabsBA1/M
金属丝层架立柱 36"AleraAALESW59PO36SR
金属丝层架AleraALESW582424SR
立柱和角度夹ThorLabsSWC/M-P5
染料室用玻璃注射器WheatonW851020
橡胶塞Home Science ToolsCE-STOP01C

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fabiato, A., Fabiato, F. Contractions induced by a calcium-triggered release of calcium from the sarcoplasmic reticulum of single skinned cardiac cells. J Physiol. 249 (3), 469-495 (1975).
  2. Mitra, R., Morad, M.

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