斑马鱼中高血糖的急性和慢性模型：评估高血糖对神经发生及放射性标记分子生物分布影响的方法

摘要

本研究描述了在斑马鱼中建立急性与慢性高血糖模型的方法。目的是研究高血糖对生理过程的影响，例如稳态神经发生及损伤诱导的神经发生。本研究还强调了利用斑马鱼结合正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（PET/CT）技术追踪放射性标记分子（此处为[¹⁸F]-FDG）的应用。

摘要

高血糖是一种导致心血管和脑功能障碍的主要健康问题。例如，高血糖与卒中后神经系统并发症风险增加相关，并被证实会损害神经发生过程。有趣的是，成年斑马鱼最近被确立为模拟高血糖/糖尿病以及研究基础性和再生性神经发生的相关且有用的模型。本研究提供了建立高血糖斑马鱼模型的方法，以探讨高血糖在稳态和脑修复条件下对脑细胞增殖的影响。急性高血糖通过向成年斑马鱼腹腔注射D-葡萄糖（2.5 g/kg体重）建立。慢性高血糖则通过将成年斑马鱼浸入含D-葡萄糖（111 mM）的水中持续14天来诱导。文中描述了针对上述不同方法的血糖水平测定技术。此外，还演示了研究高血糖对基础性和再生性神经发生影响的方法，包括端脑的机械损伤操作、脑组织解剖、石蜡包埋及切片机切片，以及免疫组织化学实验流程。最后，本文还介绍了利用斑马鱼作为研究放射性标记分子（此处为[¹⁸F]-FDG）在体内分布情况的相关模型，并采用PET/CT进行检测的方法。

引言

高血糖是指血糖水平过高。尽管它可能反映一种急性应激状态，但高血糖也是一种常导致糖尿病诊断的状况，糖尿病是一种胰岛素分泌和/或作用抵抗的慢性疾病。2016年，全球患有糖尿病的成年人数量已达4.22亿，每年有150万人死于该疾病，使其成为一个重大的健康问题¹。事实上，未受控制的糖尿病会导致多种生理紊乱，影响心血管系统、肾脏以及周围和中枢神经系统。

有趣的是，急性和慢性高血糖可能改变认知功能，并促进痴呆和抑郁症的发生^2,3,4,5,6。此外，高血糖患者在发生缺血性脑卒中后，其功能预后、神经功能恢复及生存率均较差^7,8,9,10,11。另有研究显示，高血糖/糖尿病通过影响神经干细胞活性以及新生....

方案

野生型成年斑马鱼（Danio rerio）在标准光照周期（14/10 小时明/暗）和温度（28 °C）条件下饲养。所有实验均遵循法国及欧洲共同体关于实验动物使用指南（86/609/EEC 和 2010/63/EU），并经当地实验动物伦理委员会批准。

1. 建立斑马鱼急性高血糖模型

1. 通过将400 mg三卡因（MS-222）粉末溶解于97.9 mL水中和2.1 mL 1 M Tris/HCl缓冲液（pH 9）中，配制三卡因储备液。调节pH至7，分装后于-20 °C保存。
2. 取5 mL三卡因储备液加入100 mL鱼用水中，配制成成年斑马鱼麻醉液（终浓度：0.02%三卡因）。
3. 将一条斑马鱼（3至6月龄）从养殖缸转移至麻醉液中，直至其停止活动。
4. 使用剪口的移液器取出鱼体，并用吸水纸迅速擦干。
5. 称量鱼体重量。
6. 准备一支含有D-葡萄糖溶于1×PBS中的注射器，按2.5 g/kg体重剂量注射50 µL D-葡萄糖溶液。
   注意：例如，一条0.6 g重的鱼将接受50 µL 3% D-葡萄糖/PBS溶液。
7. 将鱼体翻转至背部朝上，将注射器针头插入腹腔内。
8. 缓慢注入D-葡萄糖/PBS溶液，随后将鱼放回水中。
9. 观察鱼体直至其完全恢复，然后将其放回养殖缸，直至达到进行血糖测定所需的时间。

结果

采用本文所述方法，对成年斑马鱼进行腹腔注射D-葡萄糖（2.5 g/kg体重），注射后1.5小时，其血糖水平显著升高（图1A）。注射24小时后，D-葡萄糖处理组与PBS对照组斑马鱼的血糖水平相似¹²。对于慢性处理，将斑马鱼浸入含D-葡萄糖的水溶液（111 mM）中，连续处理14天后出现高血糖状态（图1B），该结果与先前研究一致^12,22。

为了研究高血糖对脑细胞增殖的影响，在诱导斑马鱼急性及慢性高血糖后，对其脑组织进行了PCNA免疫组织化学检测。尽管急性高血糖并未影响脑细胞的增殖¹²，但慢性高血糖显著降低了脑室周围神经干细胞的.......

讨论

本研究描述了在斑马鱼中建立高血糖急性和慢性模型的多种方法。这些方法的主要优势在于：（1）可减少研究中使用的哺乳动物数量；（2）操作简便且实施快速；（3）经济高效。因此，此类模型可用于在大量动物中研究高血糖对多种生理过程的影响，包括动脉粥样血栓形成、心血管功能障碍、视网膜病变、血脑屏障渗漏以及稳态和再生性神经发生。本文详细介绍了在正常或损伤诱导条件下，开展高血糖对脑细胞增殖影响研究的具体操作流程。

慢性高血糖处理的一个关键局限性在于，在某些实验中，部分斑马鱼在长期浸入D-葡萄糖水（111 mM，持续14天）后并未表现出高血糖。Dorsemans及其同事（2016年）此前估计，有反应和无反应的鱼类比例分别为83%和17%。这种差异可能与个体鱼的年龄、性别以及通过生成更多胰腺β细胞来代偿高血糖的能力不同所致的易感性差异有关^34,35。对于急性高血糖模型，注射后1.5小时血糖水平较为均一，表明该方法具有良好的可重复性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 鲁尔锁注射器	BD, USA	309628
4',6'-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）	Sigma-Aldrich, Germany	D8417
7 mL 小型平口实验室容器	Dutscher, France	080171
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich, Germany	67021
数码相机	Life Sciences, Japan	Hamamatsu ORCA-ER
一次性底模	Simport, Canada	M475-2
驴抗兔 Alexa Fluor 488	Life Technologies, USA	A21206
包埋中心	Thermo Scientific, USA	Shandon Histocentre 3
荧光显微镜	Nikon, Japan	Eclipse 80i
氟脱氧葡萄糖（18F-FDG）	Cyclotron, France
血糖仪测试条	LifeScan, France	One-Touch 143 Ultra
羊抗鼠 Alexa Fluor 594	Life Technologies, USA	A11005
活体成像系统	TriFoil Imaging, Canada	Triumph Trimodality
切片机	Thermo Scientific, USA	Microm HM 355 S
单克隆小鼠抗PCNA抗体	DAKO, USA	克隆 PC10
多聚甲醛（PFA）	Sigma-Aldrich, Germany	P6148-500G
多克隆兔抗GFAP抗体	DAKO, USA	Z033429
载玻片干燥台	Electrothermal, USA	MH6616
氯化钠	Sigma-Aldrich, Germany	S9888
柠檬酸三钠二水合物	Prolabo, France	27833.294
无菌针头	BD Microlance 3	30 G 1/2 ; 0.3 mm× 13 mm
学生型 Dumont #5 镊子	Fine Science Tools	91150-20
学生外科剪刀	Fine Science Tools	91400-14
Superfrost Plus Gold 载玻片	Thermo Scientific, USA	FT4981GLPLUS
手术显微镜	Leica, France	M320-F12
组织包埋盒	Simport, Canada	M490-10
组织包埋介质	LeicaBiosystems, USA	39602004
甲苯	Sigma-Aldrich, Germany	244511
三卡因 MS-222	Sigma-Aldrich, Germany	A5040
吐温 X-100	Sigma-Aldrich, Germany	X100-500 mL
Vectashield 封片剂	Vector Laboratories, USA	H-1000
二甲苯	Sigma-Aldrich, Germany	534056
鱼类品系	AB
磷酸盐缓冲盐水（10X PBS），pH 7.4（配制1升）			配制10X PBS时，加入以下盐类，并用蒸馏水定容至1升
氯化钾（分子量：74.55 g/mol）：2.00 g	Sigma-Aldrich, Germany	746436
磷酸二氢钾（分子量：136.09 g/mol）：2.40 g	Sigma-Aldrich, Germany	795488
氯化钠（分子量：58.44 g/mol）：80.00 g	Sigma-Aldrich, Germany	S9888
磷酸氢二钠（分子量：141.96 g）：14.40 g	Sigma-Aldrich, Germany	795410