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方法文章

鞭毛马达功能的生物物理表征

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DOI：

10.3791/55240

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2017年1月18日

 ,  , 
1Artie McFerrin Department of Chemical Engineering, Texas A&M University

本文内容

摘要

最近的研究表明，细菌鞭毛马达能够感知多种环境信号，并随之发生结构重塑。本文所讨论的微珠检测方法有望帮助阐明这种结构重塑在细胞适应环境应激中的作用。

摘要

鞭毛马达在细菌运动性和趋化性中的作用已被充分阐明。最近的研究发现，鞭毛马达能够响应多种环境刺激而发生重塑，并成为表面定植和感染的触发因素之一。马达重塑并促进细胞适应性的精确机制可能依赖于关键的马达特性。本文介绍的基于光电倍增管的微珠追踪技术，可实现对马达功能（包括马达转速和切换动力学的适应性变化）的精确生物物理表征。该方法具有实时追踪以及长时间探测马达行为的优势。所讨论的实验方案可轻松拓展应用于研究多种细菌物种中的鞭毛马达。

引言

鞭毛马达通过旋转螺旋状的细胞外丝状结构，使细胞能够游动。对于给定长度的鞭毛，马达所能产生的扭矩大小（即，黏性负荷）决定了其游动速度。另一方面，其旋转方向的转换能力可控制细胞对化学物质的迁移反应，这一过程称为趋化性。趋化性和运动性均为毒力因子 1-3，鞭毛马达在近年来已被充分表征 4越来越多的证据表明，该马达可作为机械传感器——能够通过机械方式检测固体基质的存在 5,6这种能力可能有助于启动表面定植和感染 5,7因此，运动结构感知表面并启动信号传导的机制具有重要意义 8,9.

通过将鞭毛固定在基质上并观察细胞旋转，可方便地研究鞭毛马达。Silverman 和 Simon 首次实现了这种固定，他们使用大肠杆菌（E. coli）的多钩突变体，并利用抗钩抗体将钩结构成功附着于玻璃基质上10。固定细胞实验使研究人员能够研究马达开关对多种化学刺激的响应。例如，Segall 及其同事借助离子电渗 pipette 对固定细胞进行化学刺激，通过观察顺时针旋转比例（CWbias，即马达顺时针旋转的时间占比）的相应变化，测定了趋化信号网络的适应动力学11,12。尽管固定细胞实验在研究开关响应方面效果显著，但其仅能在有限的黏性负载范围内提供有关马达力学特性的信息13。为克服这一问题，Ryu 及其同事将球形乳胶微珠固定在附着于表面的细胞鞭毛残端上，随后利用弱光镊结合后焦面干涉技术追踪微珠运动14。通过使用不同尺寸的微珠，研究人员得以在更宽范围的负载条件下研究马达性能。该实验方法随后由 Yuan 和 Berg 改进，他们开发了一种基于光电倍增管的微珠追踪技术，并结合激光暗场照明，实现了对极微小金纳米微珠（约 60 nm）的追踪。由于这些微珠体积极小，其外部黏性阻力低于内部旋转黏性阻力15,16，从而得以测定大肠杆菌（E. coli）中马达可达到的最大转速（约 300 Hz）。在解藻酸弧菌（V. alginolyticus）中，类似的微珠实验测得了中等黏性负载下的旋转速率（约 700 Hz）17。微珠实验使研究人员能够在整个可能的黏性负载范围（从无负载到接近失速状态）内测量马达响应，从而为理解扭矩生成机制提供了重要的生物物理工具18,19。

最近，我们改进了Yuan-Berg实验方法，引入了光镊技术，从而能够对单个马达施加精确的机械刺激6。利用该技术，我们发现驱动马达旋转的力生成器是动态的机械传感器——它们会根据黏性负载的变化而发生重构。这类负载感应可能触发细胞分化为群游细菌，但其具体机制尚不明确。其他物种的鞭毛马达也可能具有机械敏感性20，但目前尚缺乏直接证据。本文讨论了基于光电倍增管（PMT）的方法，用于追踪连接在鞭毛丝上的乳胶微球的旋转15。与超高速相机追踪相比，光电倍增管装置的优势在于能够相对简便地对单个微球进行长时间的实时追踪。该方法在研究环境刺激引起的鞭毛马达复合物长期重构过程中尤为有用21。尽管我们详细描述的实验方案专门针对E. coli，但这些方法可轻松适用于其他物种鞭毛马达的研究。

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方案

1. 细胞准备

  1. 在胰蛋白胨肉汤（TB，1% 胰蛋白胨，0.5% NaCl）中培养携带黏性 fliC 等位基因15,22的目标菌株过夜，随后以1:100的比例接种至10 mL新鲜TB培养基中。在摇床培养箱中于33 °C培养至OD600 = 0.5。
  2. 在1,500 × g离心5–7分钟收集菌体，然后将沉淀剧烈重悬于10 mL滤膜灭菌的运动缓冲液（MB；10 mM磷酸缓冲液：0.05–0.06 M NaCl，10−4 M EDTA，1 µM甲硫氨酸，pH 7.0）中。
  3. 重复步骤1.2两次，最后将菌体沉淀重悬于1 mL MB中。
  4. 将菌悬液通过聚乙烯管（7–12 cm长，内径0.58 mm）连接的21至23号针头适配器在两个注射器之间来回推注约75次进行剪切。剪切总时间应控制在30–45秒内。
  5. 将剪切后的菌液在1,500 × g离心5–7分钟，然后将沉淀重悬于100–500 µL MB中。

2. 载玻片制备

  1. 通过将两层双面胶带夹在盖玻片和载玻片之间制备成像室。对于趋化性实验，可使用任何能够交换MB和化学刺激物的微流控室。
  2. 向腔室内加入0.01%的聚-L-赖氨酸溶液，5分钟后用MB（80 - 100 µL）轻轻冲洗表面。
  3. 向腔室内加入40 µL细胞悬液，并留出足够时间使其附着于玻璃表面（7 - 8分钟）。从腔室一侧加入100 µL MB，同时从另一侧用滤纸吸液，以去除未贴壁的细胞。
  4. 向腔室内加入10 - 15 µL乳胶微球，并留出足够时间使其沉降并附着于细胞（7 - 8分钟）。如步骤2.3所述，用100 µL MB轻轻冲洗以去除未贴附的微球。实验中可使用不同粒径的微球，只要能获得良好的对比度即可。

3. 微珠追踪

  1. 将样品置于显微镜载物台上，扫描表面以寻找附着在马达上的微珠。可使用40倍相差物镜进行观察，但并非必须使用相差显微镜。也可采用明场成像，只要能保持足够的对比度，清晰区分暗背景下明亮的微珠即可。
  2. 选定微珠后，横向移动载物台，将微珠定位至预先确定的角落，如图1B所示。将所有微珠置于同一角落，以确保正确判断微珠旋转方向。理想的微珠轨迹近似为圆形，但椭圆形轨迹也可接受。
  3. 保持采样频率高于马达旋转频率的两倍，以避免混叠效应引起的误差。本研究中使用旋转频率为50 Hz的马达，并以10倍于该频率（即500 Hz）进行采样，以获得平滑的信号。

4. 数据分析

  1. 对 PMT 输出电压进行居中和缩放，并在必要时通过仿射变换校正轨迹中的椭圆率23。使用功率谱分析确定旋转速率17。
  2. 确定极角 θ(t) = atan(y(t)/x(t))。通过计算角速度 ω 角速度公式 dθ/dt，用于旋转运动分析。 来分析电机转速随时间的变化及切换行为14。
  3. 采用中值滤波器对电机转速数据进行平滑处理。建议滤波窗口覆盖两次完整旋转的时间23,24。

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结果

光电倍增管的装置如图1A所示。重要的是，光电倍增管（PMT）在目标微珠散射光的波长范围内应具有高灵敏度。此处使用的光电倍增管工作于可见光和近红外波段，能够检测由卤素光源照射微珠后产生的散射光。最佳照明条件和供电电压会因不同实验装置而异。在本研究使用的装置中，光电倍增管增益约为104 - 105时已足够。每个光电倍增管均被遮蔽，仅在管前方留有一个3 × 1 mm的狭缝。这些狭缝限制了进入光电倍增管的光来自样品池中的特定区域，且两个狭缝相互正交。当旋转的微珠处于正确位置时（图1B），随着微珠进入检测视野，进入光电倍增管的光量增加；随着其沿圆形轨迹远离视野，光量减少。光电倍增管输出的正弦电压信号频率反映微珠的旋转速度，而两个信号之间的相位差则指示旋转方向。使用示波器显示光电倍增管输出信号，可实现实时观察微珠的运动轨迹。

来自一个代表性电机的时间变化...

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讨论

为了便于进行拴系珠追踪并准确估算马达扭矩，应审阅以下信息。在使用带鞭毛的细胞进行这些测量时，剪切是一个关键步骤。剪切可将鞭毛丝缩短为仅剩微小残端，从而确保作用于马达的黏性负载主要来自微珠，并可在10%的误差范围内进行估算16。剪切还能提高获得圆形轨迹且偏心度高度集中（< 微珠直径14）的可能性。剪切不当会导致轨迹偏离，从而加剧追踪过程以及黏性阻力计算中的误差，并导致信噪比较差。使用示波器可快速剔除此类数据。由于不同物种的鞭毛丝生物力学特性可能存在差异，因此可能需要调整剪切方法，以确保目标细菌得到充分剪切。减少与剪切相关误差的一个有效方法是使用缺失编码鞭毛蛋白基因的细胞。随后可通过抗钩蛋白抗体将探针微珠直接连接至钩结构上。

找到一个适当连接的微珠可能具有挑战性。这是因为在视野中的大多数微珠要么粘附在细胞体上，要么粘附在玻璃表面。这类微珠可以很容易地调至清晰对焦。其他微珠则会明显地振动或旋转，振幅或偏心程度较大（> 1.5 - 2倍微珠直径）。这些微珠通常连接在尚未完全剪切的鞭毛丝上，或在与焦平面倾斜的平面上旋转。对这类微珠进...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢Howard Berg提供了珠追踪显微镜/光电倍增管以及德克萨斯A&M 工程实验站提供资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
聚-L-赖氨酸溶液（0.1%）Sigma-AldrichP8920http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US
聚苯乙烯微球Polysciences, Inc.7307http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US
1 mL 鲁尔滑动接头注射器Exel Int.26048http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php
Clay Adams Intramedic 23 号鲁尔短管接头贝克顿·迪金森公司427565http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp
聚乙烯管哈佛仪器公司59-8325http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html
光电倍增管滨松光子学株式会社R7400U-20光谱响应范围 300 至 920 nm，峰值波长 630 nm， 响应时间 0.78 ns 
http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html
3 × 1 mm 精密狭缝Edmund OpticsNT39-908两个狭缝以直角相互固定在光电倍增管上
示波器泰克公司TBS 1032B可接受其他品牌。数字示波器，TBS 1000B 系列，2 个模拟通道，30 MHz，500 MSPS，2.5 kpts 
http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope
八极低通/高通滤波器Krohn-Hite3384可接受其他品牌。建议频率范围为 0.1 Hz 至 200 kHz。   
http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf
Optiphot 显微镜尼康公司NA可使用任何正置或倒置相差显微镜。
https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754
50:50（反射:透射）立方体分光棱镜ThorLabsBS013

参考文献

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