通过扫描透射电子断层成像制备和观察厚生物样品

摘要

本报告描述了一种用于对厚生物样品进行扫描透射电子断层成像的样品制备方案及特定成像条件。

摘要

本报告描述了一种用于制备厚生物样品的方案，以便后续利用扫描透射电子显微镜进行观察。同时介绍了一种通过扫描透射电子断层成像技术研究厚生物样品三维结构的成像方法。样品制备方案基于常规方法，包括使用化学试剂固定样品、用重金属盐作为对比剂处理、经一系列乙醇溶液脱水，最后将样品包埋于树脂中。随后描述了利用扫描透射电子显微镜观察厚样品时的具体成像条件。采用离焦堆叠方法对样品切片进行观察，即在不同焦平面采集多幅图像，从而获取样品不同深度处的在焦信息。在断层成像数据采集过程中，每个倾斜角度均执行此类特定的图像采集模式。随后生成一幅整合了所有不同焦平面上在焦信息的图像。接着生成经典的倾斜系列数据集。该方法的优势在于，倾斜系列的对齐与重构可使用标准工具完成。通过采集离焦图像序列，能够重构出包含样品全部结构细节且处于在焦状态的三维体积数据。

引言

自20世纪70年代初以来，透射电子显微镜（TEM）中的断层成像技术已广泛用于生物样品的结构表征^1,2,3。透射电子断层成像的优势在于其能够在纳米尺度上研究多种生物结构，从细胞的构架、细胞器的超微结构到大分子复合物及蛋白质的结构均可涵盖。然而，透射电子断层成像无法用于研究过厚的样品（厚度大于0.5 µm）。事实上，厚样品会产生过多的散射电子，导致信噪比（SNR）过低的图像。此外，断层成像需要采集倾斜样品的图像，而样品的表观厚度会随倾斜角度增加而增大。尽管可以使用能量过滤器去除非弹性散射电子，但在TEM中仍难以达到获得高信噪比图像所需的足够电子数量。因此，厚的生物样品只能通过切片的方式进行研究⁴。

某些样品无法进行切片：一些样品在切割时可能发生降解，而另一些则需要完整地进行研究，以理解其复杂性。一种替代方法是采用透射电子显微镜的扫描模式^5,6,7,8。在扫描透射电子显微术（STEM）中，电子的光路与传统透射电子显微镜（TEM）不同。穿过样品而未发生散射的电子可由位于光轴上的明场（BF）探测器收集⁹，而发生弹性散射的电子则可在偏离光轴的特定角度处由暗场（DF）探测器收集。STEM的另一个优势在于，聚焦的电子束可在样品表面逐点扫描，从而实现逐像素成像。尽管电子束在穿过样品时会发生展宽¹⁰，但这种特定的信号收集方式对非弹性散射电子的敏感性仍低于传统TEM。此外，STEM在样品后方无需使用透镜，从而避免了TEM中可能出现的色差。通过调节相机长度，可使明场探测器主要收集未散射的电子。由于多重散射会导致图像失真，因此不建议使用暗场探测器研究较厚的样品¹¹，而应使用明场探测器。尽管STEM能够生成高信噪比（SNR）的图像，但由于其电子束会聚角相对高于TEM，导致景深较浅，从而减少了从厚样品中可恢复的纵深信息量。在像差校正的STEM显微镜中，会聚角可高达30 mrad，此时景深可能极小，以致聚焦信息仅来源于几纳米厚的焦平面。将电子束设置为平行模式可增加电子束的景深，但会牺牲分辨率¹²。然而，这种设置并不总是可行的。

在需要使用会聚电子束时，研究厚样品必须采用增强电子束景深的技术。近期研究报道了在整个样品的不同焦平面上获取多幅图像，以恢复最大程度的合焦信息^13,14。这两项研究描述了处理不同焦平面信息的两种不同方法。Hovden et al. 在傅里叶空间中合并了在不同焦平面采集的图像，最终重构结果直接通过三维逆傅里叶变换获得¹³。相比之下，Dahmen et al. 开发了一种会聚束重构引擎，用于在实空间中从不同焦平面重构三维体积¹⁴。我们实验室也开发了一种成像厚生物样品的方法。我们的策略与上述两种方法不同，我们整合了各个焦平面中处于合焦状态的信息，并利用平行束投影器在实空间中重构最终的三维体积¹⁵。我们的目标是建立一种可在任何电子显微镜实验室中简便实施的方法。为此，我们力求在有限的时间内完成焦平面图像的采集，时间范围与常规断层成像实验相当。此外，我们提出的方法可适配于多种类型的图像对齐与重构软件。

基于我们2015年发表的研究¹⁵，我们希望可视化并表征景深的恢复情况，因此采用了25 mrad的大收敛半角。本文中，我们逐步展示在扫描透射电子显微镜（STEM）中执行离焦成像的实验方案，该方法基于我们实验室于2015年建立的技术¹⁵，并介绍2015年数据的处理方式。该方法能够从厚达750 nm的生物样品的多个焦平面中恢复出焦点内的信息，从而实现高质量的三维重构。在适当之处，我们也展示了本方法与其他研究团队所用方法之间的差异。

方案

注意：使用各种试剂前，请查阅其材料安全数据表（MSDS）。样品制备过程中使用的多种化学试剂具有毒性、致癌性、致突变性及/或生殖毒性。操作样品时须佩戴个人防护装备（手套、实验服、长裤和封闭式鞋），并在通风橱中进行操作。使用超薄切片机对样品进行切片时涉及使用锋利器械，必须谨慎操作。以下步骤中，作者假设样品为细胞培养样品。根据样品类型的不同，该方案可能需要相应调整，尤其是离心步骤。

1. 缓冲液和混合物的制备

1. 配制磷酸盐缓冲液（PBS）溶液（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄ 和 1.76 mM KH₂PO₄）。
2. 配制含30%、50%和70%乙醇的PBS溶液用于样品脱水。通过将样品逐步孵育于浓度递增的乙醇溶液中进行脱水处理。
3. 通过混合双酚A-（表氯醇）（20 mL）、十二烯基琥珀酸酐（9 mL）、甲基-5-降冰片烯-2,3-二羧酸（11 mL）和2,4,6-三（二甲氨基甲基）苯酚（0.7 mL）来配制环氧树脂；可根据所需树脂硬度采用其他配比。
4. 配制含30%、50%和70%环氧树脂的乙醇溶液用于样品包埋。通过将样品逐步孵育于浓度递增的树脂溶液中进行树脂包埋。
   注：所配制溶液的体积取决于所研究样品的类型。组织样品所需的溶液体积多于细胞培养样品。

2. 样品的固定与染色

1. 将细胞培养物在 5,000 x g 条件下离心 5 分钟。后续所有离心步骤均采用相同条件。
2. 弃去上清液，通过将细胞沉淀重悬于含 4% 多聚甲醛和 2% 戊二醛的 PBS（1 mL）中进行固定。室温孵育 30 分钟（图 1A）。也可选择在 4 °C 下固定过夜或整个周末。
3. 离心后，弃去上清液，并用 PBS（1 mL）洗涤沉淀 3 次，以彻底去除固定剂。
4. 用含 1% 四氧化锇（OsO₄）的 PBS（1 mL）对样品进行后固定，室温孵育 30 分钟。
5. 离心后，弃去上清液，并用 PBS（1 mL）洗涤沉淀 3 次，以彻底去除 OsO₄。在油中灭活 OsO₄ 后弃置。
6. 加入含 2% 醋酸铀的 PBS（1 mL）作为对比增强剂，室温孵育 30 分钟（图 1B）。
7. 离心后，弃去上清液，并用 PBS（1 mL）洗涤沉淀 3 次，以去除未结合的醋酸铀；醋酸铀含有放射性元素，应弃置于专用于放射性废物的容器中。
   注意：孵育时间可根据样品大小进行调整。例如，较厚样品（如组织样品）的固定和染色需要更长的孵育时间。更长的孵育时间也可能有利于脱水和包埋步骤。醋酸铀可用含钆盐的“无铀”溶液替代。

3. 样品脱水

1. 离心后，弃去上清液，并在 4 °C 下用 PBS（1 mL）与 30% 乙醇孵育样品 30 分钟（图 1C）。
2. 使用乙醇浓度逐步增加的溶液（50%、70% 至 100%）重复步骤 3.1。在这些脱水步骤中，为保存样品，需将样品维持在 4 °C。
3. 离心后，弃去上清液，将沉淀重悬于纯乙醇（1 mL）中，4 °C 下孵育过夜。

4. 树脂包埋

1. 离心后，弃去上清液，将沉淀重悬于含30%环氧树脂的乙醇中（1 mL），在室温下孵育30分钟（图1D）。
2. 重复步骤4.1，使用环氧树脂浓度逐步增加的溶液（50%、70%直至100%）。
3. 离心后，弃去上清液，将沉淀重悬于纯环氧树脂（1 mL）中，在室温下孵育过夜。若硬化剂DMP-30的存在引发树脂聚合反应，则应准备两批环氧树脂，一批含DMP-30，另一批不含DMP-30。
4. 离心后，将沉淀重悬于200 µL含固化剂的纯环氧树脂中，置于塑料包埋胶囊内；样品应位于塑料胶囊底部。

5. 树脂聚合

1. 将含有样品的塑料胶囊置于60 °C的培养箱中孵育48小时；其他类型的树脂可能需要不同的聚合条件。
2. 从培养箱中取出胶囊，检查树脂是否已聚合；用硬物按压时，树脂应感觉坚硬。
3. 在已聚合并含有样品的树脂上方加入纯环氧树脂（含固化剂）；这一额外的树脂层将有助于后续样品切割。将胶囊在60 °C下再次孵育48小时。

6. 样品切片

1. 将样品倒置安装在样品夹中，使样品朝上，并将其固定在超薄切片机的修块块上。紧紧锁住杠杆，以确保修块块牢固地固定在超薄切片机上。
2. 使用剃刀刀片或类似的锋利切割工具，切除外层塑料包埋胶囊，使其与聚合树脂分离。切割树脂，使样品被包裹在大致呈金字塔形状的树脂中。无需完全去除整个塑料胶囊，仅需去除覆盖聚合样品的部分即可。
3. 将胶囊和样品夹从修块块上取下，并安装到超薄切片机的移动臂上。
4. 在刀座上安装修块刀，精确修整金字塔的各个面。建议使用双目显微镜，以获得理想的金字塔形状；金字塔修得越规整，后续切出的切片质量越高。
5. 取下修块刀，更换为可用于切割厚度大于 0.5 µm 切片的组织学切片刀。
6. 在组织学切片刀的槽中加入适量水后，将刀刃移至样品表面，并利用双目显微镜调整胶囊的倾斜角度，使刀刃能够垂直于金字塔面进行切割。
7. 根据所需的切片厚度调节切割速度，以获得均匀一致的切片。
8. 让切片漂浮在水面上，然后用环状工具捞取切片。
9. 将环状工具移向置于滤纸上方的透射电镜铜网。
   注意：铜网应事先经过处理以增强其亲水性，可使用镀膜笔完成此处理。
10. 由于滤纸会吸收水分，使切片自然附着在铜网上。在将铜网插入电子显微镜前，让其干燥数分钟。

7. 穿焦倾斜系列的设计

1. 以恒定的焦距间隔采集贯穿焦平面的图像。
   注意：穿焦倾斜系列由在倾斜系列每个倾斜角度下采集的一组穿焦图像组成。整个焦距幅度应足以覆盖样品的全部厚度。
2. 确定焦距间隔的数值。如果该间隔等于景深，则可使整个样本处于焦点范围内，此设置代表了可能实现的最高采样水平；如果该间隔大于景深，则样本的某些部分将无法在焦点内被采集，意味着这些部分的样本将不在焦点范围内被收集。
3. 根据电子的波长和电子束的会聚半角，计算电子束的景深。电子的波长与加速电压直接相关，而会聚半角可采用电子显微镜制造商提供的数值，或通过已知样品的衍射图样实验测定。¹⁶由于在电子显微镜中，以波长 λ 被加速的电子以会聚半角 α 照射样品，因此可使用以下公式计算景深（DOF）：
   
   
4. 设计焦距序列，使整个焦距范围能够覆盖样本的最大表观厚度（即， 在其最大倾斜角度时）。
   注意：0.75 µm 厚的样品在 70° 倾斜时其表观厚度为 2.19 µm，因此聚焦幅度应大于 2.19 µm。对于该样品，若上述确定的聚焦间隔为 50 nm，则需要 44 幅图像（2.19 µm / 50 nm）以覆盖样品的最大表观厚度。整个聚焦幅度等于聚焦间隔乘以焦平面步数。在最大倾斜角（θ）下，样品的表观厚度定义如下：
   
   

8. 样品成像

注意：本方案不涉及如何将透射电子显微镜设置为扫描透射模式（STEM）的具体操作；相关大部分信息可参见电子显微镜制造商提供的参考手册。但需注意以下几点：i）应根据所需放大倍数选择合适的束斑尺寸；ii）Ronchigram 图案必须良好对中；iii）在明场（BF）模式下，需调节相机长度，以选择未发生散射的电子，同时确保探测器获得良好的照明。用于电子显微镜的树脂切片在图像采集前应预先照射，以防止收缩。树脂收缩和电荷积累效应在图像采集过程中可能相互混淆。当出现电荷积累效应时，使用物镜光阑可能有助于提高样品稳定性。然而，在 STEM 配置的特定情况下，物镜光阑与高角环形暗场（HAADF）成像模式不兼容，而过小的物镜光阑也不适用于明场（BF）成像模式。

1. 使用低倍率（STEM下约20,000X），浏览样品并定位目标区域。
2. 调整同心高度（Z轴），使样品旋转时兴趣区域不发生漂移。
3. 确认目标物体在整个倾斜范围内均保持可见。
4. 由于在采集焦面倾斜序列（through-focal tilt-series）过程中会获得大量图像，因此请使用自动采集软件。可选用商业软件，也可根据需要自行设计定制的数据采集软件。确保该软件程序能够执行以下三个步骤：
   1. 按照标准的倾转系列图像采集方案进行追踪和对焦。
   2. 确保焦平面图像在样品的Z轴位置处相互重叠。
   3. 在每个倾斜角度自动采集一系列焦平面序列图像。
5. 为软件程序提供穿焦倾斜系列的主要参数（即， 焦距间隔、焦距步长、最小倾斜角度、最大倾斜角度、倾斜步长以及扫描速度。
6. 启动图像采集过程，并等待软件程序完成。

9. 图像处理

注意：在本方案中，穿焦倾斜系列的处理使用 ImageJ 插件¹⁷ 进行。补充数据 1 展示了一个 ImageJ 宏，用于对齐步骤（Turboreg）以及合并穿焦倾斜系列中的合焦信息（扩展景深），该倾斜系列设计了三个焦距值。

1. 对在相同倾斜角度下采集的图像进行对齐（即， 焦平面序列图像）。由于各图像的焦点信息不同，其可用于配准的特征也不尽相同；因此，需通过两两配准相邻图像的方式进行对齐（即， 遵循金字塔层级结构（最近的焦点值优先），使用Turboreg¹⁸，ImageJ 插件。
2. 在每个倾斜角度下持续验证离焦图像的对齐情况。将对齐后的离焦图像进行堆叠，以改善视觉观察效果。
   注意：浏览图像堆栈时，只有处于焦点的区域应发生移动。精确对齐至关重要，因为后续步骤需要从不同图像中恢复处于焦点的信息。
3. 使用扩展景深技术融合处于焦点中的信息¹⁹，ImageJ 插件；这将从图像堆栈中最终生成单幅图像。在景深恢复过程中可使用多种设置，但应采用最高设置以保留图像信息。
   注意：倾转系列现在由每个倾转角度的一幅图像组成，每幅图像均包含从焦面序列图像中恢复的在焦信息。
4. 处理数据。
   注意：由于数据现已简化为标准的倾转系列，因此可使用标准的对齐与重建工具。在本方案中，使用 TomoJ 进行数据对齐和数据重建^20,21有关如何使用TomoJ的更多详细信息，请参见原始出版物²².
5. 进行倾转系列的精细对齐。
   注意：一种有效的策略是使用金珠作为标志点，以精确定位图像间的位移。如果无法将金珠添加到样品中，也可使用局部最小值作为替代方法。
6. 对配准后的数据进行三维重建；可在实空间或傅里叶空间中执行重建的算法有多种，每种算法均有其优势与局限性。
7. 如果倾转系列的最终对齐效果不佳，可通过优化初始步骤进行改进。若最终的三维重构图像模糊或变形，应重复对齐步骤；实践中，采集的焦平面数量越多，三维重构的对比度和细节表现越好。
   注意：可使用多种软件程序处理离焦倾斜系列图像。然而，本方案所采用的工具是基于我们的经验，因其表现最佳而选定。Turboreg¹⁸ 在存在焦距梯度的情况下，图像配准效果更佳。更多详细信息可访问专用网站²³扩展景深插件¹⁹ 在从不同图像中恢复聚焦信息方面表现非常出色，而其他工具则导致了明显的像素修改。有关脚本编写的更多详细信息，可访问此专属网站获取²⁴.

结果

在本研究中，使用场发射枪透射电子显微镜将电子加速至 200 kV。采用 20 µs 的停留时间，在 STEM 明场模式下采集图像。关于离焦倾斜系列的设计，我们发现对于厚达 750 nm 的生物样品的超微结构研究，即使电子束的景深仅为 3 nm，采用 150 nm 的焦距间隔仍能获得满意的结果，这得益于我们使用了高达 25 mrad 的极大汇聚半角。

本报告中分析的样品为Trypanosoma brucei，这是一种单细胞真核生物，其鞭毛作为细胞器在原生生物到哺乳动物中均高度保守，因而被广泛研究²⁵。细胞按照样品制备方案进行处理，我们对T. brucei的鞭毛窝进行了结构分析（图2A）。当样品在电子显微镜中高度倾斜（70°倾斜）时，在不同焦距下采集一系列图像（即焦面扫描成像过程中所采用的方法）会导致样品中处于焦平面的区域发生位移（

讨论

本文介绍了一种常规的样品制备方案，以及使用扫描透射电子显微镜（STEM）离焦层析技术对厚生物样品进行三维分析的逐步操作指南。生物样本的树脂包埋技术已应用数十年²⁶，针对不同类型样品的替代性制备方案在文献中亦有广泛报道²⁷。相比之下，利用离焦成像方法在STEM中对厚样品进行成像仍属新兴技术，随着该技术的逐步推广，相关方法有望得到进一步优化。

本研究的目的是描述一种样品制备方案，更具体地说，是利用当前可用的设备在合理时间内完成扫描透射电子显微镜（STEM）穿焦倾斜系列成像的成像条件。为此，采用了较大的焦距间隔。实际上，对于使用STEM对厚样品进行穿焦倾斜系列成像时，焦平面之间应间隔多近，目前尚无共识。通常采集一幅STEM图像需要数秒时间，而完成一整套传统的倾斜系列可能耗时数小时。作为概念验证，可以采集数百甚至数千幅图像。然而，显然长时间采集并不适合日常使用。在设计此类长时间实验时，必须考虑电子束稳定性和样品漂移问题。此外，长时间采集还引发了电子剂量累积的问题。因此，目前STEM穿焦倾斜系列仅...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	P4417
乙醇	Sigma-Aldrich	2860
环氧树脂	EMS	14120
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148	将多聚甲醛粉末加入约 60 °C 加热的 PBS 中。 滴加 1 N NaOH 调高 pH，直至多聚甲醛粉末完全溶解。
戊二醛	Sigma-Aldrich	G5882
四氧化锇	EMS	19150
醋酸铀	Sigma-Aldrich	73943
明胶胶囊	EMS	70110
修块与组织切片刀	LFG Distribution	Diatome 金刚石刀
透射电镜铜网	LFG Distribution	G200-Cu
载网涂布笔	LFG Distribution	70624
样品台	JEOL	EM-21311 HTR
电子显微镜	JEOL	JEM-2200FS