本文介绍了一种通用的固定方法，可在不干扰斑马鱼胚胎正常发育的情况下，实现对活体斑马鱼胚胎后部体轴发育过程的长期延时成像。
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本文内容
摘要
摘要
斑马鱼胚胎因其易于获取和光学透明性，为研究复杂的形态发生过程提供了理想的实验体系。特别是体轴后部的延伸，是胚胎发育中的一个关键过程，多种组织形变协同作用，指导身体大部分轴向结构的形成。为了通过长期延时成像观察这一过程，必须采用一种固定技术，能够在将样品转移至显微镜及成像过程中提供足够的支撑，以维持其正确的空间取向。此外，固定方式还必须为体轴后部区域的延伸提供足够的活动空间，而不影响其正常发育。最后，该固定方法还需具备一定的通用性，以适用于多种成像系统。本文介绍了一种用于成像斑马鱼D. rerio体轴后部延伸发育的固定技术。该方法将胚胎固定于琼脂糖中，使其头部和卵黄囊区域几乎完全包埋，而体轴后部则暴露在外，以实现正常延伸和发育。我们将展示该方法如何适配于直立式、倒置式以及垂直光片显微镜系统。尽管本实验方案主要聚焦于体轴后部发育的胚胎固定，但其亦可轻松调整，用于斑马鱼发育多个方面的活体成像。
引言
后部体节伸长是胚胎发育中的一个关键过程，通过该过程胚胎延伸并形成大部分体轴。这是复杂形态发生过程的一个范例，其间多种细胞行为协同作用，导致单个组织层面的形态发生。这些不同的组织形变进一步共同作用，最终实现整个结构水平上的后部体节伸长。为了理解这些过程在发育过程中是如何被调控和协调的，我们必须能够在多个尺度上追踪这些过程即 在分子、细胞、细胞群体和组织水平上，并将其直接与整个结构的形态发生相关联。
斑马鱼胚胎是成像后部体轴伸长的理想模型，因为其具有光学透明性和较小的体型，适用于微创光学成像技术，非常适合活体成像。1 近期一系列研究已证实了这一点，这些研究揭示了后部体轴发育在分子水平2、单细胞水平3、组织间行为4，以及细胞群体和整个器官水平上的机制。5
共聚焦显微镜、多光子显微镜以及选择性平面照明显微镜（SPIM）等先进成像技术，使得对发育过程进行长期成像成为可能，同时降低了光毒性和光漂白的影响。为了实现以下三个目标，需要建立稳定可靠的活体样本固定技术：1）在将样本转移至显微镜以及成像过程中，能够提供足够的支撑以维持样本的正确方向；2）允许样本具有足够的活动空间，以确保后部体区能够正常伸展发育而不受干扰；最后，3）固定方法需具备一定的通用性，以适应多种不同的成像系统。
本方案介绍了一种用于成像斑马鱼D. rerio发育过程的固定技术。该技术通过将胚胎固定，使其头部和卵黄囊区域几乎完全嵌入琼脂糖中，同时保留后部体区以正常伸长和发育。因此，该方法也适用于对发育中身体其他区域进行长期成像，因为琼脂糖支持采用标准光学成像技术进行观察。本方案展示了胚胎侧向固定的步骤，尽管也可采用其他方向进行固定。此外，本文还将展示如何针对直立式、倒置式和垂直光片显微镜系统对本方法进行相应调整。
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方案
1. 溶液与拉制玻璃针的制备
- 在20 mM Tris（pH 8.8）中配制浓度为4 mg/mL的Tricaine（3-氨基苯甲酸乙酯，也称为氨基甲酸乙酯）25倍储备液，并将该溶液调节至pH 7.0。按每份4 mL分装，于-20 °C保存。
注意：麻醉剂Tricaine优先作用于神经元电压门控钠通道，从而阻断肌肉抽搐和运动6。 - 在E3胚胎培养基中配制工作浓度为0.17 mg/mL的Tricaine使用液。7
注意：应现用现配，因为该溶液的pH值会随时间漂移。 - 将低熔点琼脂糖在50 mL离心管中以E3胚胎培养基配制成终浓度1.5%的溶液，通过微波炉加热溶解。将此溶液置于水浴或台式培养箱中，使其平衡至42–45 °C。若需为垂直光片成像（步骤4）制备大规格培养皿，另需在E3胚胎培养基中配制25 mL终浓度为1%的标准熔点琼脂糖溶液。
- 使用外径1.20 mm、内径0.69 mm、长度10 mm的带丝硼硅酸盐玻璃毛细管。
- 若使用设备与试剂表中所述类型的加热丝针式拉针仪，请采用以下参数设置：加热值600，拉力120，速度50，时间225，压力500。使用一对锋利的镊子，在毛细管开始弯曲处稍远处将其折断，以获得一个整齐而尖锐的针头，用于调整胚胎方向及去除多余琼脂糖。也可使用微型手术刀去除多余的琼脂糖。
2. 胚胎包埋以用于倒置或正置显微镜观察
- 在 E3 胚胎培养基中将胚胎培养至适当发育阶段。7
- 在所需发育阶段，于双目体视显微镜下使用一对尖头镊子去除胚胎的 chorion（外壳）。
- 将去壳后的胚胎在 Tricaine 工作液中孵育至少 5 分钟。
- 当融化的琼脂糖溶液冷却至 45 °C 时，使用玻璃巴斯德吸管将去壳胚胎直接转移至 50 ml 离心管中，尽量减少 E3 培养基的带入。
- 连同约 1 ml 封埋介质一起取出胚胎，并将约 100 µl 封埋介质与胚胎共同加入 35 mm 玻底培养皿中央的圆形区域，该培养皿含有一个直径 10 mm 的微孔。
- 在封埋介质凝固过程中，用毛细玻璃针将胚胎移至琼脂糖圆圈边缘，使尾部朝外（图 1A）。使用毛细玻璃针维持胚胎在理想的侧位方向，直至凝胶完全固化。若需观察后部躯干发育，应尽可能使胚胎保持标准侧位，因此需通过毛细玻璃针进行精细调整，以维持该位置。
注意：如有需要，此时可在封埋培养皿中加入多个胚胎。若需如此操作，应先将低熔点琼脂糖转移至培养皿中，再将胚胎加入琼脂糖液滴中央，随后将胚胎推至玻璃环边缘，并调整至所需位置。在琼脂糖完全凝固前，最多可按此方式固定六个胚胎。
3. 清除后部体段周围多余的琼脂糖
注意：本节描述了如何去除包围尾部区域周围的琼脂糖。在尾部区域伸长的情况下，必须确保尾部能够正常外延生长。在胚胎完全包埋于琼脂糖之后，通过去除琼脂糖，使胚胎的头部区域及约一半的卵黄囊仍保留在琼脂糖包埋结构内。
- 琼脂糖液滴凝固后，用工作浓度的Tricaine溶液淹没培养皿。
- 在配备透射光源底座的解剖双目显微镜下，调节反射镜的位置和入射光的角度，使明暗对比清晰，以便在操作过程中清楚观察琼脂糖中的切口。
- 进行切口1（图1），使用毛细针或显微手术刀在卵黄中线处进行切割，从心脏区域形成位置稍后方开始，直至体节5（第5体节）位置th 前体节（anterior somite）。
- 从正在形成的心脏附近开始进行初次切割，如图所示，完全切穿琼脂糖直至玻璃表面。
- 将毛细管或显微手术刀深入琼脂糖内部，一边缓慢上下锯动，一边开始沿胚胎进行长切口，如图所示 图1尽可能靠近胚胎剪切，但不得刺破胚胎或卵黄。
- 接下来，进行第2步和第3步切割（图1)，从与胚胎相对的位置开始，切口一直延伸至玻璃底培养皿底部。制作第2个切口，使其与前5个体节相切，以便后部躯体完全向背侧展开。第3个切口位于一个 90° 与卵黄表面呈一定角度，并从心区开始。
注意：将琼脂糖切割至玻璃圆圈的边缘（如图所示） 图1有助于将琼脂糖作为一个完整的块状物移除（步骤 3.6）。然而，此操作并非必需。 - 从切口1和切口3的交汇处开始，缓慢地向切口2的末端进行斜向切割，同时缓慢向上抬起，以松动位于后部体节周围的琼脂糖方块。
注：在某些情况下，琼脂糖会一次性整体释放，操作也随之一次性完成；而在其他情况下，可能需要多次尝试才能完全清除胚胎周围的琼脂糖。 - 用一把锋利的镊子将移位的琼脂糖块从胚胎培养基中取出。为便于操作，可将琼脂糖碎片移至培养皿边缘，并利用培养皿壁作为支撑，以便将琼脂糖块夹出。
图1：样品安装装置示意图。（A）图示为固定在培养皿中心玻璃环内的胚胎位置。右侧为胚胎的放大图，显示围绕胚胎的琼脂糖被连续切开，切面以红色虚线表示。（B）图示为胚胎的侧视图，展示倒置和正置物镜均可方便接近样品。（C）类似示意图，显示胚胎如何安装用于垂直光片成像系统。请点击此处查看该图的放大版本。
- 如果此时肌肉抽搐尚未完全被抑制，可从 4 mg/ml、pH 7 的储备液中逐滴加入 Tricaine。
4. 胚胎样本的垂直光片显微镜成像安装
注意：这是上述方法的一种改进，可实现通过垂直取向的光片显微镜（SPIM）对样本进行多物镜成像。该改进方法的核心思想是将样本略微抬高至培养皿底部以上，以便两个成像物镜能够方便地接近样本。
- 在样品安装之前，用 E3 培养基中 1% 琼脂糖将一个 100 mm 的塑料培养皿涂覆至 5 mm 高度，并使其凝固。
- 在培养皿中央加入 1 ml 低熔点琼脂糖液滴，并使其凝固。
- 将胚胎包埋于低熔点琼脂糖中，操作同第 2 节。但此次使用较小体积的溶液（0.5 ml）从 50 ml 离心管中的琼脂糖中取出胚胎，并将此小液滴置于培养皿中央 1 ml 液滴的上方。
- 使用毛细玻璃针将胚胎置于小液滴中央，并保持其正确方向直至凝胶凝固。
- 用工作浓度的 Tricaine 溶液淹没培养皿，并参照第 3 节去除多余的琼脂糖，但不要切穿底部 1% 普通琼脂糖形成的垫层。
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结果
上述方案详细描述了一种用于斑马鱼胚胎长期延时成像的通用封片技术。图2A 和动态/视频 图1 展示了该技术的一个示例。在单细胞阶段，将编码光可转换荧光蛋白 kikumeGR 的 mRNA 注射到胚胎中。在15体节阶段，按照上述方法将胚胎封片，并使用10倍物镜的倒置共聚焦显微镜进行连续12小时的成像。所得的共聚焦图像层叠数据经最大强度投影处理后展示。该视频清晰显示，胚胎的尾部在成像期间可自由运动，并表现出与在常规培养条件下脱离绒毛膜自由发育的胚胎相似的形态学变化。
另一个示例如图2B以及动画/视频图2所示。在此实验中，胚胎在16细胞期被注射了编码组蛋白2B-mCherry蛋白（用于标记细胞核）和eGFP:CAAX盒（用于标记细胞膜；详见参考文献5）的mRNA组合。随后，如
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讨论
这种固定技术能够在将胚胎转移至显微镜以及进行旨在多尺度观察尾部体轴伸长的长期延时成像实验过程中，保持胚胎的稳定。此外，该方法具有良好的通用性，适用于正置和倒置显微镜系统，并提出了将其进一步改进用于垂直取向SPIM成像的建议。
该方案中的一个关键步骤是仔细去除围绕在胚胎后部的多余琼脂糖，这对于该结构的正常发育至关重要。在此过程中需格外小心，避免损伤胚胎，尤其是在去除卵黄顶部周围琼脂糖时。此外，在将切割后的琼脂糖块从胚胎周围移除时也必须谨慎，因为在此过程中有时可能导致胚胎从模具中丢失。由于这些原因，该方法通量较低，不适合同时固定大量斑马鱼胚胎，相比之下，已有利用3D打印塑料模具的高通量方法被报道8,9。然而，通过该固定方法，胚胎具有高度稳定性，因此更易于运输至显微镜下观察，并能在后部体节伸长过程中始终保持其三维空间取向。
另一个关键步骤是确保胚胎初始侧向定位的准确性，避免任何前后或背腹方向的倾斜。任何一种倾斜都会妨...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
Estelle Hirsinger：获得巴斯德研究所的固定经费以及法国国家科研署（ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS）的资助。Estelle Hirsinger 来自法国国家科学研究中心（CNRS）。Benjamin Steventon 曾获得法国国家科研署（ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS）资助，随后获得巴斯德研究所的Roux奖学金，之后获得AFM-Telethon奖学金（编号16829）。目前由惠康信托基金会/皇家学会Sir Henry Dale奖学金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 耗材 | |||
| 底部为玻璃的培养皿 | Mattek | P35-1.5-10-C | 35 mm 培养皿，10 mm 微孔，1.5 号盖玻片 |
| 注射针用毛细管 | Sutter | BF 120-94-10 | 我们使用含丝的硼硅酸盐玻璃，外径 1.20 mm，内径 0.94 mm，长度 10 cm。但含丝毛细管并非必需，大多数标准注射针均可使用。 |
| 微型手术刀 | Feather | P-715 | 带塑料手柄的一次性 Feather 微型眼科手术刀 |
| 巴斯德吸管 | 长 230 mm | ||
| 试剂 | |||
| 三卡因（Tricaine） | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| 低熔点琼脂糖 | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| 设备 | |||
| 精细镊子 | FINE SCIENCE TOOLS GMBH | 11252-30 | Dumont #5 |
| 拉针仪 | Sutter | P97 | 加热丝式拉针仪 |
| 双目解剖显微镜 | Leica | S8 Apo |
参考文献
- Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics. Dev Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).
- Lawton, A. K., et al. Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation. Development. 140 (3), 573-582 (2013).
- Dray, N., et al. Cell-Fibronectin Interactions Propel Vertebrate Trunk Elongation via Tissue Mechanics. Curr Biol. 23 (14), 1335-1341 (2013).
- Steventon, B., et al. Species tailoured contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates. Development. 143, 1732-1741 (2016).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic Tricaine Acts Preferentially on Neural Voltage-Gated Sodium Channels and Fails to Block Directly Evoked Muscle Contraction. PLoS ONE. 9 (8), 103751-103756 (2014).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book, 5th Edition; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene. Paperback (2007).
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重印与许可
