通过差速离心法从骨骼肌中分离完整线粒体用于高分辨率呼吸测定

摘要

在此实验中，从一只麻醉的猪体内取出股四头肌组织样本，并通过差速离心法分离线粒体。随后，采用高分辨率呼吸测定法测定线粒体呼吸链复合物I、II和IV的呼吸速率。

摘要

线粒体参与细胞能量代谢，利用氧气产生以三磷酸腺苷（ATP）形式存在的能量。通常采用低速和高速差速离心法从组织和培养细胞中分离线粒体。通过差速离心获得的粗制线粒体组分可用于呼吸测定实验。差速离心技术基于细胞器的大小及其沉降速度的差异进行分离。线粒体的分离需在组织获取后立即进行。将组织浸入冰浴的匀浆介质中，用剪刀剪碎后，在玻璃匀浆器中使用松配合的研杵进行匀浆。差速离心法高效、快速且成本低廉，所获得的线粒体纯度足以满足呼吸测定实验的要求。然而，基于差速离心法获得的分离线粒体也存在一些局限性和缺点，例如线粒体在匀浆和分离过程中可能受到损伤，且需要较大量的组织活检样本或培养细胞用于线粒体分离。

引言

线粒体生物能量学和呼吸能力不仅可以在透化的细胞或肌纤维中进行研究，也可以在分离的线粒体中进行。在本研究中，我们描述了一种通过差速离心法分离完整骨骼肌线粒体的方案，用于高分辨率呼吸测定测量。

为了分离完整的线粒体用于呼吸测定，需将组织进行匀浆，并通过传统的差速离心法分离线粒体。差速离心法基于对组织匀浆液进行一系列逐步增加离心速度的连续离心步骤，该方法由Pallade及其同事在近70年前首次提出¹。首先使用剪刀将组织剪碎，然后在玻璃匀浆器中用松配合的研杵进行机械匀浆。随后将匀浆液在低速下离心，弃去含有未破碎组织、细胞碎片和细胞核的沉淀。接着将上清液在高速下多次离心，收集富含线粒体的组分。差速离心法分离线粒体的优点包括：i）该方法快速，可在1–1.5小时内完成线粒体分离（呼吸实验应尽快进行）；ii）成本低廉；iii）效率高，所获得的线粒体纯度足以满足呼吸测定实验的要求。差速离心法的缺点包括：i）线粒体在匀浆过程中可能受损并发生解偶联；ii）线粒体可能被其他细胞组分污染（可通过额外的离心洗涤步骤进一步清洗线粒体沉淀来解决）；iii）可能选择性地丢失某些线粒体亚群，例如，在差速离心过程中，密度较低的线粒体可能被排除⁷；iv）线粒体原有的细胞微环境缺失，因此只能测定理论上的最大呼吸速率。另一种用于呼吸测定实验的线粒体分离方法是密度梯度离心法^....

方案

从麻醉后的猪体内取股四头肌活检组织，通过差速离心法分离线粒体。该猪随后用于其他实验。本研究严格遵循美国国立卫生研究院关于实验动物护理和使用的指南，并已获得瑞士伯尔尼州动物护理委员会的批准。

1. 骨骼肌匀浆及线粒体分离

1. 从麻醉的猪体内切除 5-10 g 股四头肌组织样本。本实验采用猪骨骼肌。本方案也可用于从其他物种分离线粒体（例如大鼠，小鼠，人 等等.).
   注意：此步骤由具有外科手术专长的医学专家执行。
   1. 使用肌肉注射氯胺酮（20 mg/kg）和赛拉嗪（2 mg/kg）对猪进行镇静，随后通过静脉注射咪达唑仑（0.5 mg/kg，加用阿托品 0.02 mg/kg）诱导麻醉。术中通过持续静脉输注异丙酚（4–8 mg/kg 每小时）和芬太尼（30 µg/kg 每小时）维持麻醉。
2. 立即将组织样本浸入含有20 mL冰预冷的线粒体分离缓冲液的烧杯中（表1).
   注意：匀浆和离心过程中使用的缓冲液应为冰上预冷，具有生理相关的pH值，并且离子强度和渗透压需与细胞质相容。
3. 在分析天平上称量烧杯中的组织样品。将装有20 mL分离缓冲液的烧杯置于天平上归零。
4. 将烧杯置于装有冰的冰桶中。
   注意：匀浆步骤中的所有后续操作均需在冰....

结果

复合物 I 依赖性呼吸作用

采用高分辨率呼吸测定法测定分离线粒体复合物I依赖性呼吸速率（状态2、3和4）（图1，代表性示意图）。依次加入线粒体复合物I底物谷氨酸和苹果酸，随后加入ADP。状态2指仅存在底物时的耗氧量；状态3指在底物和ADP同时存在时的耗氧量；状态4指ADP耗尽后的耗氧量。呼吸控制比（RCR）是反映耗氧与ATP生成耦合程度的指标，计算为状态3与状态4呼吸速率的比值。如图1所示，加入ADP后，线粒体呼吸速率迅速上升（状态3呼吸），随后下降（状态4呼吸），降至与状态2相近的水平。这表明RCR较高，提示线粒体在分离过程中结构完整性保持良好。图2为低状态3呼吸速率和低RCR、同时伴有高状态4呼吸速率的代表性图示，提示线粒体分离操作不当或失败。状态4呼吸速率过高是线粒体质子渗漏的标志

讨论

本研究中，我们描述了一种通过差速离心法分离高质量、完整且紧密偶联的骨骼肌线粒体的实验方案，可用于高分辨率呼吸测定等功能研究。

为了分离完整且紧密偶联的线粒体，本方案中有一些关键点需要考虑。在收获骨骼组织后，应立即将其浸入预冷的线粒体分离缓冲液中。所有离心步骤均需在 4 °C 下进行，且在分离过程中线粒体悬液必须始终置于冰上。分离操作应尽快完成。匀浆液应使用洁净且无去污剂的离心管进行离心。在操作结束时，线粒体悬液应保持浓缩状态，并仅在呼吸测定前进行稀释。由于呼吸测定数据以每秒每毫克线粒体蛋白的皮摩尔（pmol）表示，因此在分离后采用可靠的检测方法准确测定线粒体蛋白浓度至关重要。

在某些线粒体分离实验中，可能会出现线粒体解偶联或无法利用高分辨率呼吸测定法正常消耗氧气的情况。为解决这些问题，应始终使用带有松配合研杵的匀浆器以相同方式（相同的研磨次数）进行组织匀浆（步骤1.12）。在此，我们始终使用自动匀浆器对骨骼肌组织进行10次冲程的匀浆处理。过多的冲程次数可能会损伤线粒体并导致其解偶联。使用玻璃匀浆器手动（且主观）匀浆的组织样本可.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ADP	Sigma	A 4386	化学试剂
抗霉素A	Sigma	A 8674	化学试剂，溶于乙醇
抗坏血酸	Merck	1.00127	化学试剂
ATP	Sigma	A 7699	化学试剂
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	A 6003	化学试剂
EGTA	fluka	3779	化学试剂
谷氨酸	Sigma	G 1626	化学试剂
Hepes	Sigma	H 7523	化学试剂
KCl	Merck	1.04936	化学试剂
KH2PO4	Merck	1.04873	化学试剂
乳酸钾	Sigma	L 2398	化学试剂
MgCl2	Sigma	M 9272	化学试剂
3-吗啉丙磺酸（MOPS）	Merck	1.06129	化学试剂
O2k-Core：Oxygraph-2k	Oroboros Instruments	10000-02	高分辨率呼吸测定仪
细菌蛋白酶	Sigma	P 8038	化学试剂
叠氮化钠	Sigma	S2002	化学试剂
鱼藤酮	Sigma	R 8875	化学试剂，溶于乙醇
琥珀酸	Sigma	S 2378	化学试剂
Schuett homogen-plus 半自动匀浆器	schuett-biotec GmbH	3.201 011	组织匀浆器
牛磺酸	Sigma	T 8691	化学试剂
TMPD	Sigma	T 3134	化学试剂