基于“针转法”的经济型DNA递送系统的开发及其在皮肤研究中的应用

摘要

本方案是一种在小鼠皮肤中表达裸质粒DNA的经济有效替代方法。该方案的总体目标是将免疫相关基因递送至皮肤组织，以阐明特定基因在皮肤炎症中的功能作用。

摘要

皮肤免疫反应的失调与多种人类皮肤疾病相关。将免疫相关基因直接转移至皮肤组织，是研究人类疾病小鼠模型中皮肤炎症免疫调控的一种引人注目的方法。本文介绍一种经济高效的方案，可在小鼠皮肤中递送裸DNA并实现外源基因的表达。该方法被称为 "acufection"，表示 acu穿刺介导的DNA转染感染. 进行基因针刺转染时，先将小鼠皮肤浸润于含DNA的磷酸盐缓冲液（PBS）中，随后用一束针灸针轻轻刺破皮肤，以促进DNA吸收并实现细胞转染。质粒DNA可能被皮肤中的角质形成细胞和树突状细胞（DCs）摄取，并表达为蛋白质。针刺造成的机械性穿刺 本身 未引起皮肤损伤或角质形成细胞活化。转染基因的表达在针刺转染后2天即可在皮肤组织中检测到，且在转录和翻译水平均可持续维持至7天。开发该针刺转染技术的主要目的是研究一种此前尚未明确的IL-15异构体。利用该方法，可在皮肤中表达一种外显子7部分缺失的IL-15选择性剪接异构体（IL-15ΔE7），随后使用Toll样受体7（TLR7）激动剂咪喹莫特（IMQ）诱导炎症反应。通过针刺转染在皮肤中递送的IL-15ΔE7可抑制IMQ诱导的皮肤炎症中角质形成细胞的增殖、表皮增厚以及中性粒细胞的募集。随着人们对皮肤炎症调控机制的研究兴趣日益增加，本文所述方案为基因枪系统或微粒轰击法进行DNA递送提供了一种经济且多功能的替代方法。 在体它可能有助于发现皮肤中一个新基因的功能，或用于研究皮肤疾病的新疗法。

引言

皮肤是宿主防御的第一道防线。角质形成细胞（KCs）是人类和小鼠皮肤中的主要细胞类型。在环境刺激（例如阳光、氧气、化学物质和病原体侵入）作用下，KCs被激活，并产生多种促炎性细胞因子和趋化因子，如IL-8、IL-6、IL-1α、IL-1β、TNF-α和GM-CSF¹。这些因子共同作用，触发免疫细胞向皮肤募集。加重的皮肤炎症常与多种人类疾病相关，包括急性异位性接触性皮炎和慢性T细胞介导的炎症（例如变应性接触性皮炎和银屑病）²。通过抑制KC的活化来调节皮肤中的促炎反应，是治疗皮肤炎症的一种可行策略。本实验方案描述了一种在表皮中瞬时表达细胞因子基因的新方法，以研究此类处理对皮肤免疫反应的影响。

表皮构成皮肤的最表层，作为物理屏障，可阻止核酸和病原体等外来物质进入皮肤深层。目前已建立多种无针技术用于表皮DNA转导。^3,4将溶液中的DNA或与阳离子脂质体或腺病毒载体结合的DNA直接应用于经处理修饰的表皮，处理方法包括去除角质层或使用脱毛试剂。去除角化的上皮层有助于DNA穿越表皮屏障，并与角质形成细胞和朗格汉斯细胞相互作用，从而诱导免疫反应⁵虽然该方法具有较大的DNA转递表面积且无需使用针头，但仍....

方案

本研究使用8至12周龄的雌性小鼠。C57/BL6野生型（WT）小鼠和IL-15缺陷型（Il15^-/-）小鼠分别购自中国台湾国家实验动物中心（NLAC）和Taconic Farm。IL-15缺陷型（Il15-/-）与IL-15优势型（Il15+/- 和 Il15+/+）在Il15+/-杂合子交配后的第二代中呈现1:3的比例。通过PCR分析确认Il15-/-小鼠的基因型。小鼠饲养于台湾大学医学院实验动物中心（LAC）的特定病原体阴性（SPF）设施中。所有动物实验操作，包括麻醉剂材料与方法，均依照台湾大学医学院及公共卫生学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准的动物实验方案（动物实验许可证明书编号：20130225）进行。

1. 针灸针的准备

注意：针灸针是由针柄和针尖组成的医疗器械（图1A）。针灸针的直径范围为0.2 mm（36 G）至0.35 mm（28 G）。我们选用最细的针尖，以避免刺破皮肤时可能造成的过度细胞损伤。0.2 mm直径的针有4种不同长度，分别为13 mm（0.5英寸）、25 mm（1.0英寸）、40 mm（1.5英寸）和50 mm（2.0英寸）。在C57BL/6小鼠皮肤上进行针体摆动操作时，使用一束10根、长度为13....

结果

尽管在使用针灸针穿刺后一小时内可见一定程度的发红，但皮肤在第2天即恢复正常，且穿刺后至第7天未观察到任何不良皮肤反应（图2A）。与未处理皮肤相比，苏木精-伊红（H&E）分析显示，针刺仅引起极轻微的表皮正角化及最小程度的真皮浸润（图2B）。针刺部位皮肤与未处理皮肤的表皮厚度（图2C）以及Ki67⁺细胞数量（图2D）相当，表明针灸针穿刺未导致表皮明显的组织破坏或细胞增殖。与注射器针头（直径1.067 mm）¹²相比，使用针灸针穿刺后第2天趋化因子CXCL-1和促炎性细胞因子IL-6的表达水平降低，并在第5天持续下降（图3A）。为验证经穴转染（acufection）在小鼠皮肤中对外源基因的表达效果，将表达I.......

讨论

确保经针刺转染的质粒DNA表达的最关键步骤是均匀地振荡并松解皮肤的角质层。在轻柔推动针头而不刺破皮肤的同时，施加的力量应足以使皮肤表面下陷。为了促进10 μL溶液在1 cm × 1 cm表面积上的DNA吸收，针头应在30秒内上下振荡约100次。操作者可通过观察刺入皮肤所需的力量以及获得最佳基因表达水平所需的针刺次数，来确定合适的操作参数。

由于不同基因的表达水平可能存在差异，转染后为达到理想的表达水平，可能需要调整所用质粒DNA的用量。此外，应在实验前通过梯度实验确定质粒DNA的最佳使用量。定量RT-PCR分析结果将有助于确定质粒DNA的最佳用量以及获得可重复结果的最佳条件。

针刺转染过程的精确机制仍有待阐明。尽管外源递送的质粒DNA在剃毛和脱毛皮肤中可发生低水平的转录，但通过针灸针穿刺可显著提高转染效率（图3B）。类比纹身枪多次穿孔的微接种方案¹¹，针刺转染递送的质粒DNA可能通过刮擦角质形成细胞和毛囊细胞膜而得以促进.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Accu Handy 针头	Accu	36Gx0.5	医疗器械
NairTM 乳液	Church & Dwight	N/A	用于脱毛
Shandon 二甲苯替代液	Thermo Fisher Scientific	6764506	脱石蜡
Avertin（2,2,2-三溴乙醇）	Sigma-Aldrich	T4,840-2	麻醉剂
2-甲基-2-丁醇	Sigma-Aldrich	152463	溶解 Avertin 的溶剂
DifcoTM LB 肉汤，Miller	BD	244620	用于分子生物学中 E. coli 的扩增与维持
小鼠 IL-15/IL-15R 复合物 ELISA Ready-SET-Go 试剂盒	eBioscience	88-7215	检测 IL-15 蛋白
抗小鼠 Ly6G 抗体	BioLegend	127601	用于免疫组织化学染色的抗体
抗小鼠 Ki-67 抗体	eBioscience	14-5698-80	用于免疫组织化学染色的抗体
Simple Stain 小鼠 MAXPO（大鼠源）	Nichirei Biosciences	414341F	用于阻断小鼠组织上小鼠源抗体染色中的背景信号
DAB 过氧化物酶（HRP）底物试剂盒	Vector Laboratories	SK-4100	免疫组织化学染色用过氧化物酶底物
Ultra V 阻断剂	Thermo Fisher Scientific	TA-060-UB	减少非特异性背景染色
甲基绿	Sigma-Aldrich	M8884	细胞核染色
Vecta MountTM	Vector Laboratories	M-5000	永久保存组织化学染色结果
蛋白酶抑制剂混合片剂	Roche	04-693-116-001	抑制细胞裂解液中的蛋白酶活性
Aldara 乳膏	3M Pharmaceuticals	N/A	5% 咪喹莫特乳膏
Bessman 组织研磨器	Spectrum Labs	189475	用于粉碎皮肤组织
ABI7900HT 定量 PCR 仪	Thermo Fisher Scientific	N/A	实时定量 PCR 检测
摄像机	Panasonic	HDC-SD60	图像记录
Axio Scope.A1 显微镜	ZEISS	N/A	明场显微镜观察