向兔乳腺导管内递送

摘要

本文介绍了一种通过导管内注射将试剂局部递送至兔乳腺的技术。此外，我们还描述了一种利用高分辨率超声成像对造影剂进行可视化并确认递送效果的实验方案。

摘要

乳腺癌的局部导管内治疗具有潜在优势，包括对肿瘤的高效递送以及降低全身毒性和不良反应^{1,2,3,4,5,6,7}。然而，在这些治疗方法得以更广泛应用之前，仍存在若干挑战。在合适的动物模型中开发和验证导管内治疗手段，有助于推动患者导管内治疗策略的发展。尽管小鼠乳腺已被广泛用作乳腺发育和肿瘤发生的研究模型，但其解剖结构与人类乳腺存在显著差异。较大的动物模型（如兔）可能更适于模拟人类乳腺结构，并更有利于导管内治疗的研发。与小鼠沿体轴分布、每条导管树终止于独立乳头的十组导管系统不同，兔的乳腺结构更接近人类，具有多个重叠的导管系统，通过单个乳头上的不同开口排出。本文介绍了将试剂直接递送至兔乳腺导管的微创方法，并利用高分辨率超声成像对递送过程进行可视化观察。

引言

导管内递送治疗剂已在啮齿类动物模型和早期人体试验中进行了研究^{3,4,5,6,11,12}。最近一项I期研究表明，在等待乳房切除术以治疗浸润性癌症的女性中，导管内给予卡铂或聚乙二醇化脂质体阿霉素具有安全性和可行性²。

既往已针对小鼠和大鼠乳腺组织开发出导管内递送的相关实验方案^6,7,8,9。出于研究目的，导管内肿瘤细胞注射以及通过慢病毒载体递送癌基因的操作也已在啮齿类动物模型中实现^13,14,15,16。然而，理想的导管内递送过程的体内模型应能够支持新型治疗化合物的开发，并有助于临床前评估。由于啮齿类动物与人类之间存在解剖学差异，这些研究的转化应用受到限制。

与小鼠每个导管末端分别连接一个乳头不同，人类乳腺由5到9个独立的导管系统组成，每个系统均通过一个独立的开口通向乳头。兔乳腺含有四个独立的导管系统，每个系统均可通过单个乳头上的四个开口之一单独进入。兔模型在解剖结构上更接近人类，可为导管内药物递送的研究提供更为相关的研究背景。

本文采用两种技术评估导管内递送效果。通过共注射一种活性染料，可经皮肤观察染料分布，从而对递送方法进行简单快速的验证。对于某些应用，可能需要更高分辨率的导管成像。本文介绍了一种通过导管内递送非靶向对比剂进行超声成像以实现导管高分辨率显影的实验方案。

方案

使用动物受试者的实验程序已获得德克萨斯大学奥斯汀分校机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 术前准备

1. 记录每只兔子的体重。与所有临床前研究一样，需定期监测动物体重，以评估潜在的毒性反应。
2. 在对兔子进行麻醉前，取50 mL锥形管加入市售超声耦合剂，以500 × g离心30秒；离心结束后，凝胶中应无可见气泡。
3. 皮下注射格隆溴铵，剂量为0.1 mg/kg，同时肌肉注射乙酰丙嗪，剂量为0.75 mg/kg。给药后等待15–20分钟，待镇静剂起效，期间持续监测生命体征和行为表现。
   注意：格隆溴铵是一种抗胆碱能药物，可预防心动过缓，并减少呼吸道和胃肠道分泌物。乙酰丙嗪是一种镇静剂，作为麻醉前用药。
4. 皮下注射氯胺酮35 mg/kg和赛拉嗪5 mg/kg作为麻醉剂。然而，随着操作者经验的积累，若能更快完成导管内给药操作，可将药物剂量减少至氯胺酮15 mg/kg和赛拉嗪3 mg/kg（均为皮下注射）；这将缩短麻醉时间以及动物从麻醉中恢复所需的时间。
5. 每15分钟检查并记录一次心率、SPO_2, 体温、呼吸频率及黏膜颜色。双眼均应涂抹眼用润滑剂。
   注意：仅允许接受过适当培训并经所在机构IACUC批准的人员进行麻醉给药或监测。使用兽用麻醉监护仪有助于获取生命体征，建议使用；但兽用麻醉监护仪不能替代每15分钟对动物进行一次人工检查。请参阅制造商说明书，了解兽用监护仪的正确使用方法。
6. 通过轻捏脚趾确认麻醉起效；在继续操作前，兔子应无反应。
7. 小心剃除兔子腹部尾侧第三和第四对腹股沟乳头周围区域的毛发。
8. 在大部分毛发去除后，于剃毛区域涂抹市售脱毛膏。涂抹后10分钟，用浸有温水的纸巾擦去脱毛膏。
   注意：兔子皮肤非常脆弱且敏感。脱毛膏使用时间不应超过10分钟。实际上，更安全的做法是在5分钟时尝试“测试小区域”，仅当测试结果表明需要更长时间时，才延长停留时间。
9. 用酒精浸湿的纱布擦拭局部，清洁注射部位。
10. 将兔子仰卧置于V型槽内，槽内铺有循环温水毯和吸水垫。

2. 对比剂的制备

1. 根据制造商说明书重构非靶向对比试剂。轻轻吹打混匀。
   注意：本方案中使用的对比剂在重构后于室温下可稳定保存 4 - 6 小时。每次取用时应轻轻摇动小瓶。
   注意：所需溶液体积取决于拟注射的导管数量。每乳头有 4 个导管开口，0.2 mL 溶液足以灌注一只成年新西兰白兔（Oryctolaguscuniculus）的一棵导管树。因此，单侧乳腺可给予总量为 0.8 mL 的溶液。

3. 导管内递送

1. 找到需要注射的适当乳头；第3个^rd 和 4^th 建议选用腹股沟乳头对，因为当动物仰卧时，这些乳头易于观察。
2. 将0.2 mL无菌0.9%生理盐水加入带有22 G针头的1 mL鲁尔锁型结核菌素注射器中。生理盐水装入注射器后，妥善处理22 G针头，并更换为无菌25号针头。用浸有85%异丙醇的纱布轻轻擦拭局部区域。
3. 针尖斜面朝上，注射器与动物体平行，将针尖斜面插入乳头侧面，缓慢注入0.1–0.2 mL生理盐水；这有助于更清晰地观察导管开口。
4. 将0.2 mL注射液装入1 mL鲁尔锁型结核菌素注射器中。
5. 用拇指和食指轻轻握住乳头，并略微提起，以便进行导管内注射；佩戴式眼用放大镜有助于观察导管开口。
6. 在保持乳头抬高位置的同时，使用25 G钝头针小心地插入目标导管。
7. 插管后，轻轻旋转鲁尔锁注射器，将其连接到钝头灌注针的接头上，直至锁定到位。
8. 抬起乳头，缓慢注入溶液，以尽量减少因导管内液体快速流动可能造成的损伤；注射过程中不应遇到任何阻力。

4. 超声成像

1. 在目标区域的皮肤上涂抹足量的离心超声耦合剂。确保耦合剂中无气泡，因为气泡会影响图像质量。
2. 将成像深度设置为 6 mm。将 21-MHz 探头接触耦合剂，以 B 模式扫描目标区域。观察扫描区域内包括导管开口及整个导管中的造影剂情况。
   注意：这些参数设置是针对特定的光声超声成像设备而优化的。更多细节请参见材料表。对于其他成像系统，可能需要调整发射功率和成像深度，以优化乳腺组织的可视化效果。
3. 用纱布擦拭动物皮肤上的超声耦合剂。

5. 术后护理

1. 观察注射部位：乳头区域及周围组织应无任何创伤迹象，若乳头周围出现肿胀，可能表明注射进入了乳腺脂肪垫，而非成功的导管内注射。
2. 将家兔置于胸卧位。如有需要，可通过耳缘静脉注射给予0.2 mg/kg的育亨宾；这将逆转赛拉嗪的作用，使动物更快从麻醉中恢复。
3. 在恢复期间每15分钟监测一次家兔，直至动物清醒、有反应并能维持胸卧位。
   注意：该操作不应导致组织损伤或肿胀。若观察到红肿现象，待动物清醒并能够口服药物后，给予美洛昔康0.1–0.2 mg/kg，口服一次。如有需要，请联系机构的兽医人员以获取进一步指导。

结果

本研究显示，可通过导管内递送造影剂至兔乳腺导管，且不会对组织造成损伤（图2）。在兔体内，四个独立的导管系统汇聚于一个乳头，因此可利用该方法分别进入并成像。单个导管开口易于观察；请注意 图2B 中箭头所示位于插管导管旁的另一导管开口。

在直线成像模式下，使用非靶向对比试剂进行高分辨率超声成像可实时显示导管内递送过程。代表性图像显示，递送后长达45分钟仍可检测到试剂（图3）。该技术还可用于监测通过导管递送治疗剂的动力学过程。

该注射方法的可靠性在很大程度上取决于操作者。为了掌握注射技术，建议先注射0.2%伊文思蓝染料溶液，并监测腺体的完整性。这可为操作者提供额外的成功判断指标，同时有助于确定向每条腺体注射的合适体积。可通过简单的肉眼观察...

讨论

这种向兔乳腺导管内递送的方法可用于超声造影剂以及许多其他水溶液，包括活性染料和治疗药物。既往研究已证明可通过导管内途径递送激素^17,18,19。在啮齿类动物模型中，已实现核酸⁸、化疗药物^6,7以及纳米颗粒载体^8,20的导管内递送。本文所述方案也可根据需要调整用于上述各类应用。

对于某些应用，通过皮肤观察伊文思蓝活性染料来确认导管内递送可能已足够。然而，经皮肤观察的成像较为弥散，无法清晰区分单个导管。在终点实验中，伊文思蓝活性染料虽能提供整个导管树的清晰图谱，但需要分离乳腺组织。因此，在活体动物研究中，增强超声成像为可视...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MicroMarker 非靶向对比试剂	VisualSonics	VS-11694
鲁尔锁1 mL注射器	BD	309628
格隆溴铵 0.2 mg/mL	Wedgewood 复合药房	GLYCOP-INJ013VC	保质期6个月，供应可能有限。
硫酸阿托品 0.5 mg/mL	Animal Health International	15320764	若无法获得格隆溴铵时使用。不得与格隆溴铵联合使用。
盐酸氯胺酮 100 mg/mL	Animal Health International	21250699	http://www.animalhealthinternational.com/
乙酰丙嗪 10 mg/mL	Animal Health International	17640541
赛拉嗪 20 mg/mL	Animal Health International	20101547
育亨宾 0.2 mg/mL	Animal Health International	14588965
脱毛膏	Veet		适用于敏感肌肤。可通过本地零售商购买。
钝头输注针头	Sai Infusion Technology	B14-50	http://www.sai-infusion.com/collections/blunt-needles
兽用脉搏血氧仪	EdanUSA	VE-H100B	http://www.edanusa.com/Product/VE-H100B-Veterinary-Pulse-Oximeter.html
温水循环泵	Gaymar	TP700
温水毯	Animal Health International	21232696	Maxi-Therm Lite 加热垫
超声成像系统	VisualSonics	Vevo 2100