人视网膜色素上皮细胞向大鼠眼巩膜视网膜移植精制方案的研制

摘要

视网膜注射液已广泛应用于干细胞置换治疗老年性黄斑变性的临床前研究。在这一可视化的文章中, 我们描述了一个低风险, 可重复和精确修改的视网膜注射技术, 通过巩膜的方法传递细胞到大鼠的眼睛。

摘要

退行性视网膜疾病, 如年龄相关的黄斑变性 (AMD) 是导致不可逆转的视力丧失全球。AMD 的特点是视网膜色素上皮 (RPE) 细胞的退化, 这是一个单层的细胞功能支持和解剖包裹周围的神经视网膜。目前的药理治疗 non-neovascular amd (干 amd) 只减缓疾病进展, 但不能恢复视力, 必须研究, 以确定新的治疗策略。用健康细胞取代退行性视网膜色素上皮细胞有望在未来治疗干性 AMD。广泛的临床前研究的干细胞替代疗法的 AMD 涉及移植干细胞衍生 RPE 细胞进入视网膜空间的动物模型, 其中视网膜注射技术的应用。在这些临床前动物研究中最常用的方法是通过经巩膜路线, 这是由于缺乏直接可视化的针端, 往往会导致视网膜损伤而变得困难。通过玻璃体的另一种方法可以直接观察针端位置 , 但是由于更多的眼部组织扰 , 它有很高的手术创伤风险。我们已经开发了一个低风险和可重复性的改良反式巩膜注射法, 使用定义的针角和深度, 成功地和一贯地提供 RPE 细胞进入大鼠视网膜空间, 并避免过多的视网膜损伤。以这种方式传送的细胞在皇家外科医生 (RCS) 大鼠中已经被证明是有效的, 至少2月。该技术不仅可用于细胞移植, 也可用于小分子或基因治疗的传递。

引言

人视网膜位于眼睛的后面功能作为一个轻的感觉组织并且在视觉知觉扮演一个关键的角色。因此视网膜细胞功能障碍或细胞死亡导致视力问题或永久性失明。在视网膜不同层次的细胞变性或功能紊乱的疾病被称为退行性视网膜疾病, 其中 AMD 是最常见的类型, 也是发达国家老年人不可逆转性失明的主要原因之一^1,2。AMD 的病理过程与视网膜色素上皮层与底层赫膜之间的 "疣" 堆积有关, 从而损害了视网膜色素上皮支持的感光生理, 导致了神经系统的萎缩和视力丧失^{3, 4,5}。到目前为止, 没有治疗高级干 (non-neovascular) AMD。干细胞治疗作为再生医学的一个新范式的出现, 带来了用干细胞衍生的健康细胞取代功能失调或死亡的 RPE 细胞的希望。事实上, 广泛的临床前研究的移植干细胞 (如, 人类胚胎干细胞) 衍生 rpe 细胞到 rpe-变性动物模型已经执行^6,7, 其中一些已取得进展临床试验^8,9 (NCT01344993, ClinicalTrials.gov)。最近, 我们的实验室发现了人类视网膜色素上皮细胞 (hRPESCs) 中的一种替代的干细胞来源, 目前正被用于 hRPESC 衍生-rpe 细胞 (hRPESC-rpe) 移植治疗 AMD 的前临床研究。^10,11,12,13。

视网膜注射技术应用于上述多个群体, 包括本组的前临床研究。动物视网膜注射有两种一般的方法: 反 vitreal 和反式巩膜。vitreal 方法的优势是, 外科医生能够直接观察针端, 因为它穿透了前眼, 越过整个 vitreal 腔毗邻的镜头, 并穿透视网膜在后面的眼睛, 以达到视网膜空间^14,15,16。然而, 它需要扰乱视网膜在两个位置 (前部和后部), 承担损害晶状体的风险, 并可能导致细胞回流到玻璃体时, 针被收回。相反, 跨巩膜的方法, 原则上, 避免介入视网膜和玻璃体, 和回流退出眼睛。在有色啮齿目动物中, 外科医生最初可以观察到巩膜的穿透, 但在进入色素脉络后, 针端不再可见。没有直接观察, 破坏视网膜是常见的, 并可能导致视网膜解剖和交付细胞和/或血液进入玻璃体。此外, 由于眼睛表面是弯曲的, 很难知道哪种针的角度和深度是最有效的反式巩膜注射。

在这一可视化的文章中, 我们介绍了一个跨巩膜视网膜注射方法, 通过使用后评价与光学相干断层扫描 (OCT), 这使得对注射场的详细检查。我们的反式巩膜注射技术利用定义的位置, 角度和深度注射针, 以产生非常低的外科创伤和高可靠性。在这里, 我们特别演示了 hRPESC-RPE 细胞注入视网膜空间的 RCS 大鼠, 一个临床前模型的人 AMD。采用这种注射方法, 成功、一致地将 hRPESC 视网膜色素上皮细胞导入到 RCS 大鼠眼的视网膜空间中, 成功率很高。注入的细胞以前发现, 导致保存 RCS 光至少2月后, 注入¹³。本程序在解剖显微镜下进行, 易于学习。它需要两个人 (一个外科医生和一个助理) 来执行注射和平均注射时间为每种动物少于5分钟。定义的角度和深度为注射针, 使之成为可能的实验室, 在那里 OCT 是无法获得成功的视网膜注射液。它允许高度可再生的视网膜通路, 不仅可以用于细胞移植, 也可用于药物传递和基因治疗。

方案

所有涉及动物的程序都得到了纽约州立大学奥尔巴尼分校动物保育和使用委员会 (IACUC) 的批准。

1. 预注射制剂

1. hRPESC 视网膜色素上皮细胞悬浮液的制备
   注意: 所有以下步骤都在无菌组织培养罩中执行, 并且需要熟悉基本的无菌技术。
   1. 从50-90 岁的人眼中分离出主要的 hRPE 细胞, 并在24井板中培养细胞¹²。冷冻的细胞在通道 1, 解冻的需要和文化通道 2 (P2) 细胞4-5 周 (图 1A) 注射。
   2. 移除培养基¹² , 用500µL 5ml 1X Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水, 不含钙 & 镁 (1x DPBS-CMF), 用 1000 DPBS 吸管将 1X CMF µL 加入井中, 然后用真空吸尘器将其取出。
   3. 每个井加300µL 胰蛋白酶/dnasei。孵育 hRPESC-RPE 细胞在胰蛋白酶/dnasei (4 kU dnasei 每1毫升0.25% 胰蛋白酶-EDTA) 4 分钟, 在37° c 离解细胞。
   4. 检查显微镜下的细胞, 看它们是否已经围捕。继续孵育的细胞在胰蛋白酶/dnasei 的额外2分钟, 如果他们还没有四舍五入。
   5. 一旦细胞被围捕, 使用1000µL 吸管研制分离的细胞从井和转移的胰蛋白酶/dnasei 包含分离细胞成一个15毫升锥形管与同等体积的5ml 培养基, 使胰蛋白酶/dnasei 灭活。
   6. 用 5ml 1X DPBS CMF 的冲洗井, 通过轻轻移上下, 尤其是在井边;然后将这些细胞添加到前锥管中。
   7. 离心锥形管在 286 x g 为 5 min 在4° c, 颗粒细胞。
   8. 用1毫升培养基去除上清和重细胞。
   9. 使用例计数单元格。
   10. 离心机在 286 x g 为5分钟在4° c 的颗粒细胞。
   11. 在5万细胞/µL 的无菌平衡盐溶液 (BSS) 中去除上清和重细胞 (在视网膜注射过程中, 在1µL 体积内提供5万细胞)。
   12. 将最终的细胞悬浮液 (CS) 转化为1.7 毫升的离心管, 并将其放入冰水混合物中, 直至注射使用。
2. 细胞注射器的制备
   1. 插入一个无菌的33口径斜角针注入注射器和螺丝紧紧地组装注射器。
   2. 冲洗注射器与100% 乙醇5-6 次。
   3. 冲洗注射器与70% 乙醇5-6 次。
   4. 用 BSS 冲洗注射器5-6 次。
   5. 在解剖显微镜 (图 1B) 下, 用不育的黑色记号笔在600µm 的位置上标记注射器针。
   6. 将注射器放在微上进行注射。

2. 视网膜注射液

1. 手术区和动物制剂
   1. 称一个4-5 周大的 RCS 大鼠 (60-100 克), 并麻醉它使用异氟醚蒸汽输送系统。
      注意:诱导麻醉使异氟醚的流动率保持在5%。通过按压爪子来确认麻醉深度, 然后在手术过程中将麻醉维持的流速降低到2-3%。
   2. 在解剖显微镜的舞台上放置一个不育的外科悬垂, 上面有一个加热垫, 以建立一个不育的手术区。
   3. 将大鼠转移到手术区, 将大鼠置于与异氟醚系统相连的鼻锥中, 以维持麻醉。
   4. 用纱布盖住老鼠的身体。捏住老鼠的脚趾以确认全身麻醉。
2. 显微镜下反式巩膜视网膜注射液
   1. 在老鼠的 unoperated 眼上涂抹一滴眼润滑剂。
   2. 将老鼠的左眼朝向右侧, 将它的头部朝向外科医生的右手, 将它的背部朝向外科医生。
   3. 修剪任何用小剪刀遮住眼睛的胡须。
   4. 从左眼的颞侧滴下少量的眼部洗净, 用棉签将多余的部分收集在鼻侧, 冲洗眼睛。
   5. 扩大瞳孔与1% 卡和2.5% 肾上腺素 (新鲜的10% 肾上腺素, 稀释它在不育0.9% 生理盐水的手术当天) 为一个后 OCT 考试通过应用一滴每一个。
   6. 轻轻地将眼部周围的皮肤拉4-6 次以打开眼睑, 使眼睛稍微 proptosed, 以便更方便地进入角膜缘后部。
   7. 应用一滴眼洗, 保持眼睛湿润。
   8. 轻轻研制 cs (准备在步骤 1.1.12) 和负载的注射器与1.2 µL cs。额外的0.2 µL 用于补偿注入回流。
      注意:根据我们的测量, 大约 5,000-8 000 细胞在回流中丢失, 注射了5万细胞/µL, 相当于大约10-16% 的细胞丢失, 另外还注射了0.2 µL CS 以补偿这种细胞损失。
   9. 放置在一个微 (或有一个助理持有它) 垂直的注射器填充, 因为 RPE 细胞往往容易下沉悬浮。
   10. 应用一滴0.5% 丙 (局部外用麻醉剂) 的眼睛和删除过剩的棉花涂抹剂。
       注意:此步骤应抑制角膜反射, 防止眼睛在后续步骤中闪烁。
   11. 用镊子夹住角膜缘后部的结膜, 旋转眼睛鼻, 抬起结膜作 "帐篷"。
   12. 用剪刀剪下顶部的 "帐篷", 使一个小开口在结膜和暴露的基础巩膜。
   13. 使用镊子握住角膜缘旁边剩余的结膜边缘的边缘, 并旋转眼睛鼻, 使瞳孔轴的角度相对于桌面 (图 1C) 大约30度。继续抓取的结膜边缘是需要提供一个反在针插入和保持眼睛的最佳角度。
   14. 要做一个试验孔为细胞注射, 位置末端一个无菌的斜面31测量胰岛素针在 1,200-1, 500 µm 后到角膜缘与开头的尖朝向。
   15. 调整胰岛素针的角度, 使它是10-15 度以上的巩膜 (切线到一个假想的平面在预期的注射地点)。慢慢穿透巩膜-脉络膜复合物到针深度约500µm。在色素大鼠, 针端将 ' 消失 ' 下色素脉络膜。在这里使用的胰岛素针的牌子, 从针尖到斜面的距离是500µm。
   16. 小心地取出胰岛素针 (可以看到一个非常小的血液渗出)。
   17. 如果注意到过多的出血, 可以使用眼枪清除孔, 如果需要。在矛应用后持续出血表明一艘船可能已经损坏。
   18. 引导视网膜色素上皮细胞加载注射器针进入先导孔, 与开口朝下, 并在大约10-15 度的角度相对于巩膜的局部表面。
   19. 轻轻地将注射器针插入先导孔, 深度约500µm, 进入视网膜空间。应该有大约100µm 的边缘之间的黑色钢笔标记和点的针是覆盖的有色脉络膜 (图 1C和1D)。
   20. 请助手轻轻压低注射器的柱塞, 注入适当的细胞容积 (约1.2 µL)。准备提供一些反作为助手按下柱塞。
       注意:事先与助手的模拟练习可以为外科医生和助手提供必要的经验。
   21. 当视觉上专注于钢笔标记边缘, 按住注射器到位25-30 秒, 然后慢慢收回注射器。通常观察到少量的回流。
       注意:如果没有观察到回流, 可能有一个玻璃注射。如果你看到通过密封或在巩膜下填充细胞的回流, 注射太浅。
   22. 冲洗注射部位的细胞外排, 用无菌眼洗3次, 用棉签收集多余的。
   23. 在操作眼睛上涂抹一滴眼部润滑剂, 将大鼠转移到 OCT 站, 检查移植细胞的位置和视网膜疱疹的大小。

3. 注射后处理

1. 抗炎镇痛药治疗
   1. 在生理盐水皮下注射0.1 毫克/千克体重的丁丙诺啡以减少疼痛。
   2. 通过腹腔注射 (ip) 在生理盐水中注射地塞米松1.6 毫克/千克的体重以控制炎症。
2. 动物康复
   1. 将大鼠返回到热灯下的回收笼中, 以保持体温。
   2. 观察手术眼出血的迹象。
   3. 观察鼠, 确保它从麻醉中出来。
   4. 将被恢复的动物带回一个新的笼子, 用手术卡将笼子标记起来, 每天监测任何遇险、眼部出血或角膜混浊的迹象。如果有问题, 立即通知兽医。

结果

利用本文所描述的技术, 我们通过精确地控制插入到组织中的注射器针的位置、角度和深度, 将 hRPESC 视网膜色素上皮细胞送到 RCS 大鼠的视网膜空间中 (图 1B-D).在移植后立即进行 OCT 检查, 观察注射部位和移植细胞产生的视网膜疱疹。术后 OCT 评估是评估注射质量和视网膜损伤或出血监测的检查工具。在 OCT 扫描下, 可以清楚地看到视网膜疱疹 (图 2A、 C和D) 和注入站点 (图 2A和B)。视网膜疱疹通常在注射后24小时内解决。虽然泡的大小测量是困难的使用 OCT, 我们可以估计的疱疹面积假设它等于感光保存区的细胞移植。我们以前证明, 1 µL 注射5万细胞可能导致节省约6-7% 区域的 RCS 视网膜周围的注射站点¹³。如

讨论

本文所描述的视网膜注射技术是通过跨巩膜通路, 注射器针穿透眼壁的外层 (巩膜-脉络膜-RPE 复合体) 而不损害神经视网膜或扰乱玻璃腔。一个替代的反式 vitreal 方法有潜在的风险, 导致白内障的晶状体损伤, 因为啮齿目动物的镜头占据了大多数的玻璃腔。与这种方法相比, 我们的技术是低风险和造成最小的创伤, 因为注射器针不需要穿过整个玻璃腔, 以达到视网膜空间。事实上, 在我们的研究中, OCT 检查显示非常罕见的视网膜穿透事件, 并在动物的后续考试中, 没有持续的视网膜脱离。此外, 注射部位是非常小 (< 200 µm 直径) 时使用33口径注射器针, 因此结构干扰的巩膜-脉络膜-RPE 复合体是非常有限的。针回缩后, 注射孔自动 self-seals, 所以不需要缝合或组织胶。

手术并发症包括在注射区周围或在试验孔内过度出血。当使用钳子来抓住角膜缘的结膜缘时, 只有轻柔的力量才能避免捏血管和减少可能的出血。在创建先导孔之前, 检查预期的注射部位, 以避免表面血管的穿透。通过使用矛, 先导孔可以清除血液前插入的细胞注射针。如果在矛的几个应用之后, 从先导孔中流血, 可能会被破坏...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTA （1x）	Life Technologies	25200-072
DNAse I	Sigma	DN-25
1xDulbecco's 不含钙和镁 （1xDPBS-CMF）	康宁 Cellgro	431219
无菌平衡盐溶液 （BSS）	Alcon	00065079550
无菌洗眼液	Moore Medical	75519
无菌 0.9% 盐水	Hospira	488810
丙帕卡因滴眼液 （0.5%）	Akorn	17478026312
托吡卡胺滴眼液，USP （1%）	Bausch &Lomb	24208058559
苯肾上腺素眼液，USP （10%） 原液	Bausch &Lomb	42702010305	用于制造 2.5% Phenylepherine
Buprenex	Patterson	433502
Dexamethasone	APP Pharmaceuticals	63323051610
100% 乙醇	Thermo Scientific	615090040
70% 乙醇	Ricca Chemical Company	2546.70-5
无菌 GenTeal 润滑剂眼凝胶	诺华	78042947
无菌 Systane 超润滑滴眼液	Alcon	00065143105
hRPESC-RPE 细胞	非市		请参阅"参考 #12"了解细胞分离和维护。
24 孔板	康宁	3526
锥形管 （15 ml）	Sarstedt	62554002
带 O 形圈的微量离心机盖	LPS inc	L233126
无盖微量离心管 （1.7 ml）	LPS inc	L233041
离心机	Eppendorf	5804R
无菌酒精擦拭布	McKesson	58-204
无菌棉尖涂抹器	McKesson	24-106-2S
无菌 Weck-Cel 矛	Beaver-Visitec International
无菌手术单	McKesson	25-515
纱布	McKesson	16-4242
Nanofil 注射器 （10 ul）	World Precision Instruments	Nanofil
斜面 33 号针头	World Precision Instruments	NF33BV-2
胰岛素注射器针头 31 号	Becton Dickinson	328418
大鼠齿形镊子	World精密仪器	555041FT
Vannas微解剖弹簧剪刀	Roboz	RS-5602
循环水T泵	Stryker	TP700
加热垫	Kent Scientific	TPZ-814
动物麻醉系统	World Precision Instruments	EZ-7000
天平	Ohaus	PA1502
体视显微镜	蔡司	Stemi 2000
显微镜	肖特	ACE 系列
Bioptigen Envisu 光谱域眼科成像系统	Bioptigen	R2210
无菌黑色记号笔	Viscot Industries	1416S-100
微型测量秤	Ted Pella Inc	13623
红外晒照灯	EXO-TERRA	PT2144	在手术后恢复阶段用作动物的加热灯