测量神经肌肉接头功能

摘要

神经肌肉接头（NMJ）的功能评估可提供有关肌肉与神经之间通信的关键信息。本文介绍了一种利用两种不同的肌肉-神经标本——即比目鱼肌-坐骨神经和膈肌-膈神经——全面评估NMJ及肌肉功能的实验方案。

摘要

在研究运动神经元与肌肉之间通信功能受损的疾病（如衰老和肌萎缩侧索硬化症，ALS）时，神经肌肉接头（NMJ）的功能起着关键作用。本文介绍了一种实验方案，可通过结合两种类型的电刺激——直接肌肉膜刺激和通过神经的刺激——来评估NMJ功能。比较肌肉对这两种不同刺激的反应，有助于在功能层面上明确NMJ中可能导致肌肉功能下降的潜在改变。

E离体 制备样品适用于严格控制的研究。本文介绍了一种用于腓肠肌-坐骨神经制备和膈肌-膈神经制备的强化方案，以测量肌肉及神经肌肉接头（NMJ）功能的多个参数。该方案持续约60分钟，通过定制装置不间断地进行。 用于测量肌肉收缩动力学特性、肌肉与神经刺激下的力-频率关系，以及神经肌肉接头（NMJ）功能特异性的两个参数，即神经传递衰竭和串内疲劳的软件。该方法学被用于通过 SOD1 检测腓肠肌和膈肌肌肉-神经标本的损伤情况^G93A 转基因小鼠，一种ALS的实验模型，该模型普遍过表达突变的抗氧化酶超氧化物歧化酶1（SOD1）。

引言

神经肌肉接头（NMJ）是由肌纤维的运动终板与运动神经元轴突末梢连接形成的化学突触。研究表明，当肌肉与神经之间的通信受损时（如在衰老或肌萎缩侧索硬化症（ALS）中），NMJ发挥着关键作用。由于肌肉与神经之间存在双向通信^1,2，能够将NMJ功能障碍与肌肉本身缺陷区分开来单独测量，可能有助于深入理解二者之间的病理生理相互作用。事实上，这种功能评估有助于判断形态学或生物化学的改变是否导致了神经传递信号功能的下降。

通过比较神经刺激引发的肌肉收缩反应与直接刺激同一肌肉膜所引发的收缩反应，已被提出作为神经肌肉接头（NMJ）功能的间接测量方法。事实上，由于膜刺激绕过了神经递质传递信号，因此两种收缩反应之间的任何差异均可归因于神经肌肉接头的变化。该方法已在大鼠中被广泛采用^3,4,5,6,7，并同样用于获取小鼠模型的相关信息^8,9....

方案

所有动物实验均经罗马第一大学组织学与医学胚胎学系伦理委员会批准，并依照现行的意大利动物保护法进行。

1. 实验设置

1. 设置由1个执行器/换能器、2个刺激器和1个组成的实验系统 体外 肌肉装置，1个组织浴槽，1个吸电极，1台数字示波器，1台体视显微镜，1个冷光源照明器，1块数据采集板，1个连接块和1台个人计算机。
   注意：此处的控制软件采用 LabView 编程，旨在确保刺激的高度灵活性、准确性和可重复性。对于每次刺激，用户可选择脉冲宽度、频率和持续时间，并决定刺激施加于膜上或通过神经传递。用户还可选择每次刺激前的休息时长。

2. 腘绳肌和膈肌神经肌肉接头收缩特性的评估

1. 系统预热
   1. 配制 Krebs Ringer 缓冲液¹⁴ 将其放入固定装置的浴槽和组织预处理浴槽中。在组织预处理浴槽中放置一个已加入4 ml硅油的60 mm培养皿。
   2. 打开循环水浴锅并将温度设定为 30 °C 用于比目鱼肌以及 27 °C 膈肌。
   3. 允许 95% O₂ - 5% CO₂₂ 使混合物流入两个浴槽中。
   4. 打开驱动器/换能器以及两个脉冲刺激器，将膜刺激的电流值....

结果

本方案可提供关于多种神经肌肉疾病或衰老相关肌肉减少症中功能性去神经支配的信息。该方案可用于确定肌肉的改变是否由肌肉本身或神经肌肉传递过程中的选择性变化引起，以及（若存在）发生在哪个层面。下图所示数据来自我们课题组此前的一项研究¹⁸，研究对象为肌萎缩侧索硬化症（ALS）的SOD1^G93A转基因小鼠模型，在疾病终末期进行检测²⁰。SOD1^G93A转基因小鼠全身性地过表达突变型抗氧化酶超氧化物歧化酶1（SOD1）。图3和图4分别展示了比目鱼肌-坐骨神经（左）和膈肌-膈神经（右）标本的dF/dt值和强直收缩力值。这些结果表明，本研究所提出的技术能够区分转基因肌肉中与神经肌肉接头（NMJ）相关的功能缺陷和仅与肌肉本身相关的功能缺陷。事实上，无论是dF/dt还是强直收缩力，SOD1^G93A比目鱼肌在直接刺激时的收缩反应均低于对照组肌肉，而通过神经刺激时则进一步降低。相比之下，当膈肌条通过膜直接刺激时，这两项参数仅表现出轻微改.......

讨论

上述实验方案为检测和区分肌肉本身直接发生或神经肌肉接头水平间接发生的功能改变提供了一种理想方法。由于该技术基于对神经肌肉接头功能的间接测量，因此无法用于确定任何功能缺陷是否与形态学变化或生物化学变化相关。然而，该方法能够有效判断任何形态学或生物化学改变是否导致了神经传递信号功能的下降。在完成力学测量后，可将肌肉从浴槽中取出，吸干，固定于最佳长度，周围包埋于包埋剂中，并在融化的异戊烷中快速冷冻。肌肉样品可在 -80 °C 下保存，以备后续进行免疫组织化学和形态学分析等评估。

本文提出的实验技术基于一种测试方案，该方案首次结合了对表征神经肌肉接头（NMJ）和肌肉功能的多个参数的测量。三个关键要点确保了该技术能够获得可靠的结果。

首先，尽管骨骼肌切除现在是一种相对常见的技术，但在进行手术操作时必须格外小心，以确保神经与肌肉保持完整连接。因此，在尝试任何其他实验模型之前，应先在对照小鼠上检验操作者的技术水平。在对照小鼠中，肌肉对直接刺激和间接刺激的收缩反应应相同，从而为操作者的手术能力提供对照依据。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
双模式杠杆系统	Aurora Scientific Inc.	300B	驱动器/传感器
高功率双相刺激器	Aurora Scientific Inc.	701B	脉冲刺激器（神经）
高功率双相刺激器	Aurora Scientific Inc.	701C	脉冲刺激器（肌肉）
离体肌肉实验装置	Aurora Scientific Inc.	800A
组织预处理浴槽	Radnoti	158400
单极吸引电极	A-M Systems	573000	配自制参考电极
示波器	Tektronix	TDS2014
体视显微镜	Nikon	SMZ 800
冷光源照明器	Photonic Optics	PL 3000
数据采集板	National Instruments	NI PCIe-6353
连接器模块	National Instruments	NI 2110
个人计算机	AMD Phenom II x4 970		处理器 3.50 GHz，搭载 Windows 7 操作系统
LabView 2012 软件	National Instruments
Krebs-Ringer 碳酸氢盐缓冲液	Sigma-Aldrich	K4002	生理缓冲液
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S5761
氯化钙 CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901	无水，粉末，≥97%
HEPES 缓冲液	Sigma-Aldrich	H3375	≥99.5%（滴定法）
培养皿 60 mm × 15 mm	Falcon	353004	聚苯乙烯
硅胶	Sylgard	184 硅胶	弹性体套件  0.5 kg
恒温器	Dennerle	DigitalDuomat 1200
泵	Newa Mini	MN 606	用于水族箱
耐热温控电缆	Lucky Reptile	61403-1	50/60 Hz 50 W
桶	任意 10 升		聚丙烯
O2 + 5%CO2	siad		混合气体
#5 镊子	Fine Science Tools	11252-20	2 件
弹簧剪刀 - 8 mm 刀片	Fine Science Tools	15024-10	神经切除
锐利剪刀	Fine Science Tools	14059-11	肌肉剥离
精细剪刀	Wagner	02.06.32	动物体表操作
学生型手术刀柄 #3	Fine Science Tools	91003-12
手术刀片 #10	Fine Science Tools	10010-00
手术刀片 #11	Fine Science Tools	10011-00
尼龙丝 Ø0.16 mm	任意