三维磁性干细胞聚合并结合生物反应器成熟化用于软骨再生

摘要

干细胞向软骨分化需要精细调控培养条件。本文介绍一种利用磁力方法聚集细胞的技术，这是启动软骨分化的关键步骤。此外，我们还表明，在生物反应器中进行动态成熟培养可对细胞构建物施加机械刺激，从而增强软骨样细胞外基质的生成。

摘要

软骨组织工程由于在构建一种 体外 功能上类似于天然组织的植入物。近期探索的一种用于构建自体替代物的方法，涉及将干细胞分化为软骨细胞。为启动这一软骨形成过程，需要一定程度的干细胞聚集；因此，我们证明了利用微型化磁场源作为细胞吸引装置，可在厚支架内及无支架条件下实现细胞的磁性浓缩。该磁性方法还被用于引导细胞聚集体融合，构建出尺寸达数毫米、无支架且结构有序的三维（3D）组织。与对照相比，通过磁驱动融合形成的组织不仅体积显著增大，且II型胶原表达明显升高，聚集蛋白聚糖的表达也呈现相似的上升趋势。鉴于天然软骨在发育过程中受到力学作用影响其三维结构，本研究进一步实施了动态成熟培养。采用可提供机械刺激的生物反应器，对经磁性接种的支架进行为期21天的培养。生物反应器中的成熟过程显著促进了细胞支架内的软骨形成，所得细胞外基质富含II型胶原和聚集蛋白聚糖。本研究阐明了磁性浓缩标记干细胞结合生物反应器动态成熟培养在促进软骨向分化方面的创新潜力，无论是在无支架条件下还是在多糖支架内均具有应用前景。

引言

磁性纳米颗粒已作为磁共振成像（MRI）的对比剂在临床中应用，其治疗用途也在不断拓展。例如，最近研究表明，标记的细胞可以被操控 体内 利用外部磁场，可被引导和/或维持在特定的植入部位^1,2,3在再生医学中，它们可用于构建有序的组织 体外⁴，包括血管组织^5,6,7，骨骼⁸，以及软骨⁹.

关节软骨处于无血管环境，因此当损伤发生时，细胞外基质成分的修复能力非常有限。正因如此，目前的研究主要集中在工程化透明软骨替代物的开发上，以用于植入损伤部位。为了制备自体来源的替代物，一些研究团队正在探索使用自体软骨细胞作为细胞来源^10,11，而另一些团队则强调间充质干细胞（MSC）向软骨细胞分化的潜能^12,13。在本研究回顾的前期工作中，我们选择了MSC，因为其骨髓取样相对简便，且无需牺牲健康软骨细胞，从而避免了后者可能发生的表型丢失风险¹⁴。

启动干细胞软骨向分化的关键早期步骤之一是细胞的聚集。通常采用离心或微团培养方法形成细胞聚集体¹⁵；然而，这些聚集方法既无法在较厚的支架内形成细胞簇，也无法控制聚集体之间的融合。本文中，我们介绍了一种利用间充质干细胞（MSC）磁性标记与磁力吸引来聚集干细胞的创新方法。该技术已被证实可通过聚集体之间的融合形成无支架的三维结构，从而获得毫米尺度的软骨组织⁹。对厚而大的支架进行磁性接种，还为增加工程化组织的尺寸、设计更适用于植入的形状以及拓展软骨修复领域的临床应用潜力提供了可能。本文详细描述了将MSC磁性接种至由天然多糖——普鲁兰多糖（pullulan）和葡聚糖（dextran）构成的多孔支架中的实验方案，此类支架此前已被用于限制干细胞^16,17。最后，在生物反应器中进行软骨向分化，以确保营养物质和气体能够持续扩散至高密度接种细胞的支架基质核心。该生物反应器不仅为细胞提供营养、软骨诱导生长因子和气体，还可提供机械刺激。总体而言，用于限制干细胞的磁性技术结合生物反应器中的动态成熟培养，可显著增强软骨向分化效果。

方案

1. 磁性装置的构建

注意：用于细胞接种的装置根据应用而有所不同（图1）。为了形成细胞聚集体，每个聚集体的细胞数量限制为 2.5×10⁵ 个，因此磁性尖端必须非常细（直径 750 µm）。为了在 1.8 cm²、7 mm 厚的支架上接种细胞，磁体必须更大（直径 3 mm），以确保细胞通过支架的孔隙迁移。

1. 构建用于聚集体形成的微磁体装置（图1A）
   1. 使用直径为0.8 mm的钻头在铝板（直径3 cm，厚度6 mm）上钻出微孔。
   2. 将磁性尖端（直径750 µm）插入板的每个孔中。
   3. 将该圆盘置于一块永磁钕磁铁上，以确保磁化至饱和。
2. 构建用于支架接种的装置（图1B）
   1. 将硬质聚苯乙烯切割成2.4 cm²的正方形。
   2. 在1.6 cm² 的面积上等距插入9个小磁体（直径3 mm，长6 mm）。
   3. 将该装置置于一块永磁钕磁铁上。

2. 干细胞标记

注：干细胞使用 0.1 mM 磁性纳米颗粒标记 30 分钟（2.6 ± 0.2 pg 铁/细胞）以形成细胞聚集体，而用于接种支架时则使用 0.2 mM 磁性纳米颗粒标记 30 分钟（5 ± 0.4 pg 铁/细胞）。此前已发表的研究中曾使用过这些纳米颗粒浓度和孵育时间处理间充质干细胞（MSC）及其他细胞^18,19，并已确定纳米颗粒对细胞活力及 MSC 的分化能力均无影响。干细胞摄入的铁含量通过单细胞磁泳法测定^19,20。

1. 在完全的间充质干细胞生长培养基（MSCGM）中，于 37 °C 和 5% CO₂ 条件下培养人源间充质干细胞（MSC），直至细胞接近汇合（约 90%）。
2. 通过将 0.1 或 0.2 mM 柠檬酸包被的磁赤铁矿氧化铁纳米颗粒（γFe₂O₃；核心直径：8 nm）溶于无血清的 RPMI 修饰型 McCoy's 5A 培养基（不含谷氨酰胺）并添加 5 mM 柠檬酸钠，制备磁性标记溶液。
3. 弃去培养基，用无谷氨酰胺的无血清 RPMI 培养基冲洗细胞，然后每 150 cm² 培养瓶加入 10 mL 氧化铁纳米颗粒溶液，该体积为覆盖全部细胞所需的最小体积。
4. 在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育 30 分钟，随后弃去纳米颗粒溶液。用无谷氨酰胺的无血清 RPMI 培养基冲洗 5 分钟，以促进仍附着于细胞膜表面的纳米颗粒内化。
5. 弃去 RPMI 培养基，每瓶加入 25 mL 完全 MSCGM 培养基，在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下过夜孵育。

3. 磁性细胞接种

1. 使用高糖 Dulbecco 改良伊格尔培养基（DMEM）含 L-谷氨酰胺，添加 50 µM L-抗坏血酸 2-磷酸、0.1 µM 地塞米松、1 mM 丙酮酸钠、0.35 mM L-脯氨酸、1% 含胰岛素、人转铁蛋白和亚硒酸的通用培养补充剂（ITS-Premix），以及 10 ng/mL 转化生长因子-β3（TGF-β3），新鲜配制软骨诱导培养基。
2. 使用每 150 cm² 培养瓶 8 mL 的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 消化磁标记细胞，将解离后的细胞在 260 × g 条件下离心 5 分钟。吸除培养基后重悬细胞并计数。
3. 将底部为玻璃的细胞培养皿（35 mm）放置在两个磁性装置上方。
4. 为通过磁力形成细胞聚集体，向培养皿中加入 3 mL 软骨诱导培养基，并轻柔地滴加尽可能小的体积（不超过 8 µL），每滴含 2.5×10⁵ 个标记细胞（最多可形成 16 个聚集体）。静置培养皿 20–30 分钟，避免移动，以促进球形聚集体形成，随后将包含 16 个聚集体的完整装置置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中培养。
5. 按照相同方案制备对照组聚集体，并用不含 TGF-β3 的软骨诱导培养基完全更换培养液。
   1. 为生成三维聚集体结构，于第 8 天将两个聚集体接触放置，形成 8 个双聚体，启动融合过程；第 11 天将两个双聚体合并，形成 4 个四聚体；最终于第 15 天将 4 个四聚体融合，获得最终结构。
   2. 同时，在 15 mL 离心管中加入 1.5 mL 含或不含 TGF-β3 的软骨诱导培养基（分别用于实验组和对照组），将 2.5×10⁵ 个标记干细胞在 260 × g 条件下离心 5 分钟，以形成聚集体。
6. 为通过磁力接种支架，将每个干燥的支架置于培养皿中。使用由普鲁兰多糖/葡聚糖制成的多孔多糖支架²¹。对每个支架，将 2×10⁶ 个标记干细胞悬浮于 350 µL 不含 TGF-β3 的软骨诱导培养基中，小心地将细胞悬液滴加至支架表面。
   1. 在 37 °C 培养 5 分钟，使细胞充分渗入支架内部，随后轻柔地向培养皿中加入 3 mL 含或不含 TGF-β3 的软骨诱导培养基（分别用于实验组和对照组）。
   2. 将接种细胞的支架置于磁性装置上，在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养 4 天，以促进细胞在支架孔隙中的迁移与限域分布。
7. 同时，采用相同方法将 2×10⁶ 个标记干细胞接种至支架，并在无磁条件下培养，以获得均匀接种的支架作为阳性对照。

4. 分化为软骨细胞

注意：孵育4天后，移除磁铁，并在培养皿（静态条件）或生物反应器（动态条件）中继续软骨细胞成熟过程。阴性对照样本在不含TGF-β3的软骨诱导培养基中于静态条件下进行成熟培养。

1. 在静态条件下，将接种细胞的支架或细胞聚集体保留在同一培养皿中。每两周更换两次成软骨诱导培养基，持续 21 天。
2. 在动态条件下，准备生物反应器。
   1. 根据制造商的操作说明，将硅胶管剪裁至适当长度。
   2. 对所有材料进行高压灭菌：500 mL 培养室、管路、双向旋转接头和笼架。
   3. 将生物反应器各部件放入无菌微生物安全操作台中，按照制造商说明将管路连接至双向旋转接头和培养室。
   4. 使用无菌刮铲小心地将接种细胞的支架转移至已灭菌的笼架中，每个笼架放置 2 个支架。待笼架装配完成后，将其插入盖子上的针状固定装置中，以防止后续旋转过程中发生移动。向培养室中加入成软骨诱导培养基，并用带有笼架的盖子密封。
3. 启动蠕动泵，使成软骨诱导培养基充满管路并排除气泡。
4. 将装满培养基的培养室固定于生物反应器的电机上，并开启计算机，以控制机械臂和培养室的旋转。
5. 设置机械臂和培养室的转速均为每分钟 5 转（rpm）。调节蠕动泵的流速至 10 rpm，以实现对接种细胞支架的持续灌注培养。

5. RNA 提取与基因表达分析

注意：在RNA提取之前，需用酶溶液消化支架。

1. 通过加入100 μL酶溶液制备1 mL酶解液 µL 普鲁兰酶（40 U/mL）和 50 µ850 mL 无血清 DMEM 培养基中加入 dextranase（60 mg/mL）L
2. 用无血清DMEM培养基将支架冲洗两次，弃去培养基，然后加入800 µ每支架加入 L 酶解溶液，37 ℃孵育 15–30 分钟 °C，轻柔振荡。
3. 当支架完全溶解后，将含有细胞的溶液转移至1.5 mL离心管中，在300 ×g下离心 × g 离心 10 分钟，小心吸除上清液，用无菌 1× 磷酸盐缓冲液（PBS），在300 × g条件下离心 × 10 分钟内以 g 离心，然后将细胞重悬于 RNA 提取液中。
4. 为了从聚集体中提取RNA，将球状体放入RNA分离溶液中，并使用匀浆器彻底破碎，然后进行RNA提取。
5. 使用总RNA提取试剂盒，按照制造商说明书提取RNA。
6. 使用400 ng总RNA，按照制造商说明书，加入250 ng随机引物和1种逆转录酶，合成互补DNA µL dNTP 混合液（各 10 mM）和 40 U/mL RNase 抑制剂；反应终体积为 20 µL. 反应结束时，加入 80 µ升蒸馏水以获得最终体积100 µL.
7. 用于定量聚合酶链式反应（PCR），使用含有荧光试剂的PCR混合液，以定量目的基因的相对表达水平，如聚集蛋白聚糖（AGC）和胶原蛋白II型（Col II），用量为10× 稀释的 cDNA。使用核糖体蛋白大亚基 P0（RPLP0）作为参考基因对基因表达水平进行归一化。采用 2^-ΔΔCT 公式，其中 ΔΔCT = Δ分化条件下的 CT 值 - 均值 Δ对照条件的 CT 及各组 ΔCT 表示目的基因的 CT 值减去参考基因（RPLP0）的 CT 值。
8. 确定统计测量值为平均值 ± 均值的标准误差（SEM）。分析时需基于不少于 2 次的独立实验。采用 Student t 检验分析离心沉淀物与磁力融合体之间的统计学差异（* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001）。 < 0.05）。使用Kruskal-Wallis检验（单因素非参数方差分析）确定分化支架与对照支架之间统计学差异的显著性（* p < 0.05).

6. 组织学分析

1. 用无菌的 1× PBS 冲洗细胞化支架或聚集体，然后在室温下用 10% 甲醛溶液固定 1 小时，再用 1× PBS 冲洗。
2. 吸除 PBS，将样品包埋于最佳切割温度化合物（OCT）中，并在浸于液氮的异戊烷浴中速冻。将样品在 -20 °C 下保存。使用冷冻切片机切片，聚集体切取 8 µm 厚的冷冻切片，细胞化支架切取 12 µm 厚的冷冻切片。
3. 用 0.5% 甲苯胺蓝溶液染色冷冻切片 2 分钟，流水冲洗，经 100% 乙醇脱水，二甲苯透明，最后用光学显微镜封片剂封片。

结果

首先，可通过微磁体单独形成聚集体，方法是接种 2.5×10⁵ 个标记的干细胞（图 2A）。这些单个聚集体（大小约 0.8 mm）随后可通过连续的磁力诱导融合形成更大的结构。例如，在软骨成熟第 8 天，将聚集体两两接触形成双聚体；第 11 天通过合并两个双聚体组装成四聚体；最终在第 15 天，将 4 个四聚体融合形成一个包含最初 16 个聚集体的三维结构，总细胞数为 4×10⁶ 个（大小约 4 mm）（图 2B）。其次，相同的磁吸引技术已被用于在支架内形成细胞聚集体。将支架接种于磁性装置上，可在支架孔隙内的精确微磁体位置观察到高度浓缩的细胞（图 2C）。相比之下，当在无磁吸引条件下将细胞接种于支架内（被动接种）时，细胞呈均匀分布。随后将细胞化的支架置入笼状结构中（图 3A），并连接至生物反应器腔室，以在动态成熟条件下进行软骨生成过程（图 3B）。该类生物反应器可改...

讨论

首先，由于本文介绍的技术依赖于磁性纳米颗粒的细胞内化，因此一个重要的问题是纳米颗粒在细胞内定位后的去向。确实，铁基纳米颗粒可能因其尺寸、包被材料及暴露时间的不同，引发潜在的毒性或影响细胞的分化能力^19,22然而，多项研究表明，使用包封的铁纳米颗粒时，对细胞生理学没有影响²³ 以磁铁蛋白的形式，一种生物磁性纳米颗粒²⁴，或使用简单的柠檬酸盐包被并具有适当浓度¹⁸此外，当氧化铁纳米颗粒在与本文所述相似的条件下使用时（与间充质干细胞共用并用于软骨生成），我们最近证明，在细胞摄取及间充质干细胞球体形成后约10天内，纳米颗粒在内体中会发生快速且近乎完全的降解。有趣的是，这种大规模的降解与游离铁在铁蛋白中的高效储存密切相关，对细胞铁代谢的影响极为有限，预示着其在临床应用中具有良好的前景。²⁵.

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氧化铁（磁赤铁矿）纳米颗粒（γ-Fe2O3）	PHENIX - 巴黎第六大学	由 C. Ménager 制备并提供	平均直径为 8.1 nm，表面带负电荷
多糖普鲁兰/葡聚糖支架	LIOAD - 南特大学	由 C. Le Visage 制备并提供	由碱性条件下（10 M NaOH）的 75:25 普鲁兰/葡聚糖混合物制备而成。孔隙尺寸：185–205 µm；厚度：7 mm；表面积：1.8 cm2。
TisXell 再生系统	QuinXell Technologies	QX900-002	具有 500 mL 培养腔的双轴生物反应器
支架用笼：Histosette II M492	VWR	720-0909
间充质干细胞（MSC）	Lonza	PT-2501	使用了三个独立批次
MSCGM BulletKit 培养基	Lonza	PT-3001	配制完全培养基时，将提供的 BulletKit（含血清、谷氨酰胺和抗生素）加入 MSCGM 培养基中
含 Glutamax I 的 DMEM 培养基	Life Technologies	31966-021	不含丙酮酸钠，不含 HEPES
RPMI 1640 培养基，不含谷氨酰胺	Life Technologies	31870-025	不含丙酮酸钠，不含 HEPES
不含 CaCl2 和 MgCl2 的 PBS	Life Technologies	14190-094
0.05% 胰蛋白酶-EDTA（1x）	Life Technologies	25300-054
青霉素（10,000 U/mL）/链霉素（10,000 µg/mL）	Life Technologies	15140-122
ITS 通用培养补充剂预混液（20x）	Corning	354352
100 mM 丙酮酸钠溶液	Sigma	S8636
L-抗坏血酸-2-磷酸	Sigma	A8960	使用蒸馏水现配成 25 mM 的浓缩溶液
L-脯氨酸	Sigma	P5607	用蒸馏水配制成 175 mM 的储存液，并于 4 °C 保存
地塞米松	Sigma	D4902	用 100% 乙醇配制成 1 mM 的储存液，并于 -20 °C 保存
TGF-β3 蛋白 10 µg	Interchim	30R-AT028
三水合柠檬酸钠	VWR	33615.268	用蒸馏水配制成 1 M 的储存液，并于 4 °C 保存
来自 Bacillus acidopullulyticus 的普鲁兰酶	Sigma	P2986
来自 Chaetomium erraticum 的葡聚糖酶	Sigma	D0443
NucleoSpin RNA 提取试剂盒	Macherey-Nagel	740955.5
SuperScript II 逆转录酶	Life Technologies	18064-014
随机引物-六聚体	Promega	C1181	500 µg/mL：使用时稀释至 1/2，每样本加入 1 µL
重组 RNAsin 核糖核酸酶抑制剂	Promega	N2511	40 U/µL：每样本加入 1 µL
PCR 核苷酸 dNTP 混合液（每种 10 mM）	Roche	10842321
SyBr Green PCR 主混合液	Life Technologies	4368708
Step One Plus 实时荧光定量 PCR 系统	Life Technologies	4381792
10% 中性缓冲福尔马林溶液	Sigma	HT5012
OCT 包埋剂	VWR	361603E
异戊烷	Sigma	M32631
甲苯胺蓝 O	VWR	1.15930.0025
无水乙醇	VWR	20821.310
甲苯	VWR	1.08323.1000
封片剂 Pertex	Histolab	840
qPCR 用 RPLP0 引物	Eurogentec		5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3'； 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3'
qPCR 用聚集蛋白聚糖引物	Eurogentec		5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3'；3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5'
qPCR 用 II 型胶原引物	Eurogentec		5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3'；3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5'