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啮齿类动物脊髓的液压挤出及背根神经节的分离

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DOI：

10.3791/55226

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2017年1月22日

 ,  ,  , 
1Department of Biomedicine, Aarhus University

本文内容

摘要

本文介绍了一种在同一啮齿类动物中进行脊髓液压挤出以及特异性背根神经节（DRGs）识别与分离的实验方案。与传统的脊髓分离方法相比，该方法显著缩短了操作时间，并降低了组织损伤的风险。

摘要

传统上，脊髓通过椎板切除术进行分离。 即 通过逐个打开脊椎骨的方式获取脊髓，这一过程既耗时，又可能在解剖过程中对脊髓组织造成损伤。本文介绍一种利用液压压力挤出脊髓的方法，操作时间显著缩短至数分钟，有助于减少蛋白质损伤。该方法对脊髓组织的损伤风险较低，可提高后续免疫组织化学分析的质量。采用液压法挤出脊髓替代传统的椎板切除术，还可进一步利用同一实验动物进行背根神经节（DRG）的分离，从而减少动物使用数量，并实现同一动物多种组织的联合分析。我们展示了一种根据DRG相对于肋骨的解剖位置进行识别与分离的稳定方法。然而，需注意根据不同实验动物调整该方法，因为不同动物种类或品系的脊髓节段数量（包括胸段和腰段）可能存在差异。此外，我们还展示了分离组织的进一步处理示例。

引言

该方法的总体目标是分离脊髓，并识别和分离背根神经节（DRGs）1,2液压挤出脊髓的方法显著快于通过椎板切除术进行脊髓分离的传统方法， 即 通过逐节折断脊椎骨的方式，该方法可降低解剖过程中对组织造成的损伤风险3,4背根神经节可能难以识别，准确识别对于组织学分析至关重要。 例如 坐骨神经损伤后。通过根据背根神经节（DRGs）相对于肋骨的位置进行编号，可实现对DRGs的准确定位与识别。

通过本视频所示技术分离的组织可用于多种分析，包括蛋白质印迹5,6、定量PCR7以及免疫组织化学染色8。

在鉴定背根神经节（DRG）时，需要注意的是，脊髓节段的数量已知会因动物种类和品系的不同而有所差异9,10,11。在小鼠中进行该方法的优势在于可获得大量遗传修饰的品系，且饲养成本相对较低。而使用大鼠的优势在于组织产量相对较高，且若涉及神经损伤实验，其较大的体型将使操作更为便利。

方案

所有动物实验均严格遵守丹麦及欧洲法规。许可编号：2012-15-2934。

1. 脊髓液压挤出用注射器的准备

  1. 对于成年大鼠，使用 10 mL 注射器；对于成年小鼠，使用 5 mL 注射器；对于幼鼠，使用 2.5 mL 注射器。
  2. 通过修剪通用型非滤芯移液器吸头（适用于 2–200 µL 移液器）的大端，将其调整至能牢固地安装在注射器上。将调整后的移液器吸头安装到注射器上。对于幼鼠，应使用 23 G 或类似规格的针头代替调整后的移液器吸头。
  3. 吸取冰上预冷的无菌 PBS，并将注射器置于冰上备用。

2. 安乐死

  1. 不要进行颈椎脱位，因为这会扰乱脊椎，导致无法进行脊髓挤出。
  2. 对于成年大鼠/小鼠，使用如 CO2 或异氟烷等气体实施安乐死。这些物质有害，应在通风橱内操作，并按照机构指南处理。（注意：CO2：H280，P410，P403；异氟烷：H361d，P260，P281，P280）
    1. 为确认啮齿动物已死亡，可用镊子夹捏其足掌以检查反射是否消失。使用大剪刀将其头部剪下。对于幼鼠，采用断头法实施安乐死。

3. 脊柱的分离

  1. 在毛皮上洒水以控制毛发。
  2. 使用剪刀沿脊柱向远端方向剪开毛皮，并沿脊柱两侧剪开至超过骨盆骨处，分离脊柱。用剪刀在骨盆骨远端处剪断脊髓。
    注意：在整个方案中，头尾轴均称为近端-远端轴。
    1. 使用剪刀修剪脊柱，避免最前端和最远端区域，因为这些区域可能导致脊柱呈明显的S形，从而影响脊髓的顺利挤出。确保脊髓在两端均可见。如果脊髓不可见，需用剪刀继续修剪脊柱，直至脊髓暴露可见。

4. 脊髓的液压挤出

  1. 将盛有无菌 PBS 的培养皿（直径 100 mm）置于冰上。
  2. 用食指按压脊柱弯曲部位（最靠近近端的一端），尽可能将脊柱拉直。
    1. 对于幼鼠，避免弯曲脊柱，否则会导致椎骨损伤，使脊髓无法完整挤出。
  3. 将移液器吸头（幼鼠使用 23 G 针头，成年小鼠可选用 18 G 针头）插入脊柱最远端。若插入正确，吸头将在脊髓腔内保持稳定。
  4. 确保脊柱尽可能拉直，施加稳定压力，将脊髓挤入置于冰上的培养皿中。在进一步处理前，应将脊髓保持在 PBS 中，确保其在冰上始终湿润。

脊髓腰膨大比较图：成年大鼠、成年小鼠、幼年小鼠。
图1：代表性脊髓标本。 液压挤出的脊髓标本。从左至右：成年大鼠、成年小鼠、幼年小鼠。腰膨大部分由方框标出。请点击此处查看该图的放大版本。

5. 背根神经节（DRGs）的鉴定

  1. 使用剪刀将脊柱纵向均分为两部分，并将分开的脊柱置于显微镜下。
  2. 通过定位脊柱上最远端肋骨的附着位置来确定第13胸椎（T13）节段，注意不要将肋骨与附近的肋间神经混淆。最远端的肋骨附着于T13椎骨节段的近端部分，而T13背根神经节（DRG）位于T13椎骨远端、L1椎骨近端的位置。
  3. 沿远端方向识别相邻的背根神经节（DRG）。在成年大鼠中，相邻的DRG呈白色，背根和腹根清晰可见；在成年小鼠中，相邻的DRG也呈白色，背根和腹根同样清晰可见；在幼鼠中，相邻的DRG则呈现为透明的球状结构。

小鼠幼崽和成年大鼠背根神经节解剖；标注图示；神经科学、发育比较。
图 2：脊髓挤出后在脊柱中识别背根神经节。 脊柱已被切开，以便观察由箭头所示的背根神经节。图中以成年大鼠和小鼠幼崽为例。 请点击此处查看该图的放大版本。

6. 背根神经节的分离

  1. 根据待分离的特定DRG数量准备相应数量的培养皿（直径30 mm）， 例如 L3、L4、L5。用预冷的无菌PBS填充培养皿，并置于冰上。
  2. 使用显微剪刀，尽可能靠近背根神经节（DRGs）切断背根和腹根，以释放神经根，同时避免损伤背根神经节（DRGs）。
  3. 用闭合镊子的尖端轻轻挖出背根神经节，并将其转移至相应编号的培养皿中。

成年大鼠、成年小鼠、幼鼠的分离背根神经节；神经生物学实验比较。
图3：典型的分离背根神经节。 从左到右：成年大鼠、成年小鼠、幼鼠。 请点击此处查看该图的放大版本。

7. 组织样本的后续分析处理

  1. 蛋白质印迹法
    1. 分离目标组织区域， 例如 脊髓腰膨大。如有需要，将脊髓分为同侧和对侧，再进一步分为背角和腹角。
    2. 将组织置于裂解缓冲液中，例如 TNE 裂解缓冲液（10 mM Tris-base, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40，溶于双蒸水）2O），并加入适量的酶抑制剂，置于冰上。
    3. 在冰上使用机械研磨杵匀浆组织，持续约 30 s。
    4. 16,000 × g 条件下离心 15 分钟 4 °C 并根据标准方案使用上清液进行后续处理5,6 或在 -20 °C 直至进一步使用。
  2. RNA分析
    1. 分离目标组织。
    2. 立即将组织放入RNA稳定液中，以稳定RNA用于储存。
    3. 根据标准方案提取RNA7.
    4. 将RNA反转录为cDNA，并按照标准实验流程进行qPCR7.
  3. 免疫组织化学
    1. 适用于新鲜冷冻组织（可用于脊髓）：
      1. 将干冰块粉碎成相当于两汤匙粉末的量以制备干冰粉末。用布包裹干冰块，并使用锤子将其粉碎。将铝箔（约5 cm × 5 cm）放置在一层干冰块上，再用干冰粉末覆盖铝箔。
      2. 使用镊子将选定用于进一步分析的脊髓区域置于干冰粉上，使其快速冷冻，然后将脊髓转移至冻存管中。全程保持在干冰上，或储存于 -80 °C 直至进一步使用。
      3. 将脊髓转移至冷冻切片机（-20 °C如有需要，可在冷冻切片机内修剪脊髓。将脊髓置于冷冻切片机内的包埋介质中，以将其固定于标本盘上。
      4. 按所需厚度切取脊髓组织， 例如 5 µm，并收集到玻璃板上。在采集组织前，立即用手指加热玻璃板，以促进组织更好地附着。将剩余的组织保存在冻存管中，置于 -80 °C 直至进一步使用。
      5. 将玻璃板上的切片置于冷冻切片机内，直至准备进行后固定。
      6. 将切片浸入4% PFA中，室温下后固定10分钟。
      7. 根据标准方案进行染色8.
    2. 用于冷冻切片的固定组织（适用于脊髓和背根神经节）
      1. 用4%多聚甲醛固定脊髓和背根神经节（脊髓固定2小时，小鼠背根神经节固定1.5小时，大鼠背根神经节固定4小时）于 4 °C （将脊髓置于水平位置，以防止其固定成弯曲状态）。
      2. 将组织转移至25% w/v蔗糖溶液中，4℃过夜 4 °C组织可在添加少量10%叠氮化钠以防止微生物污染的25% w/v蔗糖溶液中保存于 4 °C 直至进一步使用。如有需要，在硅胶板或类似材质上修剪脊髓，仅保留腰膨大部分。
      3. 用纸巾的尖端吸去组织上多余的蔗糖溶液。
      4. 将包埋剂填充至冷冻模具的一半高度。使用闭合的镊子等工具将气泡推至冷冻模具的边缘。
      5. 使用镊子将组织置于包埋材料上，并确保组织方向符合预期要求。
      6. 用包埋介质完全填满冷冻模具，并将气泡尽可能推离组织远一些（例如 使用闭合的镊子。
      7. 将2-甲基丁烷加入培养皿（直径100 mm）。该物质有害，操作时须在通风橱中进行，并根据机构规定处理（注意：H224，H304，H336，H411，P210，P280，P273，P301，P331，P304/P340，P309/P310）。
      8. 将培养皿置于干冰层上，并向培养皿中加入两块干冰。将冷冻模具放入培养皿中，使包埋介质完全冻结。
      9. 始终将包埋的组织置于干冰上或 -80 °C 用Parafilm封好，直至进一步处理。
      10. 在冷冻切片机中切取组织（-20 °C) 至所需厚度， 例如 5 µm.
      11. 根据标准方案进行染色8.
    3. 用于石蜡包埋的固定组织（适用于脊髓和背根神经节）
      1. 用4%多聚甲醛固定脊髓和背根神经节（脊髓固定2小时，小鼠背根神经节固定1.5小时，大鼠背根神经节固定4小时） 4 °C （将脊髓置于水平位置，以防止其固定成弯曲状态）。
      2. 将组织转移至25% w/v蔗糖溶液中，4℃过夜 4 °C组织可在含少量10%叠氮化钠以防止微生物污染的25% w/v蔗糖溶液中保存于 4 °C 直至进一步使用。
      3. 分离目标组织区域， 例如 脊髓腰膨大
      4. 将包埋盒填充至一半高度的石蜡。
      5. 将包埋模具短暂放置于包埋机的冷却区域进行降温，使石蜡略微硬化，以便更好地调整组织位置。
      6. 将组织按所需方向放入包埋模具中，用石蜡填充模具并立即冷却。
      7. 将含有石蜡的包埋模具置于 4 °C 过夜以使其完全硬化，然后从包埋模具中取出含有组织的石蜡块。
      8. 在切片机上按所需厚度切片， 例如 5 µm.
      9. 根据标准方案进行染色8.

结果

水压挤出的脊髓显示出光滑且无损伤的表面，如图1所示。腰膨大可轻易识别为脊髓增厚的区域，在图1中以方框标出。根据形态学特征，可肉眼辨别脊髓的背侧和腹侧。在图1中，朝向观察者的为腹侧，其特征是沿整个脊髓有一条明显的中线。沿脊髓走行的两条较宽的线条可用于识别背侧。在最远端，成年大鼠和成年小鼠有时仍可能残留马尾神经。

单个背根神经节（DRG）只有在位于脊柱内时才能被识别，如图2所示。在分离后，如图3所示，单个DRG无法通过外观进行识别。因此，如有需要，在分离过程中必须将其明确分开并保持独立。分离后，脊髓和DRG可按照步骤7.3所述进行处理和染色，如图4所示。图4a显示了DRG切片的免疫组织化学染色结果，其中神经元及其周围的卫星胶质细胞清晰可见。通过准确识别DRG，可分析坐骨神经损伤对受损神经元胞体及其周围卫星胶质细胞的影响。图4b显示了液压挤出的脊髓的尼氏（Nissl）染色结果，切片边缘平滑，表明组织保持完整。

背根神经节和脊髓组织切片、免疫组织化学、带有施万细胞的轴突、荧光。
图 4：代表性组织切片。A. 背根神经节切片的免疫组织化学染色。 B. 液压挤出脊髓的尼氏染色切片。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

如果脊柱受到干扰， 例如 通过颈椎脱位处死时，脊髓在挤出过程中可能会断裂。如果脊髓无法挤出，可将脊柱两端稍作修剪后再次尝试挤出。若后续分析需要完整的脊髓， 即 包括颈膨大和腰膨大，脊柱仅需轻微修剪。若仅需腰膨大进行后续分析，应根据本方案修剪脊髓。使用指尖将脊柱伸直，以利于脊髓的挤出。

该方案适用于所有年龄段的啮齿类动物，本文以成年小鼠（8周龄）、幼鼠（5日龄）和成年大鼠（10周龄）为例进行说明。根据动物种类和品系的不同，胸段和腰段脊髓的节段数量可能有所差异。9,10,11根据待分析的蛋白质，可在处死前对成年啮齿类动物灌注含酶抑制剂的溶液。若进行单侧神经损伤实验，可在脊髓组织取出后立即使用超细镊子将其分为同侧与对侧。此外，每侧还可进一步分为背侧和腹侧。随后可对组织进行后续分析处理。 例如 蛋白质印迹法

在脊髓挤出前应避免使用PFA进行经心脏灌注固定，因为这会使脊髓失去柔韧性，从而阻碍脊髓的液压挤出。液压脊髓挤出会导致背根被撕脱。对于需要保留附着背根的实验，建议采用椎板切除术。此外，液压脊髓挤出会丢失脊髓脑膜，而标准的椎板切除术可避免这一问题3。

可以使用充氧的人工脑脊液（ACSF）代替冰冻的磷酸盐缓冲液（PBS）进行脊髓液压挤出和背根神经节（DRG）的分离。使用ACSF可使分离的组织处于更接近生理状态的环境中，这对于后续进行电生理记录尤为重要12,13。对于建立原代DRG培养，也可选用含有1 g/L葡萄糖的PBS作为替代方案14。

与传统的椎板切除法分离脊髓相比，液压挤出脊髓是一种显著更快的方法，可减少组织操作时间，从而降低蛋白质损伤的风险。在通过椎板切除法分离脊髓前，用固定剂灌注可能减少解剖过程中以及最终将脊髓从脊柱中取出时的组织损伤风险。然而，组织固定会使其无法适用于如蛋白质印迹（Western blotting）等分析。液压挤出法可获得结构完整无损的组织3，适用于更广泛的分析。

背根神经节的稳定鉴定可能存在困难，但对组织分析至关重要。 例如 坐骨神经损伤后。通过根据背根神经节（DRGs）相对于肋骨的位置进行编号，可实现DRGs的准确定位。通过实施第7步实验方案中所示的组织处理方法的多种优化方案，可进一步改善脊髓组织及DRGs的染色效果。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢奥胡斯大学的 David Kiel 提供拍摄与剪辑工作。显微镜视频序列的处理使用了 VirtualDub 软件。感谢丹麦转化神经科学研究中心（DANDRITE），Nordic EMBL 合作伙伴关系，提供设备使用权限；同时感谢奥胡斯大学研究基金会、欧盟第七框架计划项目 PAINCAGE、丹麦独立研究理事会（DFF）以及伦贝克基金会提供的经费支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
邦氏剪刀，超细，直刃，8.5 cmF.S.C. (Fine Science Tools)# 14084-08用于在分离背根神经节（成年小鼠、成年大鼠）前切开脊髓；可使用其他厂家产品
离心机Eppendorf# 5427 R用于匀浆组织的离心
冷冻切片机Leica Biosystems# CM 3050 S用于染色前对包埋组织进行切片；可使用其他型号和厂家产品
镊子，Dumont #3F.S.C. (Fine Science Tools)# 11231-30用于脊髓挤出后的操作；可使用其他厂家或类型
镊子，Dumont #5F.S.C. (Fine Science Tools)# 11252-20用于背根神经节的分离（成年小鼠、成年大鼠、幼鼠）；可使用其他厂家产品
异氟烷（氟烷）IsoFlo Vet 100%Abbott# 002185用于安乐死；可使用其他厂家产品；注意：有毒性
异戊烷 GPR rectapurVWR chemicals# 24872.298用于组织的速冻；可使用其他厂家产品；注意：有毒性
切片机Leica Biosystems# RM 2155用于石蜡包埋组织的切片；可使用其他型号和厂家产品
石蜡颗粒Sigma-Aldrich# 76243用于石蜡包埋；可使用其他厂家产品
石蜡组织包埋工作站Leica Biosystems# EG1160用于组织的石蜡包埋以便后续切片；可使用其他型号和厂家产品
电动无绳研磨杵Sigma-Aldrich# Z359971-1EA用于Western blot前对分离组织进行机械匀浆；可使用其他厂家产品
培养皿，35 mmThermo Fischer Scientific# 121V用于储存分离的背根神经节；可使用其他厂家和尺寸
培养皿，100 mmSigma-Aldrich# P7741用于脊髓挤出；可使用其他厂家和尺寸
磷酸酶抑制剂 PhosSTOPSigma-Aldrich# 04906845001磷酸酶抑制剂混合物，可根据需要加入TNE裂解缓冲液中；可使用其他厂家产品
移液器吸头，1–200 μL，无滤芯Sarstedt# 70.1189.105用于液压挤出；可使用其他厂家产品
蛋白酶抑制剂 CompleteSigma-Aldrich# 05892791001蛋白酶抑制剂混合物，可根据需要加入TNE裂解缓冲液中；可使用其他厂家产品
RNA later 溶液Sigma-Aldrich# R0901用于RNA稳定保存；可使用其他厂家产品
RNeasy Protect Mini KitQiagen# 74124用于RNA提取；可使用其他厂家产品
手术刀；Swann-Morton 11号手术刀片Swann-Morton# REF0203用于分离脊髓腰段；可使用其他厂家或类型
剪刀，直刃，3型，25 mm刃口Bochem# 4070用于脊柱的分离；可使用其他厂家或类型
剪刀，130 mm刃口Hounisen# 1902.0130用于脊髓的分离（成年大鼠）
弹簧剪，直刃，8 mm刃口F.S.C. (Fine Science Tools)# 15009-08用于在分离背根神经节（幼鼠）前切开脊柱，以及用于背根神经节的分离（成年小鼠、成年大鼠、幼鼠）；可使用其他厂家产品
标准注射器，2.5 mL、5 mL、10 mLTerumo# SS02SE1；# SS05SE1；# SS10SE1用于液压挤出；可使用其他厂家产品
体视显微镜 MZ12.5，配备1X物镜和10X目镜Leica# 10446370可使用其他厂家或类型
无菌PBSGIBCO# 10010-015用于液压挤出；也可根据标准方案自行配制
注射器针头 23 G × 1"，0.6 × 25 mmTerumo Neolus# NN-2325R用于幼鼠的液压挤出；可使用其他厂家或类型
注射器针头 18 G × 1 1/2，1.2 × 40 mmTerumo Neolus# NN-1838S可替代移液吸头用于成年小鼠的液压挤出；可使用其他厂家产品
Tissue-TekSakura# 4583用于后续冷冻切片的组织包埋介质
TNE裂解缓冲液VWR chemicals# 10128-582用于Western blot前的组织裂解；可使用其他厂家产品；也可根据标准方案自行配制

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