小儿食管上皮细胞重编程的条件在组织工程和疾病使用调查

摘要

利用条件重新编程人类小儿食管上皮细胞的扩张提供了可用于工程食管构造为自体移植来治疗缺损或损伤，并作为治疗性筛选测定的储存器单元的特定病人群调查。

摘要

鉴定和扩增培养物中的患者特异性细胞以用于组织工程和疾病研究可能非常具有挑战性。利用各种类型的干细胞来获得感兴趣的细胞类型通常成本高昂、耗时且效率极低。此外，在使用该细胞源之前，必须去除不需要的细胞类型，这需要该过程的另一个步骤。为了获得足够的食管上皮细胞来设计食管结构的管腔或筛选治疗食管疾病的治疗方法，必须在不改变其基因表达或表型的情况下扩增天然食管上皮细胞。食管上皮组织的条件性重编程为扩增患者特异性食管上皮细胞提供了一种很有前途的方法。此外，这些细胞不需要分选或纯化，从条件重编程培养物中去除后会恢复到成熟的上皮状态。该技术已在许多癌症筛查研究中进行了描述，并允许这些细胞在多次传代中无限扩增。进行食管筛查分析的能力将通过确定导致患者症状的触发机制，帮助彻底改变嗜酸性粒细胞性食管炎等小儿食管疾病的治疗。对于那些患有先天性缺陷、疾病或食道损伤的患者，这种细胞来源可以用作一种手段，为植入植入提供合成构建体，以修复或替换受影响的区域。

引言

食管癌组织工程和嗜酸性粒细胞性食管炎（EOE）一直是研究在许多实验室在过去十年中的焦点。先天性缺陷，如食管闭锁，被认为在约1 4,000活产，这导致在食道导致无力的发育不完全吃^1。 EOE的发病率和患病率一直在自从疾病实体于1993年鉴定EOE的发病率从0.7变化到每人10年/ 10万和患病率0.2范围到43/10万²的崛起。一种新的有吸引力的手术方法来治疗长差距食管闭锁在于生成的组织构建了利用患者自身的细胞植入。这些细胞在用合成脚手架结合将产生自体构造，不需要免疫抑制。一些团体已经开始调查美国食管组织工程³以及使用本地食管上皮细胞的干细胞样细胞电子重新填充粘膜^{4 - 7。}疾病存在于儿童患者食道往往难以诊断或不干预研究。此外，利用动物模型或体外永生化细胞系模型的儿科疾病，如EOE不包括确切的发病机制或患者的具体差异^8。因此，为了研究患者的疾病过程在体外的能力，以确定特定疾病触发抗原，评估潜在的机制和调查药物治疗将是新颖的和提供可在患者的治疗辅助信息临床医生。

已经有已被建议用于Tissu酒店使用许多自体或患者特定的细胞类型机电工程和研究....

方案

后从儿科患者的家长/监护人，并根据机构审查委员会（IRB＃13-094）获得知情同意，获得食管活检。

1.消毒仪器和明胶溶液

1. 高压灭菌镊子，刀片和前处理组织，以防止污染剪刀。
2. 使200毫升的0.1％明胶溶液，结合的蒸馏水200毫升含有0.2 1g明胶。高压灭菌并冷却后才能使用。

2.镀层组织培养板

1. 前细胞分离约2小时，添加足够的0.1％明胶覆盖组织培养皿（100毫米），并在细胞培养培养箱中于37℃孵育。
   注意:这些板也可以由提前时间和在使用前保持在培养箱中。

3.使酶液解离

1. 大约前细胞分离30分钟，掂量出基于每毫克浓度的单位上的小瓶的平衡分散酶的10个单位。放置在一个15毫升锥形管的粉末与10的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中的溶液，并发生在37℃水浴中。

4.进行细胞培养基

1. 让50毫升的条件重新编程培养基中，将以下成分混合入无菌锥形管:35毫升F12的（咸的培养基），11.5毫升的DMEM，0.5毫升L-谷氨酰胺，0.5毫升100×青霉素/链霉素，2.5毫升的胎牛血清（FBS），人胰岛素的250微克，500纳克人表皮生长因子（EGF）的。
2. 让500毫升3T3培养基中，混....

结果

在分离来自患者活检食管上皮细胞中的关键步骤的简要总结于图1。上皮细胞的集落将形成在约4-5天，将由成纤维细胞饲养细胞（ 图2A）所包围。作为这些菌落扩大他们将与其他的菌落合并，以形成较大的集落（ 图2B）。一旦培养物都成为70％汇合时，它们需要被膨胀（ 图2C）。以确保成纤维细胞从板中除去上皮细胞之前除去，0.05％胰蛋白酶-EDTA用于高达2.5分钟以去除馈线。缺乏馈线应类似于图 2D。粘附上皮细胞，然后用0.25％胰蛋白酶-EDTA胰蛋白酶消化并重新接种在新的辐照饲养细胞（ 图2E）。

图3A ）。这些细胞也分析在流路1用于通过流式细胞仪上皮标记和大于90％存在从三个患者细胞呈阳性的EpCAM（ 图3B）。.......

讨论

为了从患者的活检隔离和扩大食管上皮细胞的最重要的步骤是:1）充分游离活检组织以最小的细胞死亡; 2）确保ROCK抑制剂加入到在每次更换培养基的细胞培养基; 3）不要使用更多的饲养层细胞比建议; 4）保持干净无菌文化; 5）传代细胞之前，为了达到汇合。

由于为条件重新编程得到的活检样品中的患者相关的差异，这是合理的预期生长动力学，表型和扩展到多个通道的能力的差异。通常情况下，4食管活检从每个患者为细胞分离得到的。一旦分离，我们净赚在第0天约300,000-600,000细胞这平均由第3代扩展到超过10万个细胞。形成应该类似于上皮细胞系中描述的鹅卵石形态菌落形态 25（ 图2）。培养中的细胞的样品应通过定量RT-PCR进行分析，流式细胞术和免疫荧光对上皮标记，以确保扩大种群确实上皮在原点（ 图3）。应在细胞中不表达上皮标记（E-钙粘蛋白，EpCAM的，TJP1），该细胞系应终止并丢弃。据预计，大于90％的存在的细胞是EpCAM的正面的，如果它们在原点上皮。为了如果文化正在改变的表型.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Primocin	InVivogen	ant-pm2
异戊烷	Sigma Aldrich	277258-1L
猪皮明胶	Sigma Aldrich	G1890-100G
DMEM	Thermofisher Scientific	11965092
Cryomold	TissueTek	4565
Cryomatrix OCT	Thermofisher Scientific
15 mL 锥形管	Denville Scientific	C1017-p
完全角质形成细胞无血清培养基	Thermofisher Scientific	10724011
青霉素 链霉素	Thermofisher Scientific	15140122
Glutamax	Thermofisher Scientific	35050061
胰岛素溶液	Sigma Aldrich	I9278-5ml
人表皮生长因子 （EGF）	Peprotech	AF-100-15
ROCK 抑制剂 （Y-27632）	Fisher Scientific	125410
F-12 培养基	Thermofisher Scientific	11765054
牛血清	Denville Scientific	FB5001
分散酶	Thermofisher Scientific	17105041
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	Thermofisher Scientific	25300062
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Thermofisher Scientific	25200072
100 mm 培养皿	DenvilleScientific	T1110-20
150 mm 培养皿	Denville Scientific	T1115
50 mL 锥形	Denville Scientific	C1062-9
磷酸盐缓冲盐水片	Fisher Scientific	BP2944-100
5 mL 移液器	Fisher Scientific	1367811D
10 mL 移液器	Fisher Scientific	1367811E
25 mL 移液器	Fisher Scientific	1367811
9" 巴斯德移液器	Fisher Scientific	13-678-20D
NIH 3T3 细胞	ATCC	CRL1658