测量神经肌肉接头功能

摘要

（诸多） 神经肌肉接头功能评估可以提供有关肌肉和神经之间的通信的基本信息。在这里，我们描述一项议定书，全面评估的诸多和肌肉功能使用两种不同的肌肉神经制剂，即比目鱼坐骨神经和膈肌膈。

摘要

学习运动神经元和肌肉之间的通信受损，老化和萎缩侧索硬化 (ALS) 等疾病时，神经肌肉接头 （诸多） 功能发挥了关键作用。在这里，我们描述了一个实验性的协议，可以用于衡量诸多功能相结合的电刺激的两种类型: 直接肌肉膜刺激和通过神经刺激。对这些两不同刺激的肌肉反应的比较可以帮助定义，一级功能，在诸多导致肌肉功能下降的潜在变化。

Ex vivo筹备工作适合于严谨的研究。在这里，我们描述密集的协议来衡量的肌肉和诸多功能为比目鱼坐骨神经制备和膈肌膈神经编写几个参数。议定书 》 持续约 60 分钟，进行不间断地定制抽搐动力学性质、 力频率关系的肌肉和神经的刺激和两个参数特定于诸多功能，即神经递质失败和 intratetanic 疲劳的措施的软件。这种方法用于检测损害比目鱼肌和膈膜肌肉神经制剂中通过使用 SOD1^G93A转基因小鼠，ALS 无所不在 overexpresses 突变体的抗氧化剂酶超氧化物歧化酶 1 (SOD1) 实验模型。

引言

神经肌肉接头 （诸多） 是由肌肉纤维运动终板和运动神经元轴突末端之间的连接形成化学突触。诸多已被证明至关重要的作用，当肌肉和神经之间的通信是受损，发生在老化或萎缩侧索硬化 (ALS)。肌肉和神经沟通双向方式^1，2，能够衡量诸多缺陷分别从肌肉缺损可提供其病理相互作用的新见解。事实上，这个功能的评价可能有助于评估是否形态或生化改建减少神经传递信号的功能。

作为间接测量的诸多功能，提出了肌肉收缩反应诱发神经刺激和诱发其膜的直接刺激同一块肌肉的反应的比较。事实上，自膜刺激通过传递神经传递信号，任何两个收缩反应的差异可归因于诸多的变化。这种方法已经被广泛提出大鼠^{3，4，，56，7}，并也用于在鼠标模型^{8，，910，，1112}上收集信息。

在这里，我们描述详细的消费税和测试两种肌肉神经制剂，即的比目鱼坐骨神经和膈肌膈筹备工作的过程。使用定制软件，我们设计了一个连续的测试协议，结合测量的几个重要参数表征诸多和肌肉的功能，从而产生诸多损害综合评价分别从那肌肉。特别是，议定书 》 的措施抽搐力、 肌肉动力学、 直接力频率曲线和神经刺激，神经递质失败¹³射击和破伤风的频率，和 intratetanic 疲劳⁷。

方案

所有动物实验均由罗马第一大学组织学和医学胚胎学部门伦理委员会批准，并按照现行版本的意大利动物保护法进行。

1. 实验设置

1. 设置由 1 个执行器/传感器、2 个刺激器、1 个体外肌肉装置、1 个准备组织浴、1 个抽吸电极、1 个数字示波器、1 个立体显微镜、1 个冷光照明器、1 个采集板、1 个连接器块和一台个人电脑组成的实验系统><。 注意：这里的命令软件是在 LabView 中编程的，旨在保证刺激的高度灵活性、准确性和可重复性。对于每次刺激，用户可以选择脉冲宽度、频率、持续时间，并决定它是传递到膜还是通过神经。用户还可以选择每次刺激前的休息时间长度。

2. 比目鱼肌和横膈肌 NMJ 收缩特性的评估

1. 系统预热
   1. 准备 Krebs Ringer 缓冲液¹⁴ 并将其放入安装装置和准备组织浴的浴中。将用 4 ml 硅制备的 60 mm 培养皿放入准备组织浴中。
   2. 打开循环水浴，将比目鱼肌的温度设置为 30 °C，将膈肌的温度设置为 27 °C。
   3. 让 95% O₂ - 5% CO₂ 混合物流入两个浴槽。
   4. 打开致动器/换能器和两个脉冲刺激器，将电流值设置为 300 mA 用于膜刺激，电流值设置为 5 mA 用于神经刺激><。 注意：当 D-tubocurarine 加入溶液中时，300 mA 电流值先前已被证明不会在神经分支上引起任何显着收缩¹⁵。5 mA 电流值对应于通过神经刺激肌肉而不与通过溶液诱导的膜刺激产生重叠所需的电流量。由于抽吸电极和肌肉之间的距离取决于神经长度，因此在每次实验之前必须仔细调整该电流值，如下所述。
2. 比目鱼肌和膈肌夹层
   1. 通过颈椎脱位牺牲小鼠以尽量减少痛苦，并立即切除肌肉进行测试，如下所示。
   2. 比目鱼肌坐骨神经骨的准备、解剖和设置
      1. 将 70% 乙醇喷洒在小鼠腿上，去除覆盖在腿上的皮肤。用剪刀在腿的上部切开，然后用力拉扯皮肤。将跟腱与胫骨隔离，然后用剪刀剪断跟腱。
      2. 用一对镊子紧紧夹住肌腱，轻轻地将腓肠肌与比目鱼肌拉在一起。一旦比目鱼肌的近端肌腱暴露出来，用剪刀剪断整个小腿，同时仍然握住跟腱。立即将组织样品放入制备组织浴中。
      3. 将准备浴放在立体显微镜下，并使用直径为 0.20 毫米的不锈钢销将小牛固定在硅培养皿上。用一对镊子夹住比目鱼肌的近端肌腱，轻轻拉动，露出坐骨神经支配。
      4. 一旦神经支配暴露出来（图 1），小心地去除周围组织以暴露约 5 毫米的神经。用一把细剪刀剪断神经。用一把镊子将比目鱼肌紧紧夹在近端肌腱上，再次拉动并用剪刀剪断跟腱将其切除。
      5. 将尼龙丝穿过致动器/换能器的杠杆臂孔。在钢丝的末端做一个套索，抓住跟腱，然后将钢丝拉回，直到肌肉到达安装装置的浴槽。将近端肌腱夹在固定夹内，并将尼龙丝系在杠杆臂上。让肌肉在溶液中平衡。
      6. 确定初始最佳长度 （L₀）。
         1. 首先，拉伸肌肉以将其预加载为 10 mN（此值保证最大抽搐力（根据经验））。然后，轻轻伸展肌肉以改变前负荷，并用一系列的单次脉冲刺激它。当测量最大抽搐力时，可以达到最佳长度。
   3. 膈膈制备、解剖和设置
      1. 将 70% 乙醇喷洒在小鼠皮肤上。用剪刀在胸骨上切开并用力拉动皮肤，去除覆盖在横膈肌上的皮肤。
      2. 用一把剪刀，水平切开胸骨下方的腹部，然后用一把镊子轻轻地去除肠道和器官。用一把粗剪刀剪断书脊。
      3. 在胸骨上方切下肋骨约 1 厘米，然后水平进行。用一对镊子轻轻地去除外部器官并切开脊柱，以获得一个包含隔膜的圆形肋骨环。
      4. 在含有 Krebs 林格缓冲液的培养皿中洗涤制剂，然后将其放入制备组织浴内的硅胶培养皿中，上侧朝上，胸骨朝前。
      5. 使用立体显微镜，小心地取出肺和其余器官;膈神经将在右侧可见（图 2A）。
      6. 修剪肋条，沿隔膜留下一个约 2 毫米的环。
      7. 使用镊子，将一个直径为 0.20 毫米的不锈钢销固定在膈中央肌腱上与膈神经支配相对应的点，并将另一个销固定在同一轴上的肋骨上，以识别感兴趣的膈条。
      8. 将两个额外的销钉固定在中央肌腱上，固定在所选条带两侧的肋骨上，以布置隔膜。如有必要，使用镊子从周围结缔组织中清洁膈神经。
      9. 使用弯曲的刀片，切开神经支配两侧的隔膜，以识别肌腱-肌肉-肋骨条带，如 图 2B。
      10. 将尼龙丝穿过致动器/换能器的杠杆臂孔。在钢丝末端制作一个套索并抓住肌腱，然后将钢丝向后拉，直到肌肉到达安装装置的浴槽。
      11. 夹住固定夹内的肋条，并将尼龙丝系在杠杆臂上。
      12. 让肌肉在溶液中平衡并确定初始最佳长度 （L0）。
          1. 拉伸肌肉以将其预加载 5 mN。轻轻伸展肌肉以改变前负荷，并用一系列的单脉冲刺激它。当测量最大抽搐力时，可以达到最佳长度。

图 1 - 比目鱼肌坐骨神经准备。外科手术期间的比目鱼肌坐骨神经进行功能测试。坐骨神经痛使用一对镊子暴露出来。请点击这里查看此图的较大版本。

图 2 - 膈神经准备。图为隔膜-膈神经准备切除术的阶段 （A） 和用于功能测试的安装条 （B）。请点击这里查看此图的较大版本。

3. 将 NMJ 特性与肌肉收缩力分开测量
   1. 设置通过神经刺激的最佳电流强度，并验证通过抽吸电极传递的电流脉冲不会因浴中电流的扩散而引起肌肉收缩。
      1. 将抽吸电极放在肌肉附近并拉入神经。在轻轻增加电流强度（从 5 mA 开始）的同时，用一系列单脉冲刺激肌肉。当抽搐力最大时，将确定最佳电流值。
      2. 将神经推出电极并传递几个单脉冲。确保肌肉不会因与溶液刺激膜重叠而收缩。再次拉动神经。
   2. 启动程序并选择输入文件以运行所需的测试协议。
      注意：输入文件包括运行整个协议所需的所有刺激参数。尽管两块肌肉使用相同的协议结构，但刺激参数因协议而异，指的是比目鱼肌或横膈肌。
      1. 比目鱼肌坐骨神经刺激（见 表 1）
         1. 对所有电刺激使用以下脉冲宽度：坐骨神经刺激为 1.4 ms，直接比目鱼肌刺激为 0.1 ms。完整的协议持续约 65 分钟。
      2. 膈膈神经刺激（见 表 2）
         对所有
         1. 电刺激使用以下脉冲宽度：膈神经刺激为 1.8 ms，直接隔膜刺激为 0.2 ms。完整的协议持续约 55 分钟。
      3. 在实验方案结束时，使用精度为 0.05 毫米的模拟卡尺和精度为 0.1 毫克的精密刻度测量肌肉的长度和湿重。
         1. 通过将肌肉质量除以最佳纤维长度 （L_f） 和哺乳动物骨骼肌密度 （1.06 mg/mm³） 的乘积来计算横截面积 （CSA）¹⁶.
            注：L_f 是通过将 L₀ 乘以纤维长度/肌肉长度比（比目鱼肌为 0.71¹⁶，膈肌为 1^17）得到的。

<表格border="1" fo：keep-together.within-page="1" fo：keep-with-next.within-page="always"> 实验类型 频率 期间 重复 肌肉或神经刺激 目的 （赫兹） （秒） 抽搐 单脉冲 1 肌肉 Twitch 力和动力学 休息 30 抽搐 单脉冲 1 神经 休息 30 抽搐 单脉冲 1 肌肉 休息 30 抽搐 单脉冲 1 神经 休息 120 元 未融合的破伤风 40 0,8 1 神经 神经和肌肉刺激的力/频率曲线 休息 180 元 未融合的破伤风 60 0,8 1 肌肉 休息 180 元 熔融性破伤风 80 0,8 1 神经 休息 180 元 未融合的破伤风 20 0,8 1 肌肉 休息 180 元 未融合的破伤风 60 0,8 1 神经 休息 180 元 熔融性破伤风 80 0,8 1 肌肉 休息 180 元 未融合的破伤风 20 0,8 1 神经 休息 180 元 未融合的破伤风 40 0,8 1 肌肉 休息 300 疲劳范式 35 0,8 1 次肌肉刺激，然后是 14 次神经刺激，每次休息时间为 1.2 秒，重复 20 次 神经传递衰竭 （NF） 休息 900 元 疲劳范式 80 0,8 1 次肌肉刺激，然后是 14 次神经刺激，每次休息时间为 1.2 秒，重复 20 次 神经传递衰竭 （NF） 和内部疲劳 （IF）

表 1 - 比目鱼肌坐骨神经刺激方案。该表列出了构成测试比目鱼肌坐骨神经准备的完整方案的测试顺序。

<表格border="1" fo：keep-together.within-page="1" fo：keep-with-next.within-page="always"> 实验类型 频率 期间 重复 肌肉或神经刺激 目的 （赫兹） （秒） 抽搐 单脉冲 1 肌肉 Twitch 力和动力学 休息 30 抽搐 单脉冲 1 神经 休息 30 抽搐 单脉冲 1 肌肉 休息 30 抽搐 单脉冲 1 神经 休息 120 元 未融合的破伤风 60 0,5% 1 神经 神经和肌肉刺激的力/频率曲线 休息 120 元 熔融性破伤风 100 0,5% 1 肌肉 休息 180 元 未融合的破伤风 40 0,5% 1 神经 休息 120 元 未融合的破伤风 20 0,5% 1 肌肉 休息 120 元 未融合的破伤风 80 0,5% 1 神经 休息 150 元 未融合的破伤风 80 0,5% 1 肌肉 休息 150 元 未融合的破伤风 20 0,5% 1 神经 休息 120 元 熔融性破伤风 100 0,5% 1 肌肉 休息 150 元 熔融性破伤风 100 0,5% 1 神经 休息 180 元 未融合的破伤风 60 0,5% 1 肌肉 休息 300 疲劳范式 35 0,33 1 肌肉刺激，然后进行 14 次神经刺激，每次休息时间为 0.67 s，重复 20 次 神经传递衰竭 （NF） 休息 900 元 疲劳范式 80 0,33 1 肌肉刺激，然后进行 14 次神经刺激，每次休息时间为 0.67 s，重复 20 次 神经传递衰竭 （NF） 和内部疲劳 （IF）

表 2 - 膈膈神经刺激方案。 该表列出了构成测试膈膈神经准备的完整方案的测试顺序。

3. 数据分析

注意：在协议结束时，计算所有需要的参数，如下所示。

1. 从单脉冲刺激
   1. 计算抽搐力 （mN;抽搐期间产生的最大主动力）和特定抽搐力 （mN/mm²）。通过将初始预紧值减去肌肉产生的最大力来计算它。计算特定抽搐力，即抽搐力除以肌肉 CSA。
   2. 计算达到峰值张力的时间 （TTP） （ms） 作为从脉冲释放到抽搐力的时间。
   3. 将半弛豫时间 （1/2RT） （ms） 计算为从抽搐力到 50% 抽搐力的时间。
   4. 计算 dF/dt （mN/ms） 作为收缩阶段力导数的最大值。
   5. 计算 -dF/dt （mN/ms） 作为松弛阶段力导数的最大值。
2. 来自脉冲序列的刺激
   1. 计算未熔合力 （mN） 和特定未熔合力 （mN/mm²）。通过将初始预紧值减去肌肉产生的最大力来计算它。计算比未融合力为未融合力除以肌肉 CSA.
      注：未熔合力是在频率低于破直频率的脉冲序列中产生的最大主动力。
   2. 计算破伤风力 （mN） 和比破伤风力 （mN/mm2）;最大力是以破伤风频率传递的脉冲序列期间产生的最大主动力。通过将初始预紧值减去肌肉产生的最大力来计算它。计算比破伤风力为破伤风力除以肌肉 CSA。
   3. 计算力-频率曲线。绘制每次刺激获得的力（或比力）值与刺激频率的增加。通常，它从单脉冲刺激开始，以破伤风频率结束。
3. 来自疲劳范式
   1. 计算神经传递失败 （NF） 为：
      
      其中 MF 是肌肉刺激后的力减小，F 是神经刺激后的力减小，在肌肉刺激后的第一次脉冲训练上测量。
   2. 计算内部疲劳 （IF） 为：
      
      其中 F_lp 是肌肉在最后一次刺激脉冲时产生的力，F_m 是肌肉在同一脉冲序列中产生的最大力。关于神经刺激，计算直接刺激后立即在第一个脉冲序列上的内部疲劳。

4. 统计分析

注意：必须根据肌肉对神经和膜刺激的反应是在同一动物模型内还是 2 个不同动物模型之间进行比较来选择统计分析模型^18，19。

1. 如果仅比较肌肉对直接和间接刺激的反应，请使用 TTP、1/2RT、dF/dt、-dF/dt 的学生 t 检验。如果比较从 2 种不同的小鼠菌株获得的肌肉制剂，请使用以刺激类型和小鼠菌株作为固定因子的 2 因子方差分析。当 2 因子方差分析返回显著结果时，使用多个比较检验来搜索统计差异。
2. 对于力-频率曲线（如果仅比较肌肉对直接和间接刺激的反应），使用 2 向方差分析，刺激类型和刺激频率作为固定因素。如果需要，使用多个比较测试。
   1. 如果比较从 2 种不同的小鼠菌株获得的肌肉制剂，请使用 3 向方差分析，并将刺激类型、刺激频率和小鼠菌株作为固定因子。
      1. 当 3 因子方差分析产生动物品系和刺激类型因素的显着影响时，使用 2 因子方差分析一次识别 2 组之间的显着差异。例如，可以评估 2 组肌肉对膜刺激的反应之间的差异，或者可以评估一组内肌肉对直接和间接刺激的反应之间的差异。
3. 内部疲劳
   注意：由于该方案旨在诱导响应神经刺激的疲劳，即使在对照小鼠中也是如此，因此该参数只能用于研究 2 种小鼠品系之间的差异，并且单组内的统计分析总是会产生显着差异。
   1. 为了比较两组，使用 3 向方差分析，以刺激类型、时间和小鼠应变作为固定因子。当 3 向方差分析产生动物应变和刺激类型因素的显着影响时，使用 2 向方差分析一次识别 2 组之间的显着差异，就像力 - 频率曲线一样。
4. 对于神经传递失败，使用以动物应变和时间作为固定因子的 2 向方差分析。如果返回显著性结果，请使用多个比较测试来搜索统计差异。
   注意：由于此参数仅为每个小鼠菌株返回一个值，因此它允许比较不同的小鼠模型。
5. 对于肌肉重量、长度和 CSA，使用 Student's t 检验来研究比较来自不同动物模型的肌肉神经准备时的差异。

结果

我们描述了议定书 》 提供了几种神经肌肉疾病或衰老骨骼肌功能失神经支配有关的信息。这个协议可以用于确定是否 （以及，如果是这样，在哪个层面） 肌肉变化是发生在本身的肌肉或神经肌肉传递的选择性变化。如下图所示的数据是工作的以前由我们组¹⁸，肌萎缩侧索硬化疾病²⁰结束阶段 SOD1^G93A转基因小鼠模型上进行的结果。SOD1^G93A转基因小鼠无所不在 overexpresses 突变体的抗氧化剂酶超氧化物歧化酶 1 (SOD1)。图 3 和图 4 显示了 dF/dt 和破伤风力值比目鱼坐骨神经神经 （左） 和膈肌膈神经 （右） 的筹备工作。这些结果表明在这里提出来检测功能缺陷在转基因的肌肉而不是那些严格有关肌肉本身相关的诸多的技术能力。事实上，对于 dF/dt 和破伤风力，SOD1^G93A比目鱼肌显示相比控制肌肉，直接刺激，并显示通过神经受到刺激时进一步减少时减少收缩反应。相比之下，轻度改变观察这两个参数通过膜，刺激...

讨论

上述实验协议提供一个理想的测量和识别任何功能的改变发生在肌肉中直接或间接在神经肌肉接头处一级途径。由于这项技术基于间接测量的诸多功能，它不能用于建立与形态学变化或与生化指标的变化，是否有关任何缺陷。与此相反的是，它提供确定是否任何形态或生化改建有减少神经递质信号功能的有效途径。然而，力测量完成后，肌肉可以从浴、 涂抹、 在最佳长度固定，，包围嵌入化合物，并移除迅速冻结在融化异戊烷。肌肉可以存储在-80 ° C 后续评估，如免疫组织化学和形态学分析等。

我们在这里提出的技术基于实验的测试协议，结合，第一次，表征诸多和肌肉功能的几个参数的测量。三个关键点可确保这种技术产生可靠的结果。

第一，虽然骨骼肌肉切除现在是一个比较常见的技术，以保持肌肉神经外科手续时，必须采取额外的照顾。尝试任何其他实验的模型之前，因此必须对控制小鼠测试经营者的能力。在对照组小鼠，直接和间接刺激肌肉收缩反应预计是相同的从而提供对运营商的手术能力的控制。

另一个关键的一点是需要确保直接脉冲却不会在刺激内神...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
双模式杠杆系统	极光科技公司	300B	执行器/传感器
双相刺激器	极光科技公司	701B	脉冲刺激器（神经）
高功率双相刺激器	极光科技公司	701C	脉冲刺激器（肌肉）
体外肌肉仪	极光科技公司	800A
准备组织浴	Radnoti	158400
单极抽吸电极	A-M 系统	573000	带自制参考
示波器	Tektronix	TDS2014
体视显微镜	Nikon	SMZ 800
冷光照明器	Photonic Optics	PL 3000
采集板	National Instruments	NI PCIe-6353
连接器块	National Instruments	NI 2110
个人电脑	AMD Phenom II x4 970		处理器 3.50 Ghz，带 Windows 7
LabView 2012 软件	National Instruments
Krebs-Ringer 碳酸氢盐缓冲器	Sigma-Aldrich	K4002	生理缓冲
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S5761
氯化钙 CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901	无水、粉末和ge;97%
缓冲液 HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	≥99.5%（滴定）
培养皿 60mm x 15mm	Falcon	353004	聚苯乙烯
硅胶	Sylgard	184 硅胶	弹性体套件  0.5Kg.
恒温器	Dennerle	DigitalDuomat 1200
泵	Newa Mini	MN 606	用于水族馆
耐热性 热电缆	幸运爬行动物	61403-1	50/60Hz 50W
桶	任意 10 升		聚丙烯
O2 + 5%CO2	siad		混合气体
#5 镊子	精细科学工具	11252-20	2件
弹簧剪刀 - 8毫米刀片精细	科学工具	15024-10	神经切除
锐利剪刀	精细科学工具	14059-11	肌肉去除
精致剪刀	Wagner	02.06.32	动物外部
学生手术刀手柄 #3	精细科学工具	91003-12
手术刀刀片 #10	精细科学工具	10010-00
手术刀刀片 #11	精细科学工具	10011-00
尼龙丝 Ø0.16 mm	任意