通过同源重组生成的基因敲除突变体是基因功能研究的金标准。本文介绍了用于快速构建敲除载体的 OSCAR（一步法构建农杆菌重组就绪质粒）方法。 农杆菌 随后进行介导的真菌转化。最后，介绍了一种基于PCR的真菌转化子基因敲除的验证方法。
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本文内容
摘要
摘要
精确删除目的基因，同时保持基因组其余部分不变，是确定特定基因在活体生物中功能的理想方法。本实验方案描述了一种快速、精确的基因敲除质粒构建方法——OSCAR 法。OSCAR 方法依赖于一种克隆体系，通过单次重组酶反应，将目的基因经 PCR 扩增并纯化的 5' 和 3' 侧翼序列，与两个质粒 pA-Hyg OSCAR（标记载体）和 pOSCAR（组装载体）共同连接。通过限制性酶切图谱分析并结合测序，确认敲除载体是否正确构建。随后利用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导，将构建好的敲除载体导入真菌孢子（即农杆菌介导转化，ATMT）。最后，通过 PCR 检测判断敲除载体是否通过同源或非同源重组整合至基因组，分别表明基因敲除或随机位点整合。该方法已成功应用于大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）和轮枝镰刀菌（Fusarium verticillioides）等多种真菌的多个基因敲除研究。
引言
基因解析是确定单个或多个基因功能重要性的强大方法。了解特定基因作用的标准方法是构建仅目标基因发生突变而其他基因均未改变的单基因突变体。其中最有效且潜在干扰最小的方法是在不损害任何其他基因功能的前提下，对目的基因的开放阅读框（GOI ORF）进行完全且精确的删除。
由于传统的连接方法在构建缺失质粒时需要多个步骤，因此OSCAR的设计原理1 是为了产生更快的 体外 方法 图1 展示了 OSCAR 方法中的组装过程。此处描述的方法具有以下优势：可在单个多片段反应中快速构建单个基因敲除载体，并与后续步骤相结合 根癌农杆菌 介导的转化（ATMT）。OSCAR方法非常快速，与其他策略（如在酵母中使用Gibson组装）相比具有良好的竞争力2OSCAR 方法已成功应用于多种子囊菌门真菌，这些物种包括： Fusarium verticillioides （未发表） 大丽轮枝菌3，玉米小斑病菌4，金龟子绿僵菌罗伯茨氏变种5尖孢镰刀菌萎蔫专化型6，小孢拟盘多毛孢（Pestalotiopsis microspora）7，禾生炭疽菌8，以及松针褐斑病菌9 和 Sarocladium zeae （未发表）.
本方案提供了包括引物设计、侧翼PCR扩增、OSCAR BP反应、缺失构建体结构验证及转化在内的逐步操作说明 农杆菌 构建完成后，通过农杆菌介导的转化（ATMT）将缺失构建体转入真菌细胞，最终区分出缺失突变体与外源整合缺失构建体的菌株。
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方案
1. 基因侧翼区域PCR扩增的引物设计
- 从 FungiDB 或其他基因组数据库下载目的基因（GOI）的基因组区域，包括开放阅读框（ORF）以及基因两侧各至少 2 kb 的侧翼序列，保存为文字处理文件。
- 标出拟删除的 ORF，并标注起始密码子和终止密码子。
- 在下载的序列中识别并标出相邻的其他开放阅读框（ORF）。
- 利用目的基因 ORF 的 2 kb 5' 端序列和引物设计工具（见材料列表），设计 PCR 引物对 O1 和 O2，以扩增至少 1 kb 大小的产物。设计时需注意避免影响相邻的 ORF。
- 将 2 kb 的 5' 侧翼序列粘贴至 "Sequence Entry" 窗口中，点击 "Show Custom Parameters" 选项框。输入以下自定义设计参数：引物退火温度（TM）58（最小值）、60（最佳值）、62（最大值）；引物 GC 含量 40（最小值）、50（最佳值）、60（最大值）；引物长度 22（最小值）、24（最佳值）、26（最大值）；扩增子大小 1250（最小值）、1500（最佳值）、2000（最大值）。
- 选择使反向引物（O2）最靠近 ORF 的结果。截取该引物设计图并保存截图，将引物序列复制粘贴至文字处理文档中。
- 对 3' 侧翼序列重复上述步骤，设计引物 O3 和 O4，此次选择使正向引物（O3）最靠近目标 ORF 的结果。
- 在引物 1 至 4 的 5' 端添加适当的连接位点（见 表 1）。
- 另设计并订购用于第 4 节中缺失验证的 ORF 特异性引物。引物参数应与步骤 1.4.1 相同，但扩增子大小设为 500（最小值）、750（最佳值）、1000（最大值），必要时可根据 ORF 长度进行调整。最后，为验证同源重组子，设计位于染色体侧翼区域外侧的 5' 外向和 3' 外向引物。这些 "外向" 引物将分别与 hygR (210) 和 hygF (850) 配对使用（图 2）。
- 订购引物。
2. OSCAR 构建体的制备
- 使用高保真方法 Taq 进行两个反应，分别针对5'和3'侧翼区域，使用引物（100 µM） O1 和 O2 用于第一反应，O3 和 O4 用于第二反应。反应体系包含以下组分：29.5 µL 无菌蒸馏水（SDW）、5 µL 10x LA PCR 缓冲液、8 µL 2.5 mM dNTP 混合物、5 µL 25 mM MgCl₂2，1 µL 模板（50 ng/µL），0.5 µL 高保真酶 Taq，0.5 µL 引物 O1 和 0.5 µL 引物 O2（用于 5' 侧翼区）或 0.5 µL 引物 O3 和 0.5 µL 引物 O4（用于 3' 侧翼区）。反应条件如下：94 °C 预变性 1 min，然后进行 30 个循环：94 °C 变性 30 s，60 °C 退火 30 s，72 °C 延伸 2 min，最后 72 °C 终延伸 5 min，随后在 10 °C 无限期保存。
- 使用标准小型凝胶电泳装置，在0.8%琼脂糖1×TAE（40 mM Tris乙酸盐，pH 8.3，1 mM EDTA）凝胶中进行电泳，电压约为125 Vh，以确定产物大小和相对浓度。根据制造商说明，使用非溴化乙锭染料对凝胶进行染色后处理。在紫外透射仪上观察结果。
- 如果5'和3'侧翼产物的浓度大致相当，可将两者合并，并使用亲和层析柱试剂盒（或采用聚乙二醇沉淀法：90 µL合并的PCR产物、240 µL TE缓冲液pH 7.5、160 µL 30%聚乙二醇PEG8000、30 mM MgCl₂）进行纯化。2) 按照生产商提供的方案共同纯化PCR产物。如果产物浓度不相等，将低浓度产物与高产量反应中等量的产物混合。
- 使用分光光度计测定纯化后的DNA浓度。
- 将以下组分混合进行BP反应：1 µL 60 ng/µL pOSCAR，2 µL 60 ng/µL pA-Hyg-OSCAR，1 µL 60 ng/µL组合侧翼片段，1 µL Clonase。在25 °C孵育16小时。加入0.5 µL蛋白酶K终止反应，并在37 °C孵育10分钟。
- 转化高感受态E大肠杆菌 细胞。既可使用 commercially available competent cells，也可使用自制的 DH5α CaCl₂ 法感受态细胞。2 按照制造商说明书所述，成功使用感受态细胞作为受体。在含100 µg/mL链霉素（Spec）的低钠LB培养基（0.5 g/L NaCl）上进行平板培养。
- 通过质粒小提实验鉴定正确构建体10 上述产生的菌落进行双酶切消化 HindIII 和 KpnI如下操作：取5 µL DNA，每种酶各2 U，2 µL相应的10x缓冲液，用SDW补至总体积20 µL。此步骤可将插入片段（约4.5 kb，含1.5 kb基因侧翼序列）从载体上释放出来ca.7 kb）并切割侧翼的任何位点，从而产生可预测大小的条带。
- 序列11 选择具有合适条带模式的克隆。
3. 农杆菌 根癌农杆菌 真菌的农杆菌介导转化（ATMT）
- 转化 农杆菌（Agrobacterium tumefaciens） OSCAR 缺失构建体的 AGL1 菌株12.
- 用含有目标基因OSCAR缺失质粒的AGL1转化真菌。具体操作步骤如下：
- 用无菌水制备浓度为 2 x 10 的真菌孢子悬液6 孢子/mL。使用血细胞计数板或自动细胞计数器对孢子进行定量。取500 µL该悬液置于1.5 mL微量离心管中。此体系适用于制备4块转化平板。
- 使用蓝色无菌一次性接种环，从含有 deletion plasmid 的 AGL1 菌株在 LB-Spec 100 培养基（培养基成分见材料列表）中培养 2–3 天的平板中，挑取一明显可见的菌团（约占接种环直径的 20%），加入至孢子悬浮液中，并充分混匀。涡旋振荡，直至细菌细胞均匀分散约 5 分钟中速离心。
- 将100 µL分生孢子-农杆菌悬液移液至四个含共培养培养基的6 cm培养皿中，每个培养皿中央放置的纤维素膜滤膜上12.
- 用无菌玻璃珠（约4颗）将悬液均匀涂布于膜过滤器表面。也可使用传统的涂布工具进行涂布。将膜过滤器在通风橱中干燥约10分钟，用石蜡膜包裹。重复步骤3.2.2和3.2.3，以进行多次转化实验。
- 将培养板倒置于室温下孵育2天。
- 将膜滤器转移至6 cm 曲霉属 筛选培养基12 含潮霉素B（Hyg）150 µg/mL、200 mM 头孢噻肟和100 µg/mL 氧哌嗪四唑酸的平板。在室温下培养5–7天，然后分离抗潮霉素的菌落。
- 用无菌牙签将疑似转化子转移至6 cm马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板上 含150 µg/mL Hyg、100 µg/mL卡那霉素的平板
4. 通过 PCR 鉴定缺失突变体
- 通过热裂解法从转化子中提取用于PCR的DNA13.
- 一旦转化子在步骤3.2.7的PDA培养基上形成菌落，用无菌牙签从菌落中挑取少量菌丝或酵母细胞（2 mm × 2 mm）转移至含有100 µL裂解液（50 mM 磷酸钠，pH 7.4，1 mM EDTA，5%甘油）的微量离心管中。
- 在85-90 °C下孵育混合物20-30分钟。将含有基因组DNA的粗提物于-20 °C保存，直至步骤4.2使用。
- 每个转化子进行4次PCR反应，分别用于检测5'和3'侧翼序列的同源重组、筛选标记基因（本实验中为潮霉素磷酸转移酶）以及目的基因开放阅读框（GOI ORF）。
注意：我们通常使用价格低廉的低保真度 Taq 这些反应的反应条件如所述 在上述步骤2.1中，包含SDW 20 µL、10x Taq缓冲液2.5 µL、dNTPs（10 mM）0.5 µL、自制Taq14，0.5 µL，引物A（100 µM）0.5 µL，引物B（100 µM）0.5 µL，模板0.5 µL。同样可使用较低浓度的引物储备液（10 µM）。 - 运行琼脂糖凝胶电泳（例如 PCR产物的0.8%。缺失突变体会产生Hyg条带，但不会产生ORF产物；随机整合子会同时显示两条条带；野生型则仅产生ORF条带。
- 永久保存用于后续实验的基因敲除突变体（以及一两个附加位点整合的转化子作为对照）。
注意：15% 甘油用于在 -80 °C 长期保存我们的菌株。
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结果
OSCAR 方法可在单个反应中生成包含目标基因上下游侧翼序列及选择标记盒的质粒。利用 OSCAR 构建缺失载体的效率非常高。然而，该系统也可能产生仅包含三个片段中部分片段的不完整构建体（即两个基因侧翼序列和选择标记盒）。通常情况下，大多数 E. coli 转化子均含有正确的 OSCAR 构建体。例如，图 2 展示了 Verticillium dahliae 基因 VDAG_06812 的 OSCAR 缺失构建体。在此例中，VDAG_06812 的侧翼序列不含 HindIII 或 KpnI 酶切位点，因此应释放出一个 4,247 bp 的质粒插入片段。图 3 显示了通过 HindIII-KpnI 双酶切鉴定确认了质粒结构的正确性，但泳道 5 和 11 为异常构建体。图 4 展示了通过 Southern 印迹法对两个不同基因缺失的最终验证结果。图 5 展...
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讨论
一步构建法 农杆菌-重组就绪型质粒（OSCAR）已成功应用于越来越多的子囊菌门真菌。该方法也应可轻松适用于担子菌门及其他真菌门类的物种（需使用适当的启动子驱动筛选标记基因），假设 农杆菌 介导的转化和同源重组是可行的。已开发出额外的标记载体，以增加抗真菌化合物的选择，并实现双突变体及更高阶突变体的构建。这些标记包括对G418、杀结核菌素（nourseothricin）的抗性，以及近期对除草剂草铵膦铵盐（glufosinate ammonium）和氯嘧磺隆乙酯（chlorimuron ethyl）的抗性。4.
该方法最初针对Verticillium dahliae进行优化，本文所示图像主要来源于此1。近年来，OSCAR技术已广泛应用于产霉菌毒素真菌Fusarium verticillioides的基因敲除研究。已构建超过60个敲除载体，并获得了30多个基因的敲除突变体（未发表数据）。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢以下本科生和高中生为在Fusarium verticillioiodes中构建OSCAR突变体所做出的工作：Anjellica Miller、Athar Naseer、Xiu Lin、Katelyn Woodburry、Chelsea Patterson、Kathleen Robertson、Krystina Bradley、Ashton Rogers、Alexis McKensie、Manny Hernandez、Ashli Crepsac、Jeff Delong、Christian King、Gi Jeong、Maria Belding、Christy Burre、Daniel O'Meara、Lauren (Victoria) Cook、Jake Goodman、Sampriti De、Oge Okoye、Alyssa Beckstead、Garrett Hibbs、Nick Goldstein、Caroline Twum、Chris Benson、Louis Stokes、Hannah Itell、Jane Hulse、Jasim Mohammed、James Loggins、Kelli Russell、Gre'Nisha Jones、Kristin Sheaffer、Mariam Hammady、Ava Wilson、Katrina Bazemore、Toney Harper、Karlin McGhee、Mohmed Momin、Rima Momin、Thi Ngoc Le 以及 Angel Pham。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| FungiDB | 数据库 / http://fungidb.org/fungidb/ | ||
| IDT PrimerQuest | IDT | 引物设计在线软件 / http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index | |
| Microsoft Word | 序列文件处理 | ||
| 低钠LB Spec 100培养基 | E. coli 转化子筛选，成分：1% 胰蛋白胨，0.05% NaCl，0.5% 酵母提取物，若为固体培养基则含1.5% 琼脂 | ||
| 共培养培养基 | ATMT转化诱导（参考文献12） | ||
| 含潮霉素的曲霉基本培养基 | 真菌转化子筛选 | ||
| PDA培养基 | Acumedia | 7149A | 单孢子斜面管 |
| PDA-Hyg-Kan培养基 | 真菌转化子分离，PDA培养基中含150 μg/mL 潮霉素B和100 μg/mL 卡那霉素 | ||
| 玻璃珠 | Genlantis | C400100 | 平板涂布 |
| 硝酸纤维素滤膜（47 mm） | Fisher | 09-719-555 | ATMT共培养 |
| 各种离心管 | 多种样品制备 | ||
| 培养皿（多种规格） | 细菌和真菌培养 | ||
| pA-Hyg OSCAR | Addgene | 29640 | 可筛选标记载体 |
| pOSCAR | Addgene | 29639 | 组装载体 |
| DH5α One Shot 感受态 E. coli 细胞 | Life Technologies | 12297-016 | BP反应转化 |
| ccdB抗性E. coli细胞 | Life Technologies | A10460 | pOSCAR载体的维持 |
| 木质转移棒 | 菌落划线 | ||
| 牙签 | 菌落挑取 | ||
| 微量离心机 | 细菌沉淀，etc. | ||
| 制备型离心机 | 真菌孢子收集 | ||
| 解剖显微镜 | 单孢子分离 | ||
| 自动细胞计数仪 | 孢子悬浮液浓度计算 | ||
| 复合显微镜 | 血细胞计数板细胞计数 | ||
| QIAquick PCR 纯化试剂盒 | Qiagen | 28104 | PCR基因侧翼产物纯化 |
| TaKaRa LA Taq | Takara Bio USA | RR002A | 用于OSCAR侧翼扩增的高保真taq聚合酶 |
| 潮霉素B | InvivoGen | ant-hg-5 | |
| 壮观霉素 | Sigma | 22189-32-8 | |
| 头孢噻肟 | TCI America | C2224 | |
| 卡那霉素 | 11815032 | ||
| 莫西沙坦 | Sigma-Aldrich | 43963 | |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | 琼脂糖凝胶后染色 |
| Qiagen QIAquick PCR 纯化试剂盒（货号 28104） | |||
| （OneShot_ Mach1TM T1R 或 One Shot_ OmniMAX™ 2 T1R，来自 Invitrogen） | Thermo Fisher Scientific | C862003 | |
| Gateway BP Clonase II 酶混合物 | Thermo Fisher Scientific | 11789020 | 用于在pOSCAR载体中组装缺失构建体 |
参考文献
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