需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

开发一种优化的大鼠眼经巩膜视网膜下人视网膜色素上皮细胞移植方案

9.2K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/55220

⸱

2017年8月12日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Neural Stem Cell Institute

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

视网膜下注射已广泛应用于年龄相关性黄斑变性干细胞替代治疗的临床前研究。在本可视化文章中，我们描述了一种经巩膜途径向大鼠眼内递送细胞的、风险更低、可重复且精确改良的视网膜下注射技术。

摘要

年龄相关性黄斑变性（AMD）等退行性视网膜疾病是全球不可逆视力丧失的首要原因。AMD 的特征是视网膜色素上皮（RPE）细胞退化，这些细胞构成单层结构，在功能上支持并解剖上包裹神经视网膜。目前针对非新生血管性 AMD（干性 AMD）的药物治疗仅能延缓疾病进展，无法恢复视力，因此迫切需要开展研究以探索新的治疗策略。用健康细胞替代退化的 RPE 细胞，有望成为未来治疗干性 AMD 的有效手段。在针对 AMD 的干细胞替代疗法的大量临床前研究中，通常采用将干细胞来源的 RPE 细胞移植至动物模型视网膜下腔的方法，该过程应用了视网膜下注射技术。这些临床前动物实验中最常用的方法是经巩膜途径，但由于无法直接观察针尖位置，操作难度较大，且常导致视网膜损伤。另一种经玻璃体途径虽可直接观察针尖位置，但因扰动更多眼部组织，手术创伤风险较高。我们开发了一种风险更低且可重复性更高的改良经巩膜注射方法，通过精确控制进针角度和深度，成功且稳定地将 RPE 细胞递送至大鼠视网膜下腔，并避免了过度的视网膜损伤。此前已有研究证实，采用该方法递送的细胞在皇家外科学院（RCS）大鼠模型中至少 2 个月内具有治疗效果。该技术不仅可用于细胞移植，还可用于小分子或基因治疗药物的递送。

引言

位于眼球后部的人类视网膜作为感光组织，在视觉感知中发挥关键作用。因此，视网膜细胞功能障碍或细胞死亡会导致视力问题或永久性失明。涉及视网膜不同层次细胞变性或功能障碍的疾病被称为变性性视网膜疾病，其中年龄相关性黄斑变性（AMD）是最常见的类型，也是发达国家老年人不可逆失明的首要原因1,2. 年龄相关性黄斑变性（AMD）的病理过程与 "玻璃膜疣" RPE层与下方布鲁赫膜之间发生物质积聚，进而损害RPE对光感受器生理功能的支持作用，导致神经视网膜萎缩和视力丧失3,4,5目前，对于晚期干性（非新生血管性）年龄相关性黄斑变性（AMD）尚无治愈方法。干细胞疗法作为再生医学中的新范式，为用干细胞来源的健康细胞替代功能障碍或死亡的视网膜色素上皮（RPE）细胞带来了希望。事实上，已有大量关于移植干细胞的临床前研究例如将人胚胎干细胞（human embryonic stem cell）来源的视网膜色素上皮（RPE）细胞移植至RPE退行性动物模型的研究已开展6,7，其中一些已进入临床试验阶段8,9 (NCT01344993，ClinicalTrials.gov)。近期，本实验室鉴定出一种位于人视网膜色素上皮（RPE）层的新型干细胞来源——人RPE干细胞（hRPESCs），目前正用于年龄相关性黄斑变性（AMD）的hRPESC来源的RPE细胞（hRPESC-RPE）移植治疗的临床前研究10,11,12,13.

在上述多个研究团队（包括我们团队）开展的临床前研究中，均采用了视网膜下注射技术。在动物模型中，视网膜下注射主要有两种方法：经玻璃体途径和经巩膜途径。经玻璃体途径的优势在于，外科医生可直接观察到针尖穿透眼前部、穿过晶状体旁整个玻璃体腔，并在眼球后部穿透视网膜进入视网膜下腔的过程14,15,16。然而，该方法需在视网膜的前部和后部两处造成损伤，存在损伤晶状体的风险，且在拔出针头时可能导致细胞反流至玻璃体腔内。相比之下，经巩膜途径理论上可避免对视网膜和玻璃体的干扰，反流液可直接排出眼外。在色素性啮齿类动物中，术者最初可观察到针尖穿透巩膜的过程，但一旦进入色素化的脉络膜后，针尖即不再可见。由于缺乏直接可视性，穿透视网膜时容易发生视网膜分离，并导致细胞和/或血液进入玻璃体腔。此外，由于眼球表面呈曲面状，很难确定经巩膜注射时最有效的针头角度和进针深度。

在本可视化文章中，我们介绍了一种基于术后光学相干断层扫描（OCT）评估的经巩膜下视网膜注射方法，该方法可对注射部位进行详细观察。我们的经巩膜注射技术采用明确的定位、进针角度和深度，从而实现极低的手术创伤和高可靠性。本文中，我们具体展示了将 hRPESC-RPE 细胞注射至 RCS 大鼠视网膜下腔的过程，RCS 大鼠是人类年龄相关性黄斑变性（AMD）的临床前模型。利用该注射方法，我们成功且稳定地将 hRPESC-RPE 细胞递送至 RCS 大鼠眼的视网膜下腔，成功率极高。先前研究发现，细胞注射可在注射后至少 2 个月维持 RCS 感光细胞的存活13。该操作在解剖显微镜下进行，易于学习掌握，需两名人员（一名手术者和一名助手）共同完成注射，每只动物的平均注射时间少于 5 分钟。明确的进针角度和深度使得在缺乏 OCT 设备的实验室也能成功实施视网膜下注射。该方法可实现高度可重复的视网膜下腔通路，不仅适用于细胞移植，还可用于药物递送和基因治疗。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有涉及动物的实验程序均已获得纽约州立大学奥尔巴尼分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 注射前准备

  1. hRPESC-RPE细胞悬液的制备
    注意：以下所有步骤均须在无菌细胞培养操作台内进行，操作者需熟悉基本的无菌技术。
    1. 从50至90岁人类供体眼球中分离原代hRPE细胞，并在24孔板中培养细胞12. 在第1代时冻存细胞，按需复苏，并培养第2代（P2）细胞4-5周（图1A用于注射。
    2. 移除培养基12 并用500 µL预热的不含钙的1X杜尔贝科磷酸盐缓冲液轻柔冲洗孔板两次 & 镁（1x DPBS-CMF）：使用1,000 µL移液器将1X DPBS-CMF加入孔板中，随后用真空泵吸除。
    3. 向每孔中加入 300 µL 胰蛋白酶/DNA酶。将hRPESC-RPE细胞在胰蛋白酶/DNA酶（每1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA中含4 kU DNA酶）中于37 °C孵育4 min，以解离细胞。
    4. 在显微镜下观察细胞是否已变圆。若细胞尚未变圆，继续将细胞在胰蛋白酶/DNase中孵育额外2分钟。
    5. 待细胞变圆后，用1,000 µL移液器吹打使细胞从孔中完全脱离，并将含有胰蛋白酶/脱氧核糖核酸酶的悬浮细胞转移至15 mL锥形管中，加入等体积预热的培养基以中和胰蛋白酶/脱氧核糖核酸酶活性。
    6. 用预热的1X DPBS-CMF轻轻吹打洗涤孔板，特别是孔的边缘区域；然后将这些细胞加入之前的锥形管中。
    7. 在4 °C条件下，以286 × g离心5分钟，使细胞沉淀至锥形管底部。
    8. 吸除上清液，并用1 mL培养基重悬细胞。
    9. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。
    10. 在 4 °C 条件下以 286 x g 离心 5 分钟，使细胞沉淀。
    11. 移除上清液，并将细胞重悬于无菌平衡盐溶液（BSS）中，浓度为 50,000 个细胞/µL（以便在视网膜下注射时每 1 µL 体积输送 50,000 个细胞）。
    12. 将最终的细胞悬液（CS）转移至1.7 mL微量离心管中，置于冰水混合物中保存，直至用于注射。
  2. 细胞注射器的制备
    1. 将无菌的33号斜面针头插入注射器中，并拧紧以组装注射装置。
    2. 用100%乙醇冲洗注射器5至6次。
    3. 用70%乙醇冲洗进样器5至6次。
    4. 用BSS冲洗注射器5到6次。
    5. 在解剖显微镜下，使用无菌黑色记号笔在注射针尖端下方600 µm处做标记图1B).
    6. 将注射器置于显微操作仪上用于注射。

2. 视网膜下注射

  1. 手术区域与动物准备
    1. 称量一只4-5周龄的RCS大鼠（60-100 g），并使用异氟烷蒸气输送系统进行麻醉。
      注意：诱导麻醉时，保持异氟烷气流速率为5%。通过按压大鼠足垫确认麻醉深度，随后将气流速率降低至2-3%以维持术中麻醉。
    2. 在解剖显微镜的载物台上铺设无菌手术巾，并在其下方放置加热垫，以建立无菌手术区域。
    3. 将大鼠转移至手术区域，并将其鼻部接入连接异氟烷系统的鼻罩，以维持麻醉状态。
    4. 用纱布覆盖大鼠身体，并轻捏其脚趾以确认已完全麻醉。
  2. 显微镜下经巩膜视网膜下注射
    1. 在大鼠未手术眼上滴一滴眼用润滑剂。
    2. 将大鼠置于右侧卧位，使其左眼朝上以便注射，头部朝向术者右手侧，背部朝向术者。
    3. 用小剪刀修剪遮挡眼睛的胡须。
    4. 从左眼颞侧滴入少量眼冲洗液，并用棉签在鼻侧收集多余液体，以清洗眼球表面。
    5. 滴入一滴1%托吡卡胺和一滴2.5%去氧肾上腺素（手术当天将10%去氧肾上腺素用无菌0.9%生理盐水稀释配制而成），以散大瞳孔，便于术后OCT检查。
    6. 轻轻牵拉眼周皮肤4-6次，使眼睑张开，眼球轻微前突，便于接近角膜缘后方区域。
    7. 滴一滴眼冲洗液，保持眼球湿润。
    8. 轻轻吹打重悬CS细胞悬液（步骤1.1.12中制备），并将注射器吸取1.2 µL CS。额外的0.2 µL用于补偿注射过程中的回流损失。
      注意：根据我们的测量，当注射浓度为50,000 cells/µL时，约有5,000-8,000个细胞因回流而丢失，相当于约10-16%的细胞损失；因此额外注射0.2 µL CS以补偿该损失。
    9. 将装有CS的注射器固定于显微操作仪上（或由助手手持），保持垂直方向，因为RPE细胞在悬液中容易沉降。
    10. 在眼球表面滴一滴0.5%丙帕卡因（局部表面麻醉剂），并用棉签吸除多余液体。
      注意：此步骤可抑制角膜反射，防止后续操作中眼球眨眼。
    11. 用镊子夹住角膜缘后方的结膜组织，将眼球向鼻侧旋转，并提起结膜形成一个"帐篷"结构。
    12. 用剪刀剪开"帐篷"顶部，在结膜上制造一个小开口，暴露下方的巩膜。
    13. 用镊子夹住靠近角膜缘的剩余结膜边缘，将眼球向鼻侧旋转，使瞳孔轴线与台面成约30度角（图1C）。在整个穿刺过程中需持续夹持结膜边缘，以提供反向牵引力并维持眼球处于最佳角度。
    14. 为细胞注射做引导孔，将无菌斜面31号胰岛素针头末端置于角膜缘后1,200-1,500 µm处，针尖开口朝上。
    15. 调整胰岛素针头角度，使其高于巩膜表面10-15度（与预定注射部位的假想平面相切）。缓慢穿透脉络膜-巩膜复合体，进针深度约500 µm。在色素性大鼠中，针尖会“消失”于色素化的脉络膜下方。本实验所用胰岛素针型号，其针尖至斜面的距离为500 µm。
    16. 小心撤出胰岛素针头（可能观察到极少量血液渗出）。
    17. 若出血明显，必要时可用眼用棉签清理穿刺孔。若棉签处理后仍持续出血，提示可能损伤了血管。
    18. 将装载RPE细胞的注射针头引导进入引导孔，针头开口朝下，与巩膜局部表面成约10-15度角。
    19. 轻柔地将注射针插入引导孔约500 µm深，以进入视网膜下腔。黑色记号笔标记边缘与针头被色素脉络膜覆盖处之间应保留约100 µm的安全距离（图1C 和 1D）。
    20. 请助手缓慢推动注射器活塞，注入适量细胞（约1.2 µL）。当助手推动活塞时，应准备施加适当的反向阻力。
      注意：术前与助手进行模拟练习，有助于双方熟悉此操作步骤。
    21. 在显微镜下聚焦观察记号边缘，保持注射针原位25-30秒，然后缓慢撤出注射针。通常可观察到少量回流。
      注意：若未见回流，可能发生了玻璃体内注射；若在封闭处看到回流或细胞积聚于巩膜下方，则提示注射过浅。
    22. 用无菌眼冲洗液冲洗注射部位3次，并用棉签吸除多余液体。
    23. 在手术眼上滴一滴眼用润滑剂，将大鼠转移至OCT检测站，检查移植细胞的位置及视网膜下隆起的大小。

3. 注射后处理

  1. 抗炎与镇痛治疗
    1. 皮下注射盐水配制的布托啡诺（buprenorphine），剂量为 0.1 mg/kg 体重，以减轻疼痛。
    2. 腹腔注射（I.P.）盐水配制的地塞米松（dexamethasone），剂量为 1.6 mg/kg 体重，用于控制炎症。
  2. 动物恢复
    1. 将大鼠放回恢复笼中，并置于加热灯下以维持体温。
    2. 观察手术眼是否有出血迹象。
    3. 观察大鼠，确保其从麻醉中苏醒。
    4. 将恢复后的大鼠转移至清洁笼具中，并用手术卡片标记该笼，每日监测是否存在痛苦迹象、眼部出血或角膜混浊等情况；如有异常，立即通知兽医。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

采用本文所述技术，我们通过精确控制注射针插入组织的位置、角度和深度，成功将hRPESC-RPE细胞持续递送至RCS大鼠的视网膜下腔（图1B-D）。移植后立即进行光学相干断层扫描（OCT）检查，以观察注射部位及移植细胞形成的视网膜下隆起（subretinal bleb）。术后OCT评估可作为评估注射质量以及监测视网膜损伤或出血的筛查工具。OCT扫描可清晰显示视网膜下隆起（图2A、C和D）及注射部位（图2A和B）。视网膜下隆起通常在注射后24小时内自行消退。尽管通过OCT难以精确测量隆起的大小，但我们可以假设其面积等于细胞移植所保护的光感受器区域面积，从而进行估算。我们先前已证实，注射1 µL含50,000个细胞的悬液，可在注射部位周围挽救约6-7%的RCS大鼠视网膜区域13。如...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本文所展示的视网膜下注射技术采用经巩膜途径，即注射针穿透眼球壁的外层结构（巩膜-脉络膜-视网膜色素上皮复合体），而不损伤神经视网膜或干扰玻璃体腔。另一种经玻璃体腔的注射方法存在损伤晶状体导致白内障的潜在风险，因为啮齿类动物的晶状体占据了玻璃体腔的大部分空间。与该方法相比，我们的技术风险更低，造成的创伤极小，因为注射针无需穿过整个玻璃体腔即可到达视网膜下间隙。事实上，我们在研究中通过光学相干断层扫描（OCT）检查发现，视网膜穿透事件极为罕见，且在动物后续检查中未出现持续性视网膜脱离。此外，使用33号注射针时，注射部位非常小（< 200 µm 直径），因此对巩膜-脉络膜-视网膜色素上皮复合体的结构干扰极为有限。针头回撤后，注射孔可自动闭合，无需缝合或使用组织胶。

手术可能出现的并发症包括注射区域周围或导孔内部出血过多。使用镊子夹持角膜缘处的结膜边缘时，仅需施加轻微力量，以避免夹伤血管并减少可能的出血。在制作导孔前，应检查预定的注射部位，避免穿透表层血管。使用穿刺针可在插入细胞注射针前清除导孔内的血液。若反复使用穿刺针数次后导孔仍持续出血，则可能已有血管破裂。我们观察到的另一并发...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢Patty Lederman在手术方面的协助，以及Susan Borden在RPE细胞制备方面的帮助。同时感谢NYSTEM C028504对本项目的资助。Justine D. Miller由NIH资助项目F32EY025931支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTA (1×)Life Technologies25200-072
DNA酶ISigmaDN-25
1×Dulbecco’不含钙的磷酸盐缓冲液 &和镁（1xDPBS-CMF）Corning Cellgro431219
无菌平衡盐溶液（BSS）Alcon00065079550
无菌洗眼液摩尔医学75519
无菌0.9%生理盐水Hospira488810
盐酸丙帕他卡因滴眼液（0.5%）阿克恩17478026312
托吡卡胺滴眼液，USP（1%）Bausch && 罗姆24208058559
盐酸去氧肾上腺素滴眼液，美国药典标准（10%）储备液Bausch && 罗姆42702010305用于配制2.5%去氧肾上腺素溶液
BuprenexPatterson433502
地塞米松APP Pharmaceuticals63323051610
100% 乙醇赛默飞世尔科技615090040
70% 乙醇Ricca Chemical Company2546.70-5
无菌GenTeal润滑眼用凝胶诺华78042947
无菌Systane Ultra润滑型滴眼液爱尔康00065143105
hRPESC-RPE 细胞未商业化供应请参阅 "参考文献编号12" 用于细胞分离与培养。
24孔板康宁3526
锥形管（15 ml）Sarstedt62554002
带O形圈的微量离心管盖LPS 刺激L233126
无盖微型离心管（1.7 ml）LPS 刺激L233041
离心Eppendorf5804R
无菌酒精擦拭巾McKesson58-204
无菌棉签McKesson24-106-2S
无菌 Weck-Cel 棉签Beaver-Visitec International 0008680
无菌手术巾 McKesson25-515
纱布McKesson16-4242
纳米注射器（10 μl）World Precision Instruments纳米纤维
纳米细斜面33号针头世界精密仪器公司NF33BV-2
胰岛素注射器针头 31 号规格Becton Dickinson328418
大鼠齿镊世界精密仪器公司555041FT
万纳斯显微解剖弹簧剪RobozRS-5602
循环水T型泵 StrykerTP700
加热垫Kent ScientificTPZ-814
动物麻醉系统世界精密仪器公司EZ-7000
平衡OhausPA1502
体视显微镜ZeissStemi 2000
显微镜光源SchottACE系列
Bioptigen Envisu 光谱域眼科成像系统BioptigenR2210
无菌黑色记号笔Viscot Industries1416S-100
微型测量尺Ted Pella 公司13623
红外加热灯 EXO-TERRAPT2144这用作动物术后恢复期间的加热灯  相

参考文献

  1. De Jong, P. T. Age-related macular degeneration. N Engl J Med. 355, 1474-1485 (2006).
  2. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
  3. Ambati, J., Fowler, B. J. Mechanisms of agerelated macular degeneration. Neuron. 75, 26-39 (2012).
  4. Abdelsalam, A., Del Priore, L. V., Zarbin, M. A. Drusen in age-related macular degeneration: Pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression. Surv Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).
  5. Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W. Age-related macular degeneration. N Engl J Med. 358 (24), 2606-2617 (2008).
  6. Lund, R. D., et al. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).
  7. Vugler, A., et al. Embryonic stem cells and retinal repair. Mech Dev. 124 (11-12), 807-829 (2007).
  8. Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
  9. Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
  10. Stanzel, B. V., et al. Human RPE Stem Cells Grown into Polarized RPE Monolayers on a Polyester Matrix Are Maintained after Grafting into Rabbit Subretinal Space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
  11. Blenkinsop, T. A., et al. Human adult retinal pigment epithelial stem cell-derived RPE monolayers exhibit key physiological characteristics of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7085-7099 (2015).
  12. Salero, E., et al. Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
  13. Davis, J. R., et al. Human RPE Stem Cell-Derived RPE Preserves Photoreceptors in the Royal College of Surgeons Rat: Method for Quantifying the Area of Photoreceptor Sparing. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (5), 304-309 (2016).
  14. Westenskow, P. D., et al. Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension. J Vis Exp. (95), e52247(2015).
  15. Lopez, R., et al. Transplanted Retinal Pigment Epithelium Modifies the Retinal Degeneration in the RCS Rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (3), 586-588 (1989).
  16. Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina. J Vis Exp. (84), e50932(2014).
  17. Nair, G., et al. Effects of Common Anesthetics on Eye Movement and Electroretinogram. Doc Ophthalmol. 122 (3), 163-176 (2011).
  18. McGill, T. J., et al. Transplantation of human central nervous system stem cells - neuroprotection in retinal degeneration. Eur J Neurosci. 35, 468-477 (2012).
  19. Al-Hussaini, H., Kam, J. H., Vugler, A., Semo, M., Jeffery, G. Mature retinal pigment epithelium cells are retained in the cell cycle and proliferate in vivo. Mol Vis. 14, 1784-1791 (2008).
  20. Wang, S., Lu, B., Wood, P., Lund, R. D. Grafting of ARPE-19 and Schwann Cells to the Subretinal Space in RCS Rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (7), 2552-2560 (2005).
  21. Fabian, R. J., Bond, J. M., Drobeck, H. P. Induced corneal opacities in the rat. Br J Ophthalmol. 51 (2), 124-129 (1967).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

开发一种优化的大鼠眼经巩膜视网膜下人视网膜色素上皮细胞移植方案
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。