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用于组织工程与疾病研究的儿童人食管上皮细胞的条件性重编程

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DOI：

10.3791/55243

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2017年3月22日

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, UConn Health, 2Department of Gastroenterology, Connecticut Children's Medical Center, 3Department of Surgery, Connecticut Children's Medical Center

本文内容

摘要

利用条件重编程技术扩增人儿童食管上皮细胞，可为研究人员提供患者特异性的细胞群体，这些细胞可用于构建食管组织，以进行自体移植来治疗食管缺损或损伤，同时可作为治疗性筛选实验的细胞库。

摘要

在培养中鉴定并扩增患者特异性细胞，用于组织工程和疾病研究，可能极具挑战性。利用各种类型的干细胞来获得目标细胞类型，通常成本高昂、耗时且效率极低。此外，在使用此类细胞来源前，必须去除不需要的细胞类型，这又增加了额外的操作步骤。为了获得足够数量的食管上皮细胞，以构建食管腔结构或筛选治疗食管疾病的方法，必须在不改变其基因表达或表型的前提下扩增天然食管上皮细胞。食管上皮组织的条件重编程技术为扩增患者特异性食管上皮细胞提供了一种有前景的方法。更重要的是，这些细胞无需进行分选或纯化，并且在脱离条件重编程培养环境后可恢复为成熟的上皮状态。该技术已在多项癌症筛查研究中被描述，能够实现这些细胞在多次传代过程中的无限扩增。开展食管筛查检测的能力，将有助于通过识别引发患者症状的触发机制，彻底改变嗜酸性粒细胞性食管炎等儿童食管疾病的治疗方式。对于患有先天性缺陷、食管疾病或损伤的患者，这种细胞来源可作为种子细胞用于接种合成支架，进而植入体内以修复或替代受损区域。

引言

食管组织工程与嗜酸性粒细胞性食管炎（EoE）在过去十年中成为众多实验室的研究重点。先天性缺陷（如食管闭锁）约每4,000例活产婴儿中即出现1例，导致食管发育不全，进而造成进食困难1自1993年该疾病被确认以来，嗜酸性食管炎的发病率和患病率持续上升。嗜酸性食管炎的发病率介于每万人年0.7至10例之间，患病率范围为每十万人中0.2至43例。2治疗长段型食管闭锁的一种新型且具有吸引力的外科方法是利用患者自体细胞制备可用于植入的组织工程构建物。这些细胞与合成支架材料结合后，可形成无需免疫抑制的自体组织构建物。已有研究团队开始探索利用类干细胞进行食管组织工程。 3 以及利用天然食管上皮细胞重建黏膜4-7儿科患者食管中存在的疾病通常难以在不进行干预的情况下诊断或研究。此外，利用动物模型或 体外 用于儿童疾病（如嗜酸性食管炎）的永生化细胞系模型无法完全涵盖确切的疾病发病机制及患者个体差异8因此，研究患者疾病进程的能力 体外 为了鉴定特异性致病抗原、评估潜在机制并研究药物治疗方案，将具有创新性，并为临床医生提供有助于患者治疗的信息。

已有多种自体或患者特异性细胞类型被提出用于组织工程及人类疾病发病机制的研究。然而，其中一些细胞类型在产生足量特定表型细胞方面存在局限性，难以满足大型支架接种或高通量实验的需求 体外 研究。尽管多能或多能干细胞的使用一直是大量研究讨论的主题，但其应用的局限性和不足之处已有充分描述9人类胚胎干细胞的使用存在广泛争议，并引发诸多伦理问题。最重要的是，如果这些细胞在植入活体宿主前未从其多能状态分化，则会形成类似于肿瘤的畸胎瘤10此外，使用胚胎干细胞不具有患者特异性，可能引发同种异体免疫反应，因而需要进行免疫抑制。10诱导性多能干细胞（iPSCs）是一类具有多能性的细胞，可来源于患者自身的体细胞。通过多种整合性与非整合性技术，可将皮肤细胞等体细胞重编程为多能状态。这些细胞随后可作为患者特异性的细胞来源，用于组织工程或疾病机制研究。将外源性遗传物质整合到细胞基因组中是目前备受关注的问题；即使外源序列被完全清除，iPSCs似乎仍会保留一种表观遗传记忆 "记忆" 向其来源的细胞类型11这些细胞也会形成畸胎瘤 体内 若未在移植前进行分化11已研究了多种分化方案，重点关注上皮细胞谱系12,13,14然而，必须注意的是，分化结束后获得的细胞类型并非均一，仅含有目标细胞类型的少量成分。这导致产量较低，需要进一步纯化以获得目标细胞类型。尽管诱导多能干细胞（iPSCs）是一种具有潜力的患者特异性细胞来源，但获取用于组织工程或疾病研究的目标细胞类型的过程效率极低。

人体上皮细胞已成功从人体多种病变及非病变组织中分离获得，包括：肺15乳腺16小肠17结肠18，膀胱19 和食管20需要注意的是，人类原代细胞维持表型的传代次数是有限的21,22遗憾的是，这意味着可能无法获得足够的细胞数量用于疾病研究，或用于接种工程化支架以进行移植。因此，需要开发新技术，在扩增患者细胞的同时仍能维持其上皮表型。2012年，Liu等人报道了一种利用滋养层细胞和ROCK抑制剂对正常及癌变上皮细胞进行条件重编程的方法。 等23该技术利用经照射的饲养细胞、ROCK抑制剂和条件重编程培养基，扩增从前列腺癌和乳腺癌活检组织中获得的癌性上皮细胞，旨在生成足够数量的细胞用于后续研究 体外 药物筛选等检测。该技术能够无限扩增上皮细胞 "重编程" 将这些细胞重编程至一种类似干细胞或祖细胞的状态，该状态具有高度增殖性。已有研究表明，这些细胞不具有致瘤性，也无法形成畸胎瘤。23,24此外，采用该技术对细胞进行体外传代后，未发现染色体异常或基因操作痕迹。23,24最重要的是，这些细胞仅能分化为目标原代细胞类型。因此，该技术无需细胞永生化，即可为疾病研究或组织工程提供大量患者特异性的上皮细胞资源。

获取特定器官的上皮组织以研究疾病过程常因患者风险而受限，且并非总能实现。对于患有食管疾病或缺陷的患者，内镜活检取材是一种微创获取上皮组织的方法，所获组织可经解离并进行条件重编程，从而获得源自该患者食管黏膜、可无限扩增的细胞来源。这使得 体外 对上皮细胞的研究可用于评估疾病进程并筛选潜在的治疗方法。其中，嗜酸性食管炎是一种可显著受益于该方法的疾病，该病已被描述为一种食管的过敏性疾病8过敏试验以及治疗方案均可进行评估 体外 利用患者自身的上皮细胞，这些数据可传递给主治医师，以制定个体化的治疗方案。条件重编程技术结合儿科患者的内镜活检，能够实现任意患者正常食管上皮细胞的无限扩增。因此，该细胞来源可与天然或合成支架材料联合使用，为缺损、疾病或创伤提供个体化的外科治疗选择。细胞数量的无限性将有助于构建食管组织工程结构，其管腔可被食管上皮细胞完全重接种，从而促进其他残余细胞类型的再生。

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方案

在获得患儿父母/监护人的知情同意，并经机构审查委员会批准（IRB#13-094）后，采集食管活检组织。

1. 灭菌器械和明胶溶液

  1. 在处理组织前，将镊子、剃刀刀片和剪刀进行高压灭菌，以防止污染。
  2. 配制 200 mL 0.1% 明胶溶液时，将 200 mL 蒸馏水与 0.2 g 明胶混合。高压灭菌后冷却备用。

2. 包被组织培养板

  1. 在细胞分离前约 2 小时，加入足量的 0.1% 明胶以覆盖组织培养皿（100 mm），并在细胞培养箱中于 37 °C 下孵育。
    注意：这些培养皿也可提前制备，并在使用前存放于培养箱中。

3. 制备用于解离的酶溶液

  1. 在细胞分离前约 30 分钟，根据瓶签上标注的单位每毫克浓度，在天平上称取 10 单位的中性蛋白酶（dispase）。将粉末放入含有 10 mL 改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM）的 15 mL 圆锥形离心管中，并置于 37 °C 水浴中。

4. 配制细胞培养基

  1. 配制 50 mL 条件重编程培养基时，将以下成分混合至无菌锥形管中：35 mL F12（Ham's 培养基）、11.5 mL DMEM、0.5 mL L-谷氨酰胺、0.5 mL 100× 青霉素/链霉素、2.5 mL 胎牛血清（FBS）、250 μg 人胰岛素、500 ng 人表皮生长因子（EGF）。
  2. 配制 500 mL 3T3 培养基时，将 50 mL FBS、5 mL 100× 青霉素/链霉素和 5 mL L-谷氨酰胺加入 500 mL DMEM 中混合。
  3. 配制 500 mL 无血清角质形成细胞培养基时，解冻随培养基提供的表皮生长因子（EGF）和牛垂体提取物（BPE）添加剂，将这些添加剂加入 500 mL 基础培养基瓶中，并加入 5 mL 100× 青霉素/链霉素。

5. 作为饲养层来源的3T3细胞的培养与照射

  1. 配制3T3培养基，包含DMEM、10% FBS、1×青霉素/链霉素和2 mM L-谷氨酰胺。
  2. 在患者样本到达前至少3天，于组织培养处理过的T-75培养瓶中培养3T3细胞。
    1. 在患者样本到达前，用每瓶5 mL的0.25%胰蛋白酶-EDTA对3T3细胞进行消化，并于37 °C孵育5分钟，或直至大多数细胞呈悬浮状态
  3. 加入5 mL 3T3培养基以终止反应。吸出细胞悬液并转移至15 mL锥形管中。在300 x g下离心5分钟。
  4. 吸弃培养基，并将细胞重悬于一定体积的台盼蓝溶液中用于细胞计数。取10 µL细胞与10 µL台盼蓝混合，以排除死细胞。取10 µL该混合液加入血细胞计数板进行细胞计数。
    注意：本实验方案中，经照射的3T3细胞的接种密度为每平方厘米10,900个细胞2，相当于每100 mm培养皿600,000个细胞。
  5. 根据每位患者的样本，分装足够接种一个100 mm培养皿的细胞数量，重悬于50 mL离心管中的25 mL 3T3培养基中，并以3000 rads剂量进行照射。
  6. 照射后，以300 × g离心5分钟沉淀细胞，并用条件重编程培养基重悬，每100 mm培养皿加入5 mL。
  7. 将试管放置一旁，待后续实验步骤中进行患者细胞的接种时再使用（参见步骤 7.6）。

6. 儿科食管活检样本的获取、保存与转运

  1. 将 5 mL 含 100 µg/mL  primocin 的完全型无血清角质形成细胞培养基加入 15 mL 圆锥形离心管中，并置于冰上运送至医疗机构。
    注意：这些含培养基的离心管可在 4 °C 下保存长达 2 个月。
  2. 在内镜检查时获取约 8 块食管活检组织，并按以下方式分装：
    1. 将六块活检组织放入含有含 100 µg/mL primocin 的完全型无血清角质形成细胞培养基的 15 mL 圆锥形离心管中，并置于湿冰上。
    2. 将一块活检组织放入 5 mL 缓冲福尔马林溶液中，并置于湿冰上。
    3. 将一块活检组织放入含有最佳切割温度包埋剂的小型活检冷冻模具中。
      1. 立即将该模具浸入盛有异戊烷并置于液氮中的烧杯中。待其完全冻结后，将冷冻模具放入标本袋中，并在聚苯乙烯泡沫容器中用干冰保存。
  3. 将含有活检组织的培养基或福尔马林的离心管放入可密封的袋子中，再放入装有湿冰的运输箱内。用生物危害标签密封并标记箱子，然后将其运送至实验室。
    注意：装有干冰和冷冻活检组织的容器也需密封，并贴上生物危害标签。

7. 患者组织的处理以用于后续培养和分析

  1. 到达实验室后，将置于干冰上的冷冻活检样本转移至 -80 °C 超低温冰箱，用于后续切片或 RNA 提取。将样本放入福尔马林中，置于 4 °C 冰箱内保存，并固定过夜。
  2. 以 300 × g 离心剩余活检组织，吸除上清液。向锥形管中加入 10 mL 分散酶溶液，密封后于 37 °C 水浴中孵育 15 分钟。
  3. 孵育结束后，以 300 × g 离心活检组织，吸除上清液，并将组织重悬于 5 mL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液中。
  4. 将含有活检组织的 5 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液转移至一个 100 mm 无菌培养皿中，使用两把灭菌剃刀尽可能将组织切碎。
  5. 将含有切碎组织的 5 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液转移至新的 15 mL 锥形管中。用额外的 5 mL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液冲洗培养皿两次，并将冲洗液一并加入锥形管中。将锥形管置于 37 °C 水浴中孵育 10 分钟。
  6. 孵育结束后，以 300 × g（1.4 RPM）离心 5 分钟，吸除上清液。向锥形管中加入 5 mL 条件重编程培养基，以及含有经辐照饲养细胞的 5 mL 条件重编程培养基（见步骤 5.7）。
  7. 向 10 mL 细胞悬液中加入 ROCK 抑制剂（1 μL/mL），并在吸除组织培养皿中的明胶后进行接种。于 37 °C 孵育。

8. 细胞的培养与扩增

  1. 培养约5天后，吸除含有组织碎块的初始培养基，用5 mL无菌PBS冲洗培养皿2-3次。向培养皿中加入含10 μM ROCK抑制剂的新鲜培养基。
  2. 当细胞融合度达到70%时进行传代扩增。向培养皿中加入5 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA，于37 °C培养箱中孵育不超过2.5分钟，以去除饲养层细胞。孵育结束后，吸除胰蛋白酶-EDTA溶液，并用5 mL PBS冲洗培养皿。
  3. 吸除PBS，向培养皿中加入5 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA，孵育5-10分钟，或直至细胞从培养皿表面脱落。加入等体积的培养基以终止反应，将全部液体转移至50 mL锥形离心管中，在300 × g条件下离心5分钟。
  4. 用确定体积的条件重编程培养基重悬细胞，取10 μL细胞悬液与10 μL台盼蓝混合，使用血细胞计数板计数，确定总细胞数量。
  5. 为扩增细胞，将100万个人类食管细胞与120万经辐照处理的3T3细胞混合，总体积为15 mL，接种至150 mm培养皿中。加入新鲜的10 μM ROCK抑制剂，并将细胞悬液接种至明胶包被的150 mm培养皿中。

9. 冻存和储存人食管上皮细胞

  1. 配制冻存液时，向条件重编程培养基中加入10% DMSO。消化并计数细胞后，将细胞分装至新的50 mL离心管中，在300 × g条件下离心5分钟。
  2. 吸除上清液，按每支冻存管2 mL的量加入冻存液。待细胞悬液混匀后，将106个细胞分装至预先标记好的冻存管中。将冻存管置于-80 °C冻存容器中至少24小时，之后转移至液氮中长期保存。

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结果

从患者活检组织中分离食管上皮细胞的关键步骤总结见图1。上皮细胞集落约在4-5天内形成，并由成纤维细胞饲养层细胞包围（图2A）。随着集落的扩展，它们将相互融合形成更大的集落（图2B）。当培养物达到约70%融合度时，需进行扩增（图2C）。为确保在去除上皮细胞前将成纤维细胞从培养皿中清除，可使用0.05%胰蛋白酶-EDTA处理最多2.5分钟以去除饲养层细胞。去除饲养层后的状态应与图2D相似。随后，贴壁的上皮细胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，并重新接种至新的经辐照处理的饲养层细胞上（图2E）。

通过qRT-PCR对这些细胞进行表型表征，结果显示在第1代末期，祖细胞标志物P63表达上调，同时与初始活检样本相比，E-钙黏蛋白和TJP1的表达得以维持。这表明细...

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讨论

从患者活检组织中分离和扩增食管上皮细胞最重要的步骤包括：1）充分解离活检组织，同时尽量减少细胞死亡；2）每次更换培养基时均需在细胞培养基中添加ROCK抑制剂；3） feeder细胞的使用量不得超过推荐数量；4）保持无菌的洁净培养环境；5）在细胞接近融合前及时传代。

由于不同患者的活检样本在条件重编程过程中存在个体差异，因此在生长动力学、表型以及多代传代扩增能力方面出现差异是合理的。通常，从每位患者获取4个食管活检样本用于细胞分离。解离后，第0天可获得约300,000–600,000个细胞。平均到第3代时，细胞数量可扩增至1,000万以上。形成的克隆形态应类似于上皮细胞系所描述的铺路石样形态25（图2）。培养中的细胞样本应通过qRT-PCR、流式细胞术和免疫荧光检测上皮标志物，以确认扩增的细胞群体确为上皮来源（图3）。若细胞不表达上皮标志物（E-钙黏蛋白、EpCAM、TJP1），则应终止并丢弃该细胞系。若细胞确为上皮来源，则其中超过90%的细胞应为EpCAM阳性。为评估...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

我们感谢康涅狄格儿童医疗中心战略研究基金对本工作的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
PrimocinInVivogenant-pm2
异戊烷Sigma Aldrich277258-1L
猪皮明胶Sigma AldrichG1890-100G
DMEMThermofisher Scientific11965092
冷冻模具TissueTek4565
冷冻基质OCTThermofisher Scientific6769006
15 mL 锥形管Denville ScientificC1017-p
完全型角质形成细胞无血清培养基Thermofisher Scientific10724011
青霉素-链霉素Thermofisher Scientific15140122
GlutamaxThermofisher Scientific35050061
胰岛素溶液Sigma AldrichI9278-5ml
人表皮生长因子（EGF）PeprotechAF-100-15
ROCK抑制剂（Y-27632）Fisher Scientific125410
F-12 培养基 Thermofisher Scientific11765054
胎牛血清Denville ScientificFB5001
DispaseThermofisher Scientific17105041
0.05% 胰蛋白酶-EDTAThermofisher Scientific25300062
0.25% 胰蛋白酶-EDTAThermofisher Scientific25200072
100 mm 培养皿Denville ScientificT1110-20
150 mm 培养皿Denville ScientificT1115
50 mL 锥形管Denville Scientific  C1062-9 
磷酸盐缓冲液片剂Fisher ScientificBP2944-100
5 mL 移液管Fisher Scientific1367811D
10 mL 移液管Fisher Scientific1367811E
25 mL 移液管Fisher Scientific1367811
9" 巴氏移液管Fisher Scientific13-678-20D
NIH 3T3 细胞ATCCCRL1658

参考文献

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