一种用于斑马鱼发育长期成像的通用固定方法

摘要

本文介绍了一种通用的固定方法，可在不干扰斑马鱼胚胎正常发育的情况下，实现对活体斑马鱼胚胎后部体轴发育过程的长期延时成像。

摘要

斑马鱼胚胎因其易于获取和光学透明性，为研究复杂的形态发生过程提供了理想的实验体系。特别是体轴后部的延伸，是胚胎发育中的一个关键过程，多种组织形变协同作用，指导身体大部分轴向结构的形成。为了通过长期延时成像观察这一过程，必须采用一种固定技术，能够在将样品转移至显微镜及成像过程中提供足够的支撑，以维持其正确的空间取向。此外，固定方式还必须为体轴后部区域的延伸提供足够的活动空间，而不影响其正常发育。最后，该固定方法还需具备一定的通用性，以适用于多种成像系统。本文介绍了一种用于成像斑马鱼D. rerio体轴后部延伸发育的固定技术。该方法将胚胎固定于琼脂糖中，使其头部和卵黄囊区域几乎完全包埋，而体轴后部则暴露在外，以实现正常延伸和发育。我们将展示该方法如何适配于直立式、倒置式以及垂直光片显微镜系统。尽管本实验方案主要聚焦于体轴后部发育的胚胎固定，但其亦可轻松调整，用于斑马鱼发育多个方面的活体成像。

引言

后部体节伸长是胚胎发育中的一个关键过程，通过该过程胚胎延伸并形成大部分体轴。这是复杂形态发生过程的一个范例，其间多种细胞行为协同作用，导致单个组织层面的形态发生。这些不同的组织形变进一步共同作用，最终实现整个结构水平上的后部体节伸长。为了理解这些过程在发育过程中是如何被调控和协调的，我们必须能够在多个尺度上追踪这些过程即 在分子、细胞、细胞群体和组织水平上，并将其直接与整个结构的形态发生相关联。

斑马鱼胚胎是成像后部体轴伸长的理想模型，因为其具有光学透明性和较小的体型，适用于微创光学成像技术，非常适合活体成像。¹ 近期一系列研究已证实了这一点，这些研究揭示了后部体轴发育在分子水平²、单细胞水平³、组织间行为⁴，以及细胞群体和整个器官水平上的机制。⁵

共聚焦显微镜、多光子显微镜以及选择性平面照明显微镜（SPIM）等先进成像技术，使得对发育过程进行长期成像成为可能，同时降低了光毒性和光漂白的影响。为了实现以下三个目标，需要建立稳定可靠的活体样本固定技术：1）在将样本转移至显微镜以及成像过程中，能够提供足够的支撑以维持样本的正确方向；2）允许样本具有足够的活动空间，以确保后....

方案

1. 溶液与拉制玻璃针的制备

1. 在20 mM Tris（pH 8.8）中配制浓度为4 mg/mL的Tricaine（3-氨基苯甲酸乙酯，也称为氨基甲酸乙酯）25倍储备液，并将该溶液调节至pH 7.0。按每份4 mL分装，于-20 °C保存。
   注意：麻醉剂Tricaine优先作用于神经元电压门控钠通道，从而阻断肌肉抽搐和运动⁶。
2. 在E3胚胎培养基中配制工作浓度为0.17 mg/mL的Tricaine使用液。⁷
   注意：应现用现配，因为该溶液的pH值会随时间漂移。
3. 将低熔点琼脂糖在50 mL离心管中以E3胚胎培养基配制成终浓度1.5%的溶液，通过微波炉加热溶解。将此溶液置于水浴或台式培养箱中，使其平衡至42–45 °C。若需为垂直光片成像（步骤4）制备大规格培养皿，另需在E3胚胎培养基中配制25 mL终浓度为1%的标准熔点琼脂糖溶液。
4. 使用外径1.20 mm、内径0.69 mm、长度10 mm的带丝硼硅酸盐玻璃毛细管。
5. 若使用设备与试剂表中所述类型的加热丝针式拉针仪，请采用以下参数设置：加热值600，拉力120，速度50，时间225，压力500。使用一对锋利的镊子，在毛细管开始弯曲处稍远处将其折断，以获得一个整齐而尖锐的针头，用于调整胚胎方向及去除多余琼脂糖。也可使用微型手术刀去除多余的琼....

结果

上述方案详细描述了一种用于斑马鱼胚胎长期延时成像的灵活固定技术。图2A以及动态/视频图1展示了该方法的一个实例。在单细胞阶段，将编码光转换荧光蛋白kikumeGR的mRNA注射到胚胎中。在15体节阶段，按照上述方法将胚胎固定，并在倒置共聚焦显微镜下使用10X物镜连续成像12小时。所得的共聚焦图像层经最大强度投影处理后展示。该视频清晰显示，胚胎后部在整个成像过程中可自由运动，其形态变化与在常规培养条件下脱离卵膜自由发育的胚胎相似。

另一个示例如图2B及动画/视频图2所示。在此实验中，胚胎在16细胞期被注射了编码组蛋白2B-mCherry蛋白（用于标记细胞核）和eGFP:CAAX盒（用于标记细胞膜；详见参考文献⁵）的mRNA组合。随后，如图1B

讨论

这种固定技术能够在将胚胎转移至显微镜以及进行旨在多尺度观察尾部体轴伸长的长期延时成像实验过程中，保持胚胎的稳定。此外，该方法具有良好的通用性，适用于正置和倒置显微镜系统，并提出了将其进一步改进用于垂直取向SPIM成像的建议。

该方案中的一个关键步骤是仔细去除围绕在胚胎后部的多余琼脂糖，这对于该结构的正常发育至关重要。在此过程中需格外小心，避免损伤胚胎，尤其是在去除卵黄顶部周围琼脂糖时。此外，在将切割后的琼脂糖块从胚胎周围移除时也必须谨慎，因为在此过程中有时可能导致胚胎从模具中丢失。由于这些原因，该方法通量较低，不适合同时固定大量斑马鱼胚胎，相比之下，已有利用3D打印塑料模具的高通量方法被报道^8,9。然而，通过该固定方法，胚胎具有高度稳定性，因此更易于运输至显微镜下观察，并能在后部体节伸长过程中始终保持其三维空间取向。

另一个关键步骤是确保胚胎初始侧向定位的准确性，避免任何前后或背腹方向的倾斜。任何一种倾斜都会妨.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
耗材
底部为玻璃的培养皿	Mattek	P35-1.5-10-C	35 mm 培养皿，10 mm 微孔，1.5 号盖玻片
注射针用毛细管	Sutter	BF 120-94-10	我们使用含丝的硼硅酸盐玻璃，外径 1.20 mm，内径 0.94 mm，长度 10 cm。但含丝毛细管并非必需，大多数标准注射针均可使用。
微型手术刀	Feather	P-715	带塑料手柄的一次性 Feather 微型眼科手术刀
巴斯德吸管			长 230 mm
试剂
三卡因（Tricaine）	Sigma-Aldrich	A5040
低熔点琼脂糖	Sigma-Aldrich	A9414
设备
精细镊子	FINE SCIENCE TOOLS GMBH	11252-30	Dumont #5
拉针仪	Sutter	P97	加热丝式拉针仪
双目解剖显微镜	Leica	S8 Apo