方法文章

三维磁性干细胞聚合并结合生物反应器成熟化用于软骨再生

DOI:

10.3791/55221

2017年4月27日

本文内容

摘要

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干细胞向软骨分化需要精细调控培养条件。本文介绍一种利用磁力方法聚集细胞的技术,这是启动软骨分化的关键步骤。此外,我们还表明,在生物反应器中进行动态成熟培养可对细胞构建物施加机械刺激,从而增强软骨样细胞外基质的生成。

摘要

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软骨组织工程由于在构建一种 体外 功能上类似于天然组织的植入物。近期探索的一种用于构建自体替代物的方法,涉及将干细胞分化为软骨细胞。为启动这一软骨形成过程,需要一定程度的干细胞聚集;因此,我们证明了利用微型化磁场源作为细胞吸引装置,可在厚支架内及无支架条件下实现细胞的磁性浓缩。该磁性方法还被用于引导细胞聚集体融合,构建出尺寸达数毫米、无支架且结构有序的三维(3D)组织。与对照相比,通过磁驱动融合形成的组织不仅体积显著增大,且II型胶原表达明显升高,聚集蛋白聚糖的表达也呈现相似的上升趋势。鉴于天然软骨在发育过程中受到力学作用影响其三维结构,本研究进一步实施了动态成熟培养。采用可提供机械刺激的生物反应器,对经磁性接种的支架进行为期21天的培养。生物反应器中的成熟过程显著促进了细胞支架内的软骨形成,所得细胞外基质富含II型胶原和聚集蛋白聚糖。本研究阐明了磁性浓缩标记干细胞结合生物反应器动态成熟培养在促进软骨向分化方面的创新潜力,无论是在无支架条件下还是在多糖支架内均具有应用前景。

引言

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磁性纳米颗粒已作为磁共振成像(MRI)的对比剂在临床中应用,其治疗用途也在不断拓展。例如,最近研究表明,标记的细胞可以被操控 体内 利用外部磁场,可被引导和/或维持在特定的植入部位1,2,3在再生医学中,它们可用于构建有序的组织 体外4,包括血管组织5,6,7,骨骼8,以及软骨9.

关节软骨处于无血管环境,因此当损伤发生时,细胞外基质成分的修复能力非常有限。正因如此,目前的研究主要集中在工程化透明软骨替代物的开发上,以用于植入损伤部位。为了制备自体来源的替代物,一些研究团队正在探索使用自体软骨细胞作为细胞来源10,11,而另一些团队则强调间充质干细胞(MSC)向软骨细胞分化的潜能....

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方案

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1. 磁性装置的构建

注意:用于细胞接种的装置根据应用而有所不同(图1)。为了形成细胞聚集体,每个聚集体的细胞数量限制为 2.5×105 个,因此磁性尖端必须非常细(直径 750 µm)。为了在 1.8 cm2、7 mm 厚的支架上接种细胞,磁体必须更大(直径 3 mm),以确保细胞通过支架的孔隙迁移。

  1. 构建用于聚集体形成的微磁体装置(图1A
    1. 使用直径为0.8 mm的钻头在铝板(直径3 cm,厚度6 mm)上钻出微孔。
    2. 将磁性尖端(直径750 µm)插入板的每个孔中。
    3. 将该圆盘置于一块永磁钕磁铁上,以确保磁化至饱和。
  2. 构建用于支架接种的装置(图1B
    1. 将硬质聚苯乙烯切割成2.4 cm2的正方形。
    2. 在1.6 cm2 的面积上等距插入9个小磁体(直径3 mm,长6 mm)。
    3. 将该装置置于一块永磁钕磁铁上。

2. 干细胞标记

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结果

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首先,可通过微磁体单独形成聚集体,方法是接种 2.5×105 个标记的干细胞(图 2A)。这些单个聚集体(大小约 0.8 mm)随后可通过连续的磁力诱导融合形成更大的结构。例如,在软骨成熟第 8 天,将聚集体两两接触形成双聚体;第 11 天通过合并两个双聚体组装成四聚体;最终在第 15 天,将 4 个四聚体融合形成一个包含最初 16 个聚集体的三维结构,总细胞数为 4×106 个(大小约 4 mm)(图 2B)。其次,相同的磁吸引技术已被用于在支架内形成细胞聚集体。将支架接种于磁性装置上,可在支架孔隙内的精确微磁体位置观察到高度浓缩的细胞(图 2C)。相比之下,当在无磁吸引条件下将细胞接种于支架内(被动接种)时,细胞呈均匀分布。随后将细胞化的支架置入笼状结构中(图 3A),并连接至生物反应器腔室,以在动态成熟条件下进行软骨生成过程(图 3B)。该类生物反应器可改.......

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讨论

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首先,由于本文介绍的技术依赖于磁性纳米颗粒的细胞内化,因此一个重要的问题是纳米颗粒在细胞内定位后的去向。确实,铁基纳米颗粒可能因其尺寸、包被材料及暴露时间的不同,引发潜在的毒性或影响细胞的分化能力19,22然而,多项研究表明,使用包封的铁纳米颗粒时,对细胞生理学没有影响23 以磁铁蛋白的形式,一种生物磁性纳米颗粒24,或使用简单的柠檬酸盐包被并具有适当浓度18此外,当氧化铁纳米颗粒在与本文所述相似的条件下使用时(与间充质干细胞共用并用于软骨生成),我们最近证明,在细胞摄取及间充质干细胞球体形成后约10天内,纳米颗粒在内体中会发生快速且近乎完全的降解。有趣的是,这种大规模的降解与游离铁在铁蛋白中的高效储存密切相关,对细胞铁代谢的影响极为有限,预示着其在临床应用中具有良好的前景。25.

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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作者谨此感谢QuinXell Technologies和CellD,特别是Lothar Grannemann和Dominique Ghozlan在生物反应器方面的协助。我们感谢Catherine Le Visage提供了普鲁兰糖/葡聚糖多糖支架。本研究得到了欧洲联盟(ERC-2014-CoG项目MaTissE 648779)以及法国国家研究局(Agence Nationale de la Recherche, ANR)(MagStem项目ANR-11 SVSE5)的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
氧化铁(磁赤铁矿)纳米颗粒(γ-Fe2O3PHENIX - 巴黎第六大学由 C. Ménager 制备并提供平均直径为 8.1 nm,表面带负电荷
多糖普鲁兰/葡聚糖支架LIOAD - 南特大学由 C. Le Visage 制备并提供由碱性条件下(10 M NaOH)的 75:25 普鲁兰/葡聚糖混合物制备而成。孔隙尺寸:185–205 µm;厚度:7 mm;表面积:1.8 cm2
TisXell 再生系统QuinXell TechnologiesQX900-002具有 500 mL 培养腔的双轴生物反应器 
支架用笼:Histosette II M492 VWR720-0909
间充质干细胞(MSC)LonzaPT-2501使用了三个独立批次
MSCGM BulletKit 培养基LonzaPT-3001配制完全培养基时,将提供的 BulletKit(含血清、谷氨酰胺和抗生素)加入 MSCGM 培养基中
含 Glutamax I 的 DMEM 培养基Life Technologies31966-021不含丙酮酸钠,不含 HEPES
RPMI 1640 培养基,不含谷氨酰胺Life Technologies31870-025不含丙酮酸钠,不含 HEPES
不含 CaCl2 和 MgCl2 的 PBSLife Technologies14190-094
0.05% 胰蛋白酶-EDTA(1x)Life Technologies25300-054
青霉素(10,000 U/mL)/链霉素(10,000 µg/mL)Life Technologies15140-122
ITS 通用培养补充剂预混液(20x)Corning354352
100 mM 丙酮酸钠溶液SigmaS8636
L-抗坏血酸-2-磷酸SigmaA8960使用蒸馏水现配成 25 mM 的浓缩溶液
L-脯氨酸SigmaP5607用蒸馏水配制成 175 mM 的储存液,并于 4 °C 保存
地塞米松SigmaD4902用 100% 乙醇配制成 1 mM 的储存液,并于 -20 °C 保存
TGF-β3 蛋白 10 µgInterchim30R-AT028
三水合柠檬酸钠VWR33615.268用蒸馏水配制成 1 M 的储存液,并于 4 °C 保存
来自 Bacillus acidopullulyticus 的普鲁兰酶SigmaP2986
来自 Chaetomium erraticum 的葡聚糖酶SigmaD0443
NucleoSpin RNA 提取试剂盒Macherey-Nagel740955.5
SuperScript II 逆转录酶Life Technologies18064-014
随机引物-六聚体 PromegaC1181500 µg/mL:使用时稀释至 1/2,每样本加入 1 µL
重组 RNAsin 核糖核酸酶抑制剂PromegaN251140 U/µL:每样本加入 1 µL
PCR 核苷酸 dNTP 混合液(每种 10 mM)Roche10842321
SyBr Green PCR 主混合液Life Technologies4368708
Step One Plus 实时荧光定量 PCR 系统Life Technologies4381792
10% 中性缓冲福尔马林溶液SigmaHT5012
OCT 包埋剂VWR361603E
异戊烷SigmaM32631
甲苯胺蓝 OVWR1.15930.0025
无水乙醇VWR20821.310
甲苯VWR1.08323.1000
封片剂 PertexHistolab840
qPCR 用 RPLP0 引物Eurogentec5'-TGCATCAGTAC
CCCATTCTATCAT-3';
5'-AAGGTGTAATC
CGTCTCCACAGA-3'
qPCR 用聚集蛋白聚糖引物Eurogentec5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3';3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5'
qPCR 用 II 型胶原引物Eurogentec5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3';3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5'

参考文献

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  1. Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A. Clinical imaging in regenerative medicine. Nat Biotechnol. 32 (8), 804-818 (2014).
  2. Edmundson, M., Thanh, N. T., Song, B. Nanoparticles based stem cell tracking in regenerative medicine. Theranostics. 3 (8), 573-582 (2....

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重印与许可

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