方法文章

人脐带和胎儿胎盘间充质基质细胞的分离与鉴定

DOI：

10.3791/55224

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2017年4月3日

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1Department of Biological Sciences, Oakland University, 2OU-WB Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine, 3Department of Obstetrics and Gynecology, St. John Provindence - Providence Park Hospital, 4Department of Neurosurgery, Beaumont Health System

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍一种从人脐带（UC）和胎儿胎盘样本中分离出脐带内层（CL）、华通胶（WJ）、脐带-胎盘连接处（CPJ）以及胎儿胎盘（FP）的实验方案，用于通过组织块培养法分离和鉴定间充质基质细胞（MSCs）。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

人脐带（UC）和胎盘是间充质基质细胞（MSCs）的非侵入性、原始且丰富的来源，因其不涉及伦理或道德问题而日益受到关注。目前从脐带中分离MSCs的方法所获得的细胞数量较少，且增殖潜能存在差异。由于脐带是结构复杂的器官，MSCs特性的差异可能与其分离部位的解剖区域不同有关。本研究中，我们首先将脐带/胎盘样本解剖为三个独立的解剖区域：脐带（UC）、脐带-胎盘连接处（CPJ）和胎儿胎盘（FP）。其次，将脐带部分进一步分离为两个不同区域：脐带内层（CL）和华通胶（WJ）。随后采用组织块培养法从这四个来源分离细胞。不同组织来源的原代细胞培养所需时间各不相同。CPJ组织块在3–4天内即出现细胞迁出，而CL/WJ和FP组织块分别在7–10天和11–14天后才观察到细胞生长。所分离的细胞均能贴附于塑料表面，呈成纤维细胞样形态，并表达CD29、CD44、CD73、CD90和CD105等表面标志物，特征与骨髓（BM）来源的MSCs相似。然而，各来源细胞的克隆形成效率存在差异，其中CPJ-MSCs和WJ-MSCs的效率高于BM-MSCs。所有四个来源的MSCs均可分化为脂肪、软骨和成骨谱系，表明其具有多向分化潜能。其中，CPJ-MSCs的分化效率高于其他来源的MSCs。这些结果表明，CPJ是最具活性的解剖区域，能够获得更高数量的细胞，并具有更强的增殖和自我更新能力 关键词：人脐带，胎盘，间充质基质细胞，脐带-胎盘连接处，华通胶，组织块培养，克隆形成效率，多向分化潜能 体外总之，对四种来源的间充质干细胞（MSCs）进行的比较分析表明，CPJ是细胞治疗、再生医学和组织工程更具前景的MSC来源。

引言

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干细胞存在于人体的多种器官和组织中。它们具有再生潜能，在人的一生中对修复受损组织起着重要作用1,2这引起了人们对成体干细胞（ASCs）的极大关注，尤其是因为与胚胎干细胞（ESCs）不同，ASCs 的使用不会引发道德和伦理争议。已有许多研究报道了 ASCs 的分离，例如间充质基质细胞（MSCs）、造血干细胞（HSCs）以及多种前体细胞，其成体来源广泛，包括骨髓（BM）、脂肪组织（AT）和牙髓等。3,4,5然而，大多数成体生态位中存在的ASCs数量有限，其分离通常需要侵入性且疼痛的手术过程，并可能带来供体部位的并发症。此外，供体年龄和环境应激也可能对分离细胞的质量和生物学活性产生重要影响6,7,8. ASCs 在培养过程中也表现出有限的增殖和分化潜能 体外.

为了克服目前成体干细胞（ASCs）的这些缺点，研究人员一直在探索新的干细胞分离来源。这些努力使得人们能够从围产期组织中分离出干细胞，包括脐带血、脐带组织、胎盘和羊水9。这些来源因其易于获取且来源丰富而受到广泛关注10,11,12,13。此外，围产期组织可通过非侵入性方式获得，且从中分离的干细胞比来自成体组织的ASCs更为原始14,15。这些干细胞来源于出生时获得的组织，被认为在基因组上因衰老和环境压力导致的改变极小16。

然而，来自围产期来源的干细胞的报道特征及其自我更新和分化潜能存在广泛差异11,17。这可能部分归因于人脐带（UC）是一种复杂的器官。我们假设，围产期组织的不同区域形成了特定的微环境，导致这些干细胞相较于非围产期来源的ASCs具有更大的异质性和更原始的特性。本研究描述了将脐带/胎盘样本分离为三个独立的解剖区域：脐带（UC）、脐带-胎盘连接区（CPJ）和胎儿胎盘（FP）。其中，脐带进一步分为两个区域：脐带内层（CL）和华通胶（WJ）。对来自CL、WJ、CPJ和FP的分离细胞进行分析表明，它们均呈现成纤维细胞样形态并表达间充质干细胞（MSC）标志物，但在自我更新能力和分化潜能方面存在差异。与UC和FP来源的细胞相比，CPJ来源的细胞表现出更高的增殖速率和更强的自我更新能力，因此在细胞治疗、再生医学和组织工程中具有更广阔的应用前景。

方案

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样本（n = 3）来自知情同意的健康供体，分别通过密歇根州罗亚尔奥克市博蒙特医院生物样本库和密歇根州南菲尔德市普罗维登斯医院在HIC（HIC #2012-101）和IRB（IRB# 820662-3）批准的方案下获取，并按照奥克兰大学（密歇根州罗切斯特市）IBC（#2858）批准的程序进行处理。

1. 人脐带、脐带-胎盘连接处及胎儿胎盘的处理与细胞分离

  1. 无菌条件下采集长约10 cm的脐带（UC）组织样本，其中包含与绒毛膜板连接处（CPJ）相连的5 - 6 cm以及胎盘部分（FP）的3 - 4 cm。每份样本立即放入含有培养基（含4,500 mg/mL葡萄糖的DMEM，以及抗生素溶液（0.1%庆大霉素、0.2%链霉素和0.12%青霉素））的收集杯中，并置于泡沫箱内的冰上运输至实验室，于4 °C保存。样本应在采集后2 - 4小时内于4 °C条件下进行处理。
  2. 将样本置于生物安全柜中预冷的150-mm培养皿内。使用针头和注射器，用预冷的PBS反复冲洗样本以去除血凝块。处理过程中需确保样本始终被PBS润湿，避免干燥。为保持无菌状态，在整个样本处理过程中应使用经高压灭菌的PBS和手术器械进行无菌操作。
  3. 仔细检查样本，识别不同的解剖区域：脐带（UC）、绒毛膜板连接处（CPJ）和胎盘部分（FP）。首先解剖脐带（UC）。用镊子夹住脐带的胎儿端，用剪刀在CPJ顶端处小心地进行第一刀切割。在CPJ下方进行第二刀切割，以分离出1.5 - 2.0 cm长的CPJ与FP。将分离后的UC、CPJ和FP分别放入不同的培养皿中，以备后续处理。
  4. 用剪刀和镊子沿长轴方向纵向剪开脐带，完全暴露血管及其周围的华通胶（WJ），注意不要破坏上皮层。
  5. 使用解剖刀从血管和羊膜下层上刮取华通胶（WJ），随后移除血管。务必收集血管下方及周围残留的血管周围华通胶，并将收集到的WJ放入另一个独立的培养皿中。
  6. 将剩余的组织——即脐带衬里（CL）——放入另一个独立的培养皿中。
  7. 在完成代表CL、WJ、CPJ和FP的组织分离后，弃去PBS，加入3 - 5 mL商品化胰蛋白酶溶液，并用剪刀将各组织分别剪切成1 - 2 mm大小的组织块。
  8. 将组织块置于含5% CO2的培养箱中，于37 °C孵育30分钟，进行部分消化。通过相差显微镜观察细胞释放情况，以评估部分消化的程度。
  9. 向部分消化的样本中加入等体积的培养基（CM；含4,500 mg/mL葡萄糖的DMEM，2 mM L-谷氨酰胺，添加10%人血清/FBS及抗生素溶液（0.1%庆大霉素、0.2%链霉素和0.12%青霉素）），以中和商品化胰蛋白酶溶液。将混合物转移至50-mL离心管中，静置3分钟，使部分消化的组织块沉淀。
  10. 小心吸除上清液（包括单个细胞，因其扩增效率较低），将15 - 20个部分消化的组织块接种于一个75-cm2的组织培养瓶中，并加入9 mL CM。于37 °C孵育，且在最初2 - 3天内不要扰动培养瓶，以促进组织块的贴壁。
    注意：剩余的部分消化组织样本可进行冷冻保存，用于未来细胞的分离。
  11. 孵育3天后更换CM，并每日观察组织块是否有细胞向外生长；细胞生长应分别在CPJ、CL/WJ和FP组织块接种后3 - 4天、7 - 10天和11 - 14天内变得明显。此后，每3天或根据需要更换CM。
    注意：组织块贴壁后，细胞生长通常在初次出现细胞外延生长后的7 - 10天达到70%汇合度。需注意，未贴壁的组织块在未附着于培养瓶表面之前不会产生细胞外延生长。操作时应避免扰动培养瓶，以防已贴壁的组织块脱落。若在培养最初3天后仍有漂浮的组织块，可通过将其转移至新的培养瓶中以促进贴壁。
    注意：当组织块来源的细胞生长达到70%汇合度时，应进行传代。如上所述，来源于CL/WJ、FP和CPJ的间充质干细胞（MSCs）分别在10 - 14天、14 - 20天和17 - 24天达到汇合。
  12. 对从组织块中长出的细胞进行传代时，使用1 - 2 mL商品化胰蛋白酶溶液/75-cm2培养瓶进行消化，在37 °C孵育3分钟。加入1 - 2 mL CM中和，然后以1,500 × g离心3分钟。加入胰蛋白酶时应缓慢旋转培养瓶，确保其均匀分布。
  13. 注意：离心所得的细胞沉淀被视为第0代（P0），应重悬于CM中，计数后以1 × 104/cm2的接种密度进行传代，用于扩增、鉴定和冷冻保存。多余的P0代细胞可进行冷冻保存。

2. 分离细胞的表征

  1. 集落形成效率（CFE）检测
    1. 用 0.1% 明胶对 100 mm 培养皿（表面积为 60 cm2）包被 30 分钟，并将其置于 37 °C 的 CO2 培养箱中。
      注意：尽管并非必需，明胶包被可改善细胞贴附。
    2. 去除多余的明胶，并以 1.63 个细胞/cm2 的浓度将 P0 代细胞接种至包被的培养皿中，加入 3 mL CM 培养基，于 37 °C CO2 培养箱中培养。
    3. 通过光学显微镜（LM）监测接种培养皿中的克隆生长情况，并每 3 天更换一次培养基。
    4. 细胞培养 10–14 天后，用 PBS 洗涤培养皿两次，在室温下用 4% 多聚甲醛固定细胞 30 分钟。
      注意：多聚甲醛具有毒性，请在操作时佩戴手套和护目镜以确保安全。
    5. 在室温下用 0.1% 结晶紫染色固定后的细胞 1 小时，然后用自来水冲洗培养皿，直至未结合的蓝色染料完全去除。
    6. 使用光学显微镜计数由至少 50 个细胞组成的集落数量。
  2. 细胞表面标志物表达检测
    1. 将分离的细胞培养至 70% 汇合度，用商品化胰蛋白酶溶液消化，经 1,500 × g 离心 3 分钟后洗涤并收集细胞沉淀。将细胞重悬于 FACS 缓冲液（含 2% FBS 和 0.1% 叠氮化钠的 1× PBS）中。
      注意：叠氮化钠具有毒性，请在操作时佩戴手套和护目镜以确保安全。
    2. 在 4 °C 避光条件下，用 FITC 或 APC 标记的间充质干细胞特异性抗体（FITC 标记的抗体针对：CD44 和 CD90；APC 标记的抗体针对：CD29、CD73 和 CD105）在 FACS 缓冲液中对细胞（约 106 个）染色 30 分钟。
    3. 将染色后的细胞以 670 × g 离心 5 分钟，吸除上清液，将细胞重悬于 500 µL FACS 缓冲液中。
    4. 根据制造商说明书，使用流式细胞术（FACS）分析抗体染色的细胞。

3. 分化潜能

  1. 成脂分化
    1. 将分离的细胞培养至70%汇合度，用市售胰蛋白酶溶液消化，离心（1,500 × g，3分钟）洗涤并收集细胞沉淀。
    2. 在37 °C、含2 mL完全培养基（CM）的6孔板中，以每孔100,000个细胞的密度接种细胞，并置于CO2培养箱中培养。
    3. 24小时后，弃去完全培养基，更换为成脂分化培养基（含0.5 µM异丁基甲基黄嘌呤、1 µM地塞米松、10 µM胰岛素和200 µM吲哚美辛），继续培养。每3天或根据需要更换一次分化培养基。
    4. 培养3周后，每孔加入2 mL 4%多聚甲醛，室温固定30分钟，随后用油红O染色检测脂滴生成，以评估成脂分化情况。
      注意：多聚甲醛具有毒性。操作时请佩戴手套和护目镜，注意安全。
    5. 用60%异丙醇（每孔2 mL）处理固定后的细胞5分钟。
    6. 弃去异丙醇，加入2 mL油红O染液（将3份油红O染液与2份蒸馏水混合后过滤），室温孵育15–30分钟，然后用自来水冲洗3–4次，去除未结合的染料。
    7. 使用光镜（LM）观察呈红色染色的脂滴，该结果提示细胞具有成脂谱系特征。
  2. 成软骨分化
    1. 将分离的细胞培养至70%汇合度，用市售胰蛋白酶溶液消化，并用PBS洗涤。
    2. 为进行成软骨诱导，将250,000个细胞加入含2 mL完全培养基（CM）的15 mL离心管中，以11,000 × g离心8分钟形成细胞沉淀。将细胞沉淀于37 °C过夜培养。
    3. 24小时后，小心弃去上清液，更换为成软骨分化培养基（含20 ng TGFβ1、10 ng胰岛素、100 nM地塞米松和100 µM抗坏血酸），注意不要扰动细胞沉淀，继续培养。每3天或根据需要更换一次分化培养基。
    4. 培养3周后，每孔加入2 mL 4%多聚甲醛，室温固定30分钟。进行冷冻切片，并用1%甲苯胺蓝染色，检测细胞外基质的生成，以判断是否发生成软骨分化。
      注意：多聚甲醛具有毒性。操作时请佩戴手套和护目镜，注意安全。
    5. 进行冷冻切片前，将收获的细胞沉淀用PBS轻轻洗涤两次，再加入1 mL 4%多聚甲醛，室温固定30分钟。
      注意：多聚甲醛具有毒性。操作时请佩戴手套和护目镜，注意安全。
    6. 用PBS洗涤细胞沉淀两次，去除多聚甲醛，然后转移至蔗糖/OCT溶液（1:2，20%蔗糖:OCT）中。室温孵育24小时，使溶液充分渗透细胞沉淀，以利于后续切片操作。
    7. 将细胞沉淀转移至OCT模具中，在-20 °C冷冻4–6小时，随后使用恒冷切片机对细胞沉淀进行约10–12微米厚的冷冻切片，用于甲苯胺蓝染色。
    8. 用PBS轻轻洗涤冷冻切片，滴加数滴1%甲苯胺蓝染液，完全覆盖载玻片上的组织切片，室温孵育1小时。
    9. 多次用PBS洗涤载玻片以脱去多余染料。将载玻片多次浸入盐酸酒精溶液（95%酒精 + 0.5 mL HCl）中，直至未结合的蓝色染料完全去除。最后加入100 µL封片液封片，以长期保存切片。
      注意：切片呈现蓝色染色表明存在糖胺聚糖和糖蛋白，可通过光镜（LM）观察到。
  3. 成骨分化
    1. 再次将分离的细胞培养至70%汇合度，用市售胰蛋白酶溶液消化，离心（1,500 × g，3分钟）洗涤并收集细胞沉淀。
    2. 在37 °C、含2 mL完全培养基（CM）的CO2培养箱中，将细胞以每孔100,000个细胞的密度传代至6孔板中培养。
    3. 24小时后，弃去完全培养基，更换为成骨分化培养基（含0.1 µM地塞米松、10 µM β-甘油磷酸钠和50 µM抗坏血酸磷酸盐），继续培养。每3天或根据需要更换一次分化培养基。
    4. 培养3周后，每孔加入2 mL 4%多聚甲醛，室温固定30分钟，随后用茜素红染色检测钙沉积，以判断是否发生成骨分化。
      注意：多聚甲醛具有毒性。操作时请佩戴手套和护目镜，注意安全。
    5. 用蒸馏水轻轻洗涤固定后的细胞两次，然后在避光条件下加入2%茜素红染液（每孔2 mL），室温孵育1小时。
    6. 用自来水轻轻冲洗，去除多余染料，注意避免钙沉积物脱落。
    7. 使用光镜（LM）观察呈红色染色的钙沉积物。

4. 定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）分析

  1. 将分离的细胞培养至70%融合度，用商用胰蛋白酶溶液消化，洗涤后在1,500 × g离心3分钟以收集细胞沉淀，用于总细胞RNA的提取。
  2. 用PBS洗涤细胞以去除残留的胎牛血清（FBS），随后按照试剂盒说明书使用商用RNA纯化试剂盒进行RNA提取。
  3. 使用热循环仪在37 °C下用DNase处理30分钟，对提取的总RNA进行纯化。按照说明书使用商用试剂盒合成cDNA。
  4. 在96孔板中制备三份重复的10 µL PCR反应体系，每份反应包含5 µL SYBR Green PCR预混液、3 µL双蒸水、正向和反向引物各0.5 µL，以及1 µL稀释（1:10）后的cDNA。
  5. 按以下参数进行PCR扩增：98 °C预变性10分钟，随后进行44个循环，每个循环包括98 °C变性30秒、60 °C退火20秒、72 °C延伸30秒。
  6. 将目的基因的扩增结果相对于内参基因GAPDH和β-ACTIN进行归一化处理；引物序列见表1。

5. 统计分析

  1. 使用统计软件进行所有分析。数据以均值 ± 标准误表示。结果中 p 值（**p ≤ 0.01 和 *p ≤ 0.05）被认为具有统计学显著性。

结果

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人脐带、脐带-胎盘连接处及胎儿胎盘细胞的分离与提取

围产期组织由三个独立的解剖区域组成。第一个是脐带（UC），包含两条动脉和一条静脉，以及两个不同的区域：脐带外层（CL，脐带的外层覆盖物）和华通氏胶（WJ，脐带内部血管周围的胶状物质）。第二个是脐带-胎盘连接部（CPJ，脐带与胎盘之间的连接部位），第三个是胎盘附着部（FP），位于CPJ之后（脐带插入胎盘，而胎盘附着于母体子宫壁上）。从围产期组织中分离细胞的流程示意图见图1。四个来源——CL、WJ、CPJ和FP——均可清晰识别，并被分别分离以从组织块中获取细胞，如图2所示。组织块培养后细胞的外生长情况常规通过光镜（LM）进行观察和记录。在培养CPJ组织块3–4天后，可观察到贴壁的成纤维细胞样细胞。培养WJ、CL和FP组织块后，分别在7–8天、9–10天和11–14天出现形态相似的细胞。来自不同来源（CL、WJ、CPJ和FP）组织块的细胞外生长情况如图3A所示。这些细胞被视为P0代。当P0代细胞进行传代培养时，它们表现出克隆性生长，形态呈成纤维细胞样，与骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）相似。然而，它们的群体倍增时间存在差异，CPJ和FP来源的细胞倍增时间范围为32 h至94 h，如图3B和C所示。WJ和CL来源的细胞倍增时间介于CPJ和FP之间。对P0代细胞的进一步分析表明，其集落形成效率（CFE）也存在差异，范围为16至92个集落。CPJ来源的细胞CFE最高（92），FP来源的细胞CFE最低（16）。CL和WJ来源的细胞CFE分别为59和80个集落（图4A–C）。CL来源的细胞CFE值与BM-MSCs相近。这些结果表明，CPJ来源的细胞具有更强的增殖能力和自我更新能力。

分离细胞的免疫表型分析

对从CL、WJ、CPJ和FP分离的细胞检测了细胞特异性标志物的表达情况。P3-5代细胞对间充质干细胞（MSCs）标志物CD29、CD44、CD73、CD90和CD105呈阳性表达（图5A 和 B）。这些细胞还已知表达主要组织相容性复合体I类标志物HLA-ABC，而不表达II类标志物HLA-DR3。上述四种来源细胞中这些选定标志物阳性细胞的百分比与标准骨髓来源MSCs（BM-MSCs）的表达水平相似。然而，MFI比值显示，WJ和CPJ来源的细胞彼此接近，且高于CL和FP来源的细胞（图5C）。有趣的是，尽管不同来源细胞的CFE值存在差异，但它们表达的MSC标志物水平相似。根据细胞表面标志物的检测结果，从四种来源分离的细胞均被认定为MSCs。对这些细胞的进一步分析显示，它们还表达多能性基因OCT4、NANOG、KLF4和SOX2（图5D）。其中，CPJ-MSCs的多能性标志物表达水平最高，随后依次为WJ-MSCs、CL-MSCs和FP-MSCs。

分离获得的间充质干细胞的分化潜能

表征间充质干细胞（MSCs）的金标准是其向多个谱系分化的能力。我们的结果表明，从所有围产期来源分离的MSCs均能有效分化为成脂细胞、成软骨细胞和成骨细胞。成脂细胞分化产物形成脂滴，经油红O染色呈阳性，如图6A所示。间充质干细胞成软骨分化产物经甲苯胺蓝染色，显示存在蛋白聚糖和糖蛋白，有助于细胞外基质的形成（图6B）。间充质干细胞成骨分化产物经茜素红染色呈阳性，表明存在参与骨矿化的钙盐沉积，如图6C所示。

正如预期，从所有来源分离的MSCs转录组分析均显示出三系分化能力（图6D-F）。然而，MSCs的分化潜能因来源不同而存在差异。与CPJ-MSCs相比，WJ-MSCs的脂肪分化衍生物中所选脂肪生成基因（CEBPβ、FABP4和PPARγ）的表达水平高出2倍。CL-MSCs和FP-MSCs在这些基因上的表达最低。在软骨分化方面，CPJ-MSCs衍生物中所选软骨生成基因（SOX9和COL2）的表达水平比WJ-MSCs和FP-MSCs衍生物高出50倍。与CL-MSCs脂肪分化能力较差类似，其软骨分化潜能也较低，表现为软骨生成基因表达水平最低。CPJ-MSCs还表现出最高的成骨分化潜能，其选定的成骨基因（COL1、OPN和OCN）转录水平高出2倍。然而，成骨衍生物中前体标志物RUNX2的表达在WJ-MSCs中最高，表明这些细胞对分化条件的响应较慢。同样，CL-MSCs在成骨分化方面表现较差。这些结果表明，CPJ-MSCs和WJ-MSCs的分化潜能高于CL-MSCs和FP-MSCs。其中，CL-MSCs向三系分化的能力最低。

脐带细胞分离过程：解剖、消化、培养步骤及应用示意图。
图1：人脐带、脐带-胎盘连接部及胎儿胎盘细胞分离示意图。检查所采集的样本后，开始进行解剖。步骤1。 手工解剖并分离脐带/胎盘样本为三个独立区域：脐带（UC）、脐带-胎盘连接部（CPJ）和胎儿胎盘（FP）。使用剪刀和镊子将脐带的两个不同区域进一步分离为脐带外层（CL）和华通胶（WJ）。步骤2。使用剪刀将各解剖组织分别切成1至2 mm大小的组织块，并进行部分消化。步骤3。 培养组织块。步骤4。 通过胰酶处理从组织块中分离细胞，继代培养并鉴定所分离的细胞。步骤5。 经分离和鉴定的细胞可扩增并用于多种应用。请点击此处查看该图的放大版本。

脐带和胎盘组织提取示意图；用于干细胞研究的细胞培养分析。
图2：人脐带、脐带-胎盘连接部及胎儿胎盘组织外植块的分离与培养。图中显示了脐带/胎盘样本的三个不同解剖区域：UC（分为CL和WJ）、CPJ以及FP，以及相关的动脉和静脉。通过手工解剖将CL、WJ、CPJ和FP分离，以从外植块中获取细胞。每个解剖得到的组织区域被分别切成小片段，并在75 cm2培养瓶中用9 mL CM进行培养。请点击此处查看该图的放大版本。

显微镜下的细胞形态；群体倍增时间图表；干细胞生长比较。
图3：来自人脐带、脐带-胎盘连接处及胎儿胎盘的分离细胞的形态学特征。（A）通过光镜观察到的CL、WJ、CPJ和FP组织块的细胞迁出情况。（B）从CL、WJ、CPJ和FP组织块中分离的细胞在传代培养后呈现成纤维细胞样形态。比例尺为100 µm（放大倍数：4X）。（C）从CL、WJ、CPJ和FP分离的细胞的群体倍增时间。以骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）作为对照标准。误差线表示三次重复测量的均值标准误（**p ≤ 0.01 和 *p ≤ 0.05）。请点击此处查看该图的放大版本。

细胞增殖分析；显微镜观察，集落形成实验，结果图；比较研究。
图 4：来自人脐带、脐带-胎盘连接处及胎儿胎盘细胞的集落形成效率。（A）以1.63个细胞/cm2的克隆密度接种后，从CL、WJ、CPJ和FP分离的细胞（P0代）的生长情况通过LM观察。（B）经结晶紫染色后显示细胞集落形成能力的显微照片。（C）单个经结晶紫染色的细胞集落。比例尺为100 µm（放大倍数：4X）。（D）源自CL、WJ、CPJ和FP细胞所形成集落数量的图示。BM-MSCs作为对照标准。误差线表示三次重复测量的均值标准误（**p ≤ 0.01 和 *p ≤ 0.05）。请点击此处查看该图的放大版本。

流式细胞术直方图和条形图显示CD标志物；干细胞多能性分析。
图5：来源于人脐带、脐带-胎盘连接处及胎儿胎盘的细胞所表达的间充质干细胞标志物分析。（A）通过流式细胞术检测CL、WJ、CPJ和FP来源细胞对间充质表面标志物（CD29、CD44、CD73、CD90和CD105）的表达情况。（B和C）选定间充质表面标志物阳性细胞百分比及中位荧光强度（MFI）比值的图示。MFI比值通过将标志物的MFI值（由软件根据设门细胞群的荧光强度生成）除以同型对照的MFI值得到。误差线表示三次重复测量的均值标准误。（D）通过qRT-PCR检测CL、WJ、CPJ和FP来源细胞对多能性基因（OCT4、NANOG、KLF4和SOX2）的表达。（**p ≤ 0.01 且 *p ≤ 0.05）。基因表达以GAPDH和β-ACTIN为内参进行标准化，误差线表示三次重复测量的均值标准误。请点击此处查看该图的放大版本。

成脂、成软骨、成骨分化结果；显微镜观察、染色及表达图谱。
图6：源自人脐带、脐带-胎盘连接处及胎儿胎盘的间充质干细胞（MSCs）多向分化能力。（A）细胞在成脂分化培养基中培养3周后，经油红O染色，显示脂滴的存在。（B）细胞团块在成软骨分化培养基中培养3周。团块培养物的组织学冷冻切片经甲苯胺蓝染色，显示糖胺聚糖的存在。（C）细胞在成骨分化培养基中培养3周后，经茜素红染色，显示钙盐沉积，提示骨组织矿化。所有图像均通过光镜（LM）获得。比例尺代表100 µm（放大倍数：4X）。以骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）作为对照标准。（D–F）通过qRT-PCR分析检测选定基因的表达水平（CEBPβ、FABP4 和 PPARγ；SOX9、ACAN 和 COL2；以及 COL1、RUNX2、OPN 和 OCN，分别代表MSCs向成脂、成软骨和成骨谱系的分化）（**p ≤ 0.01，*p ≤ 0.05）。基因表达水平以GAPDH和β-ACTIN为内参进行标准化，误差线表示三次重复测量的均值标准误。请点击此处查看该图的高清版本。

基因引物序列产物长度
OCT4正向引物-CCCCTGGTGCCGTGAA97
反向引物-GCAAATTGCTCGAGTTCTTTCTG
NANOG正向引物- AAAGAATCTTCACCTATGCC110
反向引物- GAAGGAAGAGGAGAGACAGT
KLF4正向引物- CGAACCCACACAGGTGAGAA94
反向引物- TACGGTAGTGCCTGGTCAGTTC
SOX2正向引物- TTGCTGCCTCTTTAAGACTAGGA75
反向引物- CTGGGGCTCAAACTTCTCTC
SOX9正向引物- AGCGAACGCACATCAAGAC85
反向引物- CTGTAGGCGATCTGTTGGGG
COL2正向引物- CTCGTGGCAGAGATGGAGAA252
反向引物- CACCAGGTTCACCAGGATTG
ACAN正向引物- AGCCTGCGCTCCAATGACT 103
反向引物- GGAACACGATGCCTTTCACC
COL1正向引物- AAGGTCATGCTGGTCTTGCT114
反向引物- GACCCTGTTCACCTTTTCCA
RUNX2正向引物- TGCTTCATTCGCCTCACAAA111
反向引物- AGTGACCTGCGGAGATTAAC
OPN正向引物- CATACAAGGCCATCCCCGTT112
反向引物- TGGGTTTCAGCACTCTGGTC
OCN正向引物- TAAACAGTGCTGGAGGCTGG 191
反向引物- CTTGGACACAAAGGCTGCAC
CEBPβ正向引物- TATAGGCTGGGCTTCCCCTT94
反向引物- AGCTTTCTGGTGTGACTCGG
FABP4正向引物- TTAGATGGGGGTGTCCTGGT158
反向引物- GGTCAACGTCCCTTGGCTTA
PPARγ正向引物- GGCTTCATGACAAGGGAGTTTC 74
反向引物- ACTCAAACTTGGGCTCCATAAAG
GAPDH正向引物- ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG101
反向引物- GCCATCACGCCACAGTTTC
ACTIN正向引物- AATCTGGCACCACACCTTCTAC170
反向引物- ATAGCACAGCCTGGATAGCAAC

表1：本研究中使用的人源引物序列列表。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

干细胞研究的最新进展不仅加深了人们对基本发育过程的理解，也为干细胞在生物技术、制药、细胞治疗、再生医学和组织工程等领域的应用提供了广阔的前景18,19,20。尽管从早期胚胎中分离出的多能胚胎干细胞（ESC）最具潜力，但其面临技术挑战和伦理困境21,22,23。由成体细胞衍生的诱导多能干细胞（iPSC）提供了一种替代方案，但同样存在类似的技术和安全性问题23。此外，iPSC可能缺乏遗传稳定性，或已发生遗传改变，从而限制了其治疗用途。已有研究报道，在多种出生后组织和器官中也存在干细胞。这些成体干细胞（ASC）最常见的来源包括骨髓、脂肪和肌肉组织。然而，来自出生后组织的ASC增殖能力和分化潜能有限24,25。它们还因衰老及环境应激因素的影响而功能受损，因此在治疗应用中并不总是有效26,27,28。这促使我们及其他研究人员致力于寻找比ASC更为原始的新型干细胞来源。

我们研究了围产期来源的原始干细胞，作为成体干细胞（ASCs）的替代来源。在本报告中，我们提供了一种可靠、稳定且简便的方法，用于从脐带/胎盘样本中分离人源间充质干细胞（MSCs）。与其他用于分离ASCs的来源和方法相比，该方法能够高效、无创地获得大量高质量的MSCs。此外，该方法进一步凸显了围产期来源MSCs相较于骨髓等成体来源MSCs具有更高的增殖能力和分化潜能。

连接胎儿与胎盘的脐带是一个具有明显解剖区域的大型器官，包括两条动脉、一条静脉、华通胶（CL）以及血管周围组织（WJ，即血管周围的结缔组织）。已有多个研究报道了从整条脐带、WJ 或胎盘中分离间充质干细胞（MSCs）的方法，但这些细胞的增殖与分化潜能存在差异25,29。然而，迄今为止，尚无研究系统地探究并比较脐带/胎盘样本中不同解剖区域来源的细胞。本文提供了一种系统且简便的方法，用于分离脐带（UC）、脐带胎盘连接处（CPJ）以及相连的胎盘组织（FP），以获取间充质干细胞。同时，我们还展示了一套全面且简便的方案，通过评估细胞的增殖能力，以及自我更新和分化潜能，对所分离的细胞进行表征和质量评价。该方法可重复性强，能够获得大量高质量的间充质干细胞。

我们发现，使用商用胰蛋白酶溶液对大小为1-2 mm的组织块进行部分消化，可稳定地从组织块中获得细胞，而将组织完全消化为单个细胞时，分离细胞的得率较低。然而，有研究报道，大小约为10 mm的较大脐带组织块更有利于细胞的分离30。相反，另一项研究认为，与酶消化法相比，组织块法会导致更长的培养周期和更低的细胞得率31。在以往的报道中，已采用胶原酶II和透明质酸酶单独处理或在胰蛋白酶处理后进一步处理脐带组织，以分离脐带细胞32,33,34。不仅在培养前对脐带组织的消化方法存在较大差异，而且所获得的分离细胞也表现出异质性。长时间使用剧烈的酶可能降解细胞膜，影响细胞的贴壁和增殖能力。本方法的结果表明，对围产期组织块进行部分消化后，可在不造成严重细胞损伤的情况下实现细胞的迁出，保持细胞活性，并获得更高数量的均一间充质干细胞（MSCs）群体。

尽管从外植体中解剖和分离细胞的实验方案较为简单，但某些步骤可能具有挑战性。首先，应确保外植体的贴壁，即允许其附着于培养瓶表面。可通过使用少量培养基实现，最初仅覆盖组织块，培养前2小时不加满，之后再小心加入剩余培养基。其次，每个T75培养瓶中的外植体数量应限制在15个以内。组织块之间空间过小或每瓶中组织块过多均会抑制细胞的迁移生长。第三，若组织块在培养3天后仍未贴附于培养瓶表面，则应将其转移至新的培养瓶中以促进贴壁和继续培养。第四，用于培养的组织块应去除细胞碎片，因为碎片会阻碍贴壁。第五，培养较大的组织块需要更多培养基，但并不能提高细胞迁移效率。最后，应密切监测外植体培养情况，尤其是在出现细胞迁移后，因为细胞可能迅速达到融合状态并发生分化，具体程度取决于组织来源。该技术存在一些局限性，包括缺乏分离绒毛膜层（CL）、华通胶（WJ）、绒毛膜板连接处（CPJ）和胎膜（FP）的解剖经验；样本量较小导致华通胶产量偏低；以及处理延迟——样本需在采集后2至4小时内完成处理，以避免细胞回收率下降。

间充质干细胞（MSCs）表征的金标准是其具有贴附于塑料表面、形成成纤维细胞样表型以及向多个谱系分化的能力。这些也是国际细胞治疗学会（ISCT）所描述的定义MSCs的常用标准。35在本研究中，从四种来源分离的细胞均能贴壁生长，表达间充质干细胞标志物（CD29、CD44、CD73、CD90 和 CD105），而不表达造血细胞标志物 CD45。此外，这些细胞表达人类白细胞抗原（HLA）I 类分子，但不表达 HLA II 类分子。与骨髓来源的间充质干细胞（BM-MSCs）相比，华通氏胶（WJ）和脐带胎盘连接处（CPJ）来源的细胞表达水平更高。这些结果与既往关于脐带来源间充质干细胞的研究报道一致。33,36,37,38此外，我们的结果表明，CL-MSCs、WJ-MSCs、CPJ-MSCs 和 FP-MSCs 表达多能性基因，如 OCT4、NANOG 和 SOX2；然而，这些基因的表达水平低于胚胎干细胞（ESCs），与先前报道一致。39这些结果也与之前一项研究报告的围产期来源细胞中多能性标志物的表达相一致40有趣的是，观察到CPJ-MSCs中多能性标志物的表达高于从其他来源分离的细胞。同时还注意到，UC-MSCs的自我更新潜能强于BM-MSCs。41有趣的是，尽管表型特征相似，从四个不同来源分离的细胞其集落形成效率（CFE）值存在差异。除FP-MSC外，其余细胞的CFE值均优于BM-MSC。与所有其他MSC相比，CPJ-MSC的CFE值和增殖速率最高。此外，WJ-MSC和CPJ-MSC的三系分化潜能均高于BM-MSC。而CL-MSC在三个谱系中的分化潜能均最低即， 成脂、成软骨和成骨分化潜能），其中CPJ-MSCs的三系分化潜能最高，而FP-MSCs的成脂分化潜能最低。

综上所述，我们的结果表明，在脐带/胎盘样本的四个来源之间，分离得到的间充质干细胞（MSCs）在质量和数量上均存在差异。其中，脐带华通氏胶来源的间充质干细胞（CPJ-MSCs）具有更强的增殖能力以及更高的自我更新潜能，并且在向三系细胞分化方面也表现出较强的能力。由于其倍增时间较短，CPJ-MSCs可实现快速扩增，扩增倍数可达1,000倍，适用于高通量药物或生物材料筛选。这些细胞在细胞治疗和再生医学应用中可能具有更广阔的前景。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究由OU-WB ISCRM、奥克兰大学和密歇根头颈脊柱研究所资助。N. Beeravolu和C. McKee获得了奥克兰大学校长研究生研究奖。我们感谢S. Bakshi对稿件的审阅。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
含4,500 mg/mL葡萄糖的DMEMInvitrogen11995065
FBSAleken BiologicalsFBSS500
异丁基-甲基黄嘌呤SigmaI5879-250mg
地塞米松SigmaD4902-100mg
胰岛素ProspecCYT-270
吲哚美辛SigmaI7378-5G
TGFβ1ProspecCYT-716
抗坏血酸SigmaA-7631
抗坏血酸-2-磷酸SigmaA-8960
β-甘油磷酸SigmaG-6251
TrypLEInvitrogen50591419
GeneJET RNA纯化试剂盒Thermo ScientificK0732
DNasePromegaM6101
iScript试剂盒Biorad1708891
Sso-Advanced Universal SYBR Green Supermix试剂盒Biorad1725274
4%多聚甲醛Affymetrix19943
OCTThermo ScientificSH75-125D
油红O American MasterTech ScientificSTORO100
甲苯胺蓝Thermo ScientificS71363
结晶紫SigmaC3886
茜素红染液Thermo ScientificS25131
APC小鼠抗人CD29BD Biosciences 559883
APC小鼠抗人CD34BD Biosciences 555824
FITC小鼠抗人CD44BD Biosciences 555478
FITC小鼠抗人CD45BD Biosciences 555482
APC小鼠抗人CD73BD Biosciences 560847
FITC小鼠抗人CD90BD Biosciences 561969
APC小鼠抗人CD105BD Biosciences 562408
离心机IEC93522M-2
CO2培养箱Thermo ScientificHera Cell 150i
光学显微镜（LM）Nikon Instruments Inc.Olympus
血细胞计数板Thermo Scientific0267151B
冷冻切片机LeicaCM3050 S
FACS Canto II及Diva软件BD Biosciences Canto II 
PCR仪MJ Research Inc.PTC-100
实时荧光定量PCR系统 Bio-RadCFX96

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