测量神经肌肉接头功能

Summary

（诸多） 神经肌肉接头功能评估可以提供有关肌肉和神经之间的通信的基本信息。在这里，我们描述一项议定书，全面评估的诸多和肌肉功能使用两种不同的肌肉神经制剂，即比目鱼坐骨神经和膈肌膈。

Abstract

学习运动神经元和肌肉之间的通信受损，老化和萎缩侧索硬化 (ALS) 等疾病时，神经肌肉接头 （诸多） 功能发挥了关键作用。在这里，我们描述了一个实验性的协议，可以用于衡量诸多功能相结合的电刺激的两种类型: 直接肌肉膜刺激和通过神经刺激。对这些两不同刺激的肌肉反应的比较可以帮助定义，一级功能，在诸多导致肌肉功能下降的潜在变化。

Ex vivo筹备工作适合于严谨的研究。在这里，我们描述密集的协议来衡量的肌肉和诸多功能为比目鱼坐骨神经制备和膈肌膈神经编写几个参数。议定书 》 持续约 60 分钟，进行不间断地定制抽搐动力学性质、 力频率关系的肌肉和神经的刺激和两个参数特定于诸多功能，即神经递质失败和 intratetanic 疲劳的措施的软件。这种方法用于检测损害比目鱼肌和膈膜肌肉神经制剂中通过使用 SOD1^G93A转基因小鼠，ALS 无所不在 overexpresses 突变体的抗氧化剂酶超氧化物歧化酶 1 (SOD1) 实验模型。

Introduction

神经肌肉接头 （诸多） 是由肌肉纤维运动终板和运动神经元轴突末端之间的连接形成化学突触。诸多已被证明至关重要的作用，当肌肉和神经之间的通信是受损，发生在老化或萎缩侧索硬化 (ALS)。肌肉和神经沟通双向方式^1，2，能够衡量诸多缺陷分别从肌肉缺损可提供其病理相互作用的新见解。事实上，这个功能的评价可能有助于评估是否形态或生化改建减少神经传递信号的功能。

作为间接测量的诸多功能，提出了肌肉收缩反应诱发神经刺激和诱发其膜的直接刺激同一块肌肉的反应的比较。事实上，自膜刺激通过传递神经传递信号，任何两个收缩反应的差异可归因于诸多的变化。这种方法已经被广泛提出大鼠^{3，4，，56，7}，并也用于在鼠标模型^{8，，910，，}

Protocol

所有动物实验均由罗马第一大学组织学和医学胚胎学部门伦理委员会批准，并按照现行版本的意大利动物保护法进行。

1. 实验设置

1. 设置由 1 个执行器/传感器、2 个刺激器、1 个体外肌肉装置、1 个准备组织浴、1 个抽吸电极、1 个数字示波器、1 个立体显微镜、1 个冷光照明器、1 个采集板、1 个连接器块和一台个人电脑组成的实验系统><。 注意：这里的命令软件是在 LabView 中编程的，旨在保证刺激的高度灵活性、准确性和可重复性。对于每次刺激，用户可以选择脉冲宽度、频率、持续时间，并决定它是传递到膜还是通过神经。用户还可以选择每次刺激前的休息时间长度。

2. 比目鱼肌和横膈肌 NMJ 收缩特性的评估

1. 系统预热
   1. 准备 Krebs Ringer 缓冲液¹⁴ 并将其放入安装装置和准备组织浴的浴中。将用 4 ml 硅制备的 60 mm 培养皿放入准备组织浴中。
   2. 打开循环水浴，将比目鱼肌的温度设置为 30 °C，将膈肌的温度设置为 27 °C。
   3. 让 95% O₂ - 5% CO₂ 混合物流入两个浴槽。
   4. 打开致动器/换能器和两个脉冲刺激器，....

Results

我们描述了议定书 》 提供了几种神经肌肉疾病或衰老骨骼肌功能失神经支配有关的信息。这个协议可以用于确定是否 （以及，如果是这样，在哪个层面） 肌肉变化是发生在本身的肌肉或神经肌肉传递的选择性变化。如下图所示的数据是工作的以前由我们组¹⁸，肌萎缩侧索硬化疾病²⁰结束阶段 SOD1^G93A转基因小鼠模型上进行的结果。SOD1^G93A转基因小鼠无所不在 overexpresses 突变体的抗氧化剂酶超氧化物歧化酶 1 (SOD1)。图 3 和图 4 显示了 dF/dt 和破伤风力值比目鱼坐骨神经神经 （左） 和膈肌膈神经 （右） 的筹备工作。这些结果表明在这里提出来检测功能缺陷在转基因的肌肉而不是那些严格有关肌肉本身相关的诸多的技术能力。事实上，对于 dF/dt 和破伤风力，SOD1^G93A比目鱼肌显示相比控制肌肉，直接刺激，并显示通过神经受到刺激时进一步减少时减少收缩反应。相比之下，轻度改变观察这两个参数通过膜，刺激.......

Discussion

上述实验协议提供一个理想的测量和识别任何功能的改变发生在肌肉中直接或间接在神经肌肉接头处一级途径。由于这项技术基于间接测量的诸多功能，它不能用于建立与形态学变化或与生化指标的变化，是否有关任何缺陷。与此相反的是，它提供确定是否任何形态或生化改建有减少神经递质信号功能的有效途径。然而，力测量完成后，肌肉可以从浴、 涂抹、 在最佳长度固定，，包围嵌入化合物，并移除迅速冻结在融化异戊烷。肌肉可以存储在-80 ° C 后续评估，如免疫组织化学和形态学分析等。

我们在这里提出的技术基于实验的测试协议，结合，第一次，表征诸多和肌肉功能的几个参数的测量。三个关键点可确保这种技术产生可靠的结果。

第一，虽然骨骼肌肉切除现在是一个比较常见的技术，以保持肌肉神经外科手续时，必须采取额外的照顾。尝试任何其他实验的模型之前，因此必须对控制小鼠测试经营者的能力。在对照组小鼠，直接和间接刺激肌肉收缩反应预计是相同的从而提供对运营商的手术能力的控制。

另一个关键的一点是需要确保直接脉冲却不会在刺激内神.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
双模式杠杆系统	极光科技公司	300B	执行器/传感器
双相刺激器	极光科技公司	701B	脉冲刺激器（神经）
高功率双相刺激器	极光科技公司	701C	脉冲刺激器（肌肉）
体外肌肉仪	极光科技公司	800A
准备组织浴	Radnoti	158400
单极抽吸电极	A-M 系统	573000	带自制参考
示波器	Tektronix	TDS2014
体视显微镜	Nikon	SMZ 800
冷光照明器	Photonic Optics	PL 3000
采集板	National Instruments	NI PCIe-6353
连接器块	National Instruments	NI 2110
个人电脑	AMD Phenom II x4 970		处理器 3.50 Ghz，带 Windows 7
LabView 2012 软件	National Instruments
Krebs-Ringer 碳酸氢盐缓冲器	Sigma-Aldrich	K4002	生理缓冲
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S5761
氯化钙 CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901	无水、粉末和ge;97%
缓冲液 HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	≥99.5%（滴定）
培养皿 60mm x 15mm	Falcon	353004	聚苯乙烯
硅胶	Sylgard	184 硅胶	弹性体套件  0.5Kg.
恒温器	Dennerle	DigitalDuomat 1200
泵	Newa Mini	MN 606	用于水族馆
耐热性 热电缆	幸运爬行动物	61403-1	50/60Hz 50W
桶	任意 10 升		聚丙烯
O2 + 5%CO2	siad		混合气体
#5 镊子	精细科学工具	11252-20	2件
弹簧剪刀 - 8毫米刀片精细	科学工具	15024-10	神经切除
锐利剪刀	精细科学工具	14059-11	肌肉去除
精致剪刀	Wagner	02.06.32	动物外部
学生手术刀手柄 #3	精细科学工具	91003-12
手术刀刀片 #10	精细科学工具	10010-00
手术刀刀片 #11	精细科学工具	10011-00
尼龙丝 Ø0.16 mm	任意