在此实验中，从一只麻醉的猪体内取出股四头肌组织样本，并通过差速离心法分离线粒体。随后，采用高分辨率呼吸测定法测定线粒体呼吸链复合物I、II和IV的呼吸速率。
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摘要
摘要
线粒体参与细胞能量代谢，利用氧气产生以三磷酸腺苷（ATP）形式存在的能量。通常采用低速和高速差速离心法从组织和培养细胞中分离线粒体。通过差速离心获得的粗制线粒体组分可用于呼吸测定实验。差速离心技术基于细胞器的大小及其沉降速度的差异进行分离。线粒体的分离需在组织获取后立即进行。将组织浸入冰浴的匀浆介质中，用剪刀剪碎后，在玻璃匀浆器中使用松配合的研杵进行匀浆。差速离心法高效、快速且成本低廉，所获得的线粒体纯度足以满足呼吸测定实验的要求。然而，基于差速离心法获得的分离线粒体也存在一些局限性和缺点，例如线粒体在匀浆和分离过程中可能受到损伤，且需要较大量的组织活检样本或培养细胞用于线粒体分离。
引言
线粒体生物能量学和呼吸能力不仅可以在透化的细胞或肌纤维中进行研究，也可以在分离的线粒体中进行。在本研究中，我们描述了一种通过差速离心法分离完整骨骼肌线粒体的方案，用于高分辨率呼吸测定测量。
为了分离完整的线粒体用于呼吸测定，需将组织进行匀浆，并通过传统的差速离心法分离线粒体。差速离心法基于对组织匀浆液进行一系列逐步增加离心速度的连续离心步骤，该方法由Pallade及其同事在近70年前首次提出1。首先使用剪刀将组织剪碎，然后在玻璃匀浆器中用松配合的研杵进行机械匀浆。随后将匀浆液在低速下离心，弃去含有未破碎组织、细胞碎片和细胞核的沉淀。接着将上清液在高速下多次离心，收集富含线粒体的组分。差速离心法分离线粒体的优点包括：i）该方法快速，可在1–1.5小时内完成线粒体分离（呼吸实验应尽快进行）；ii）成本低廉；iii）效率高，所获得的线粒体纯度足以满足呼吸测定实验的要求。差速离心法的缺点包括：i）线粒体在匀浆过程中可能受损并发生解偶联；ii）线粒体可能被其他细胞组分污染（可通过额外的离心洗涤步骤进一步清洗线粒体沉淀来解决）；iii）可能选择性地丢失某些线粒体亚群，例如，在差速离心过程中，密度较低的线粒体可能被排除7；iv）线粒体原有的细胞微环境缺失，因此只能测定理论上的最大呼吸速率。另一种用于呼吸测定实验的线粒体分离方法是密度梯度离心法2。该技术将组织提取物铺在蔗糖溶液或Percoll梯度介质（离心管底部密度较高）之上，并在特定速度下离心，使线粒体根据其密度与其他细胞组分分离。此方法常用于分离脑组织线粒体，可显著减少突触体的污染。然而，通过密度梯度离心法分离的大鼠肝线粒体常被其他细胞器严重污染3。该方法的一个局限性在于，离心管中的蔗糖梯度可能导致部分线粒体破裂（渗透性休克）。
根据组织类型的不同，通过差速离心法分离完整线粒体时需考虑一些重要因素。首要条件是以温和的方式进行组织匀浆。肾、脑和肝等软组织在匀浆过程中需要施加较轻的机械力，而心肌和骨骼肌等硬组织则需要更强的机械力。通常在匀浆前用蛋白酶处理切碎的组织，以软化组织。匀浆和离心过程中使用的所有缓冲液均应冰冻，且具有生理相关的pH值，并具备与细胞质相容的离子强度和渗透压4,5。
研究分离线粒体生物能量学的一个优势在于，无需使用皂苷或毛地黄皂苷等去垢剂对细胞质膜进行透化处理4,6，从而避免可能破坏线粒体外膜完整性的风险。分离线粒体的另一个优势是不存在其他细胞质因子的干扰，这些因子可能影响对线粒体功能（如耗氧量）的分析。使用分离线粒体的缺点包括：在离心步骤中可能选择性地富集某些线粒体亚群、在匀浆过程中可能造成线粒体损伤，以及需要较大量的生物样本才能获得足够产量的分离线粒体7,8。
分离完成后，采用高分辨率测氧法测定线粒体复合物I、II和IV依赖性呼吸速率（状态2、3和4）。对于复合物I驱动的呼吸，依次添加谷氨酸和苹果酸，随后加入二磷酸腺苷（ADP）；对于复合物II驱动的呼吸，添加琥珀酸后加入ADP；对于复合物IV驱动的呼吸，添加抗坏血酸和四甲基对苯二胺（TMPD）后加入ADP9,10,11,12。状态2指仅存在底物时的耗氧量；状态3指在底物和ADP同时存在时的耗氧量；状态4指ADP耗尽后的耗氧量。呼吸控制比（RCR）是反映耗氧与ATP生成偶联程度的指标，计算为状态3与状态4耗氧速率的比值13,15。
总之，我们描述了一种通过差速离心法分离功能完整骨骼肌线粒体的方案，并利用所分离的线粒体进行功能与生物能量学研究，例如高分辨率呼吸测定。
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方案
从麻醉后的猪体内取股四头肌活检组织，通过差速离心法分离线粒体。该猪随后用于其他实验。本研究严格遵循美国国立卫生研究院关于实验动物护理和使用的指南，并已获得瑞士伯尔尼州动物护理委员会的批准。
1. 骨骼肌匀浆及线粒体分离
- 从麻醉的猪体内切除 5-10 g 股四头肌组织样本。本实验采用猪骨骼肌。本方案也可用于从其他物种分离线粒体（例如大鼠，小鼠，人 等等.).
注意：此步骤由具有外科手术专长的医学专家执行。- 使用肌肉注射氯胺酮（20 mg/kg）和赛拉嗪（2 mg/kg）对猪进行镇静，随后通过静脉注射咪达唑仑（0.5 mg/kg，加用阿托品 0.02 mg/kg）诱导麻醉。术中通过持续静脉输注异丙酚（4–8 mg/kg 每小时）和芬太尼（30 µg/kg 每小时）维持麻醉。
- 立即将组织样本浸入含有20 mL冰预冷的线粒体分离缓冲液的烧杯中（表1).
注意：匀浆和离心过程中使用的缓冲液应为冰上预冷，具有生理相关的pH值，并且离子强度和渗透压需与细胞质相容。 - 在分析天平上称量烧杯中的组织样品。将装有20 mL分离缓冲液的烧杯置于天平上归零。
- 将烧杯置于装有冰的冰桶中。
注意：匀浆步骤中的所有后续操作均需在冰桶温度下进行，并将所有缓冲液置于冰桶中保存。 - 将骨骼肌组织置于烧杯中（保持在冰上），用精细剪刀剪成1-2 mm的小块，持续3-4分钟。
- 用预冷的分离缓冲液（每次20 mL）在烧杯中清洗组织匀浆两次。
- 按每克组织加入10倍体积的分离缓冲液，缓冲液中含5 mg/g组织的蛋白酶，将组织悬浮于其中。
- 将烧杯置于磁力搅拌器上的冰浴中，搅拌10分钟。
- 将烧杯中的悬浮液用额外的分离缓冲液稀释，每克组织加入10倍体积的缓冲液，并补充0.2%（质量/体积）脱脂牛血清白蛋白（BSA）。
- 将所有添加了0.2% BSA的分离缓冲液倾倒出来，然后用冰冻的含0.2% BSA的分离缓冲液（每次20 mL）在烧杯中冲洗组织两次。
- 按每克组织加入10倍体积的分离缓冲液（含0.2%脱脂BSA）重悬组织。
- 使用半自动玻璃匀浆器（置于冰上）和松配合的研杵（10次 strokes）对组织进行匀浆。
注意：始终以相同方式匀浆组织（相同的研磨次数、 例如，10次研磨）。研磨次数过多可能会损伤并解耦联线粒体。建议使用自动匀浆器进行组织匀浆。采用玻璃匀浆器手动（且主观）匀浆的组织样品可能产生不同质量的分离线粒体。 - 将匀浆组织在 4 °C 条件下以 10,000 x g 离心 10 分钟。
注意：所有离心步骤均使用配有固定角度转子的离心机进行。 - 使用血清移液管弃去上清液，并将沉淀物重悬于添加了BSA的冰浴隔离培养基中（10 mL/g 组织）。
- 在 4 °C 条件下以 350 x g 离心 10 分钟。
- 使用血清移液管保留上清液，并弃去沉淀（细胞碎片）。
- 将上清液通过两层纱布（17 股/厘米）过滤至烧杯中（置于冰上）2）以去除细胞碎片。
- 在 4 °C 条件下，以 7,000 x g 离心过滤后的悬浮液 10 分钟。
- 弃去上清液，将粗线粒体沉淀重悬于含有0.2%（质量/体积）BSA的分离缓冲液中（5 mL/g组织），4 °C、7,000 x g离心10分钟。
- 弃去上清液，将粗线粒体沉淀重悬于洗涤缓冲液（表1）中。4 °C、7,000 x g 离心10分钟，再次离心悬浮液。
- 弃去上清液，将粗线粒体沉淀重悬于洗涤缓冲液中，于4 °C、7,000 x g离心10分钟。
- 弃去上清液，将粗线粒体沉淀重悬于1.0 mL洗涤缓冲液中。
- 测定线粒体悬液的蛋白浓度，并将浓缩的线粒体悬液置于冰上保存。
注意：蛋白质浓度可使用任何标准方法进行测定。 - 呼吸测定实验开始前，将线粒体悬液用呼吸缓冲液重悬，使线粒体蛋白终浓度为0.4 mg/mL。
2. 高分辨率呼吸测定法
- 用移液器将 2.1 mL 呼吸缓冲液（表 1）16 加入高分辨率氧测定仪的检测室中，并使用检测室内自带的磁力搅拌子在 37 °C 下持续搅拌（700 rpm），持续 1 小时，直至极谱氧传感器获得稳定的氧通量信号。
注意：每个氧测定仪检测室内的极谱氧电极用于测量氧浓度，并计算各检测室中的氧气消耗量（通量）。氧浓度和氧消耗速率（通量）通过数据采集与分析软件在计算机上实时在线显示。此外，为确保结果准确可靠，应根据仪器制造商的说明进行仪器氧背景校正。
注意：向检测室中准确加入 2.1 mL 呼吸缓冲液，以便在关闭密封塞后校准最终检测室体积为 2.0 mL。 - 根据制造商的操作规程对极谱氧传感器进行空气校准17。
注意：在空气校准过程中，当存在气相时，培养基中的氧浓度将在约 15–20 分钟内达到平衡。根据温度、大气压以及培养基中氧气的溶解度，可计算出氧浓度。 - 空气校准完成后，吸出氧测定仪检测室中的呼吸介质，并向氧测定仪的检测室中加入 2.1 mL 来自步骤 1.24 的分离线粒体悬液（线粒体蛋白浓度为 0.4 mg/mL）。
注意：呼吸缓冲液体积取决于仪器型号和制造商。对于高分辨率呼吸测定，向检测室中加入 2.1 mL 呼吸缓冲液，以便在关闭密封塞后校准最终检测室体积为 2.0 mL。 - 通过插入密封塞关闭氧测定仪检测室。
- 使用检测室内自带的磁力搅拌子在 37 °C 下持续搅拌线粒体悬液（700 rpm），并记录基础状态下的细胞呼吸 3–5 分钟，直至获得稳定的氧通量信号。
注意：氧浓度和氧通量信号通过数据采集与分析软件在计算机上实时在线显示17。 - 随后，通过密封塞上的钛注射口，按照以下标准操作流程注入线粒体呼吸所需的底物和抑制剂。
3. 复合物I依赖性呼吸作用
- 按照步骤 2.1-2.5 中所述方法准备含有分离线粒体悬液（0.4 mg/mL）的氧电极室，并等待信号稳定。
- 通过氧电极室塞上的钛质进样口，向含有分离线粒体悬液（0.4 mg/mL）的氧电极室中注入 12.5 µL 的 0.8 M 苹果酸（终浓度 5 mM）和 10 µL 的 2 M 谷氨酸（终浓度 10 mM），记录细胞呼吸 3-5 分钟，直至获得稳定的氧通量信号。
注意：后续所有步骤中的注射均通过塞子上的钛质进样口使用注射器完成。 - 通过氧电极室塞上的钛质进样口，向氧电极室中注入 10 µL 的 0.05 M ADP（终浓度 0.25 mM），记录线粒体呼吸，直至氧通量信号先上升，随后下降并趋于稳定（3-5 分钟）。
注意：加入 ADP 后呼吸达到的平台期表明 ADP 浓度足够高且已饱和。根据呼吸实验中所用线粒体的量，应滴定 ADP 浓度以实现稳定的呼吸态 3（最大呼吸）。向线粒体悬液中添加 ADP 将引起耗氧量增加，氧通量信号随之上升（呼吸态 3）。当 ADP 被消耗完毕后，氧通量信号将下降（呼吸态 4）。
4. 复合体II依赖性呼吸
- 按照步骤 2.1-2.5 中所述方法准备含有分离线粒体悬液（0.4 mg/mL）的氧电极室，并等待信号稳定。
- 使用注射器通过氧电极室塞上的钛注射口向其中注入 2 µL 的 0.2 mM 鱼藤酮（0.2 µM）'CAUTION'，记录 3-5 分钟的细胞呼吸，直至获得稳定的氧通量信号。
注意：鱼藤酮为剧毒物质，可能对人体健康造成严重影响。 - 向氧电极室中注入 20 µL 的 1 M 琥珀酸（10 mM），记录线粒体呼吸 3-5 分钟，直至氧通量信号稳定。
- 通过氧电极室塞上的钛注射口向其中注入 10 µL 的 0.05 M ADP（0.25 mM），记录细胞呼吸，直至氧通量信号上升、稳定，随后下降并再次稳定（3-5 分钟）。
注意：向线粒体悬液中添加 ADP 将诱导耗氧量增加，氧通量信号随之上升（状态 3 呼吸）。当 ADP 被消耗完毕后，氧通量信号将下降（状态 4 呼吸）。
5. 复合体IV依赖性呼吸作用
- 按照方案中步骤 2.1 至 2.5 所述方法准备含有分离线粒体悬液（0.4 mg/mL）的氧电极室，并等待信号稳定。
- 随后向氧电极室中加入 2.5 µL 的 0.8 mM 抗坏血酸（终浓度 1 mM）。紧接着立即加入 2.5 µL 的 0.2 M TMPD（终浓度 0.25 mM）和 10 µL 的 0.05 M ADP（终浓度 0.25 mM），记录细胞呼吸，直至氧通量信号上升并稳定（3–5 分钟）。
- 最后向氧电极室中加入 10 µL 的 1 M 叠氮化钠（终浓度 5 mM）“注意：叠氮化钠为剧毒物质，可能对人体健康造成严重危害”，记录细胞呼吸，直至氧通量信号下降并稳定。
注：叠氮化钠是一种危险的剧毒物质，可能对人类健康产生严重影响。
6. 细胞色素C测试
- 按照方案中 2.1 至 2.5 步骤所述方法，准备含有分离线粒体悬液（0.4 mg/mL）的氧电极室，并等待信号稳定。
- 通过氧电极室塞上的钛注射口，向含有分离线粒体悬液（0.4 mg/mL）的氧电极室中注入 12.5 µL 的 0.8 M 苹果酸（终浓度 5 mM）和 10 µL 的 2 M 谷氨酸（终浓度 10 mM），记录细胞呼吸 3–5 分钟，直至获得稳定的氧通量信号。
- 通过氧电极室塞上的钛注射口，向氧电极室中注入 10 µL 的 0.5 M ADP（终浓度 2.5 mM），记录线粒体呼吸，直至氧通量信号先升高，随后下降并趋于稳定（3–5 分钟）。
- 最后，通过注射口向氧电极室中注入 5 µL 的 4 mM 细胞色素 c（终浓度 10 µM），记录细胞呼吸 5 分钟，直至氧通量信号再次达到稳定。
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结果
复合物 I 依赖性呼吸作用
采用高分辨率呼吸测定法测定分离线粒体复合物I依赖性呼吸速率（状态2、3和4）（图1，代表性示意图）。依次加入线粒体复合物I底物谷氨酸和苹果酸，随后加入ADP。状态2指仅存在底物时的耗氧量；状态3指在底物和ADP同时存在时的耗氧量；状态4指ADP耗尽后的耗氧量。呼吸控制比（RCR）是反映耗氧与ATP生成耦合程度的指标，计算为状态3与状态4呼吸速率的比值。如图1所示，加入ADP后，线粒体呼吸速率迅速上升（状态3呼吸），随后下降（状态4呼吸），降至与状态2相近的水平。这表明RCR较高，提示线粒体在分离过程中结构完整性保持良好。图2为低状态3呼吸速率和低RCR、同时伴有高状态4呼吸速率的代表性图示，提示线粒体分离操作不当或失败。状态4呼吸速率过高是线粒体质子渗漏的标志
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讨论
本研究中，我们描述了一种通过差速离心法分离高质量、完整且紧密偶联的骨骼肌线粒体的实验方案，可用于高分辨率呼吸测定等功能研究。
为了分离完整且紧密偶联的线粒体，本方案中有一些关键点需要考虑。在收获骨骼组织后，应立即将其浸入预冷的线粒体分离缓冲液中。所有离心步骤均需在 4 °C 下进行，且在分离过程中线粒体悬液必须始终置于冰上。分离操作应尽快完成。匀浆液应使用洁净且无去污剂的离心管进行离心。在操作结束时，线粒体悬液应保持浓缩状态，并仅在呼吸测定前进行稀释。由于呼吸测定数据以每秒每毫克线粒体蛋白的皮摩尔（pmol）表示，因此在分离后采用可靠的检测方法准确测定线粒体蛋白浓度至关重要。
在某些线粒体分离实验中，可能会出现线粒体解偶联或无法利用高分辨率呼吸测定法正常消耗氧气的情况。为解决这些问题，应始终使用带有松配合研杵的匀浆器以相同方式（相同的研磨次数）进行组织匀浆（步骤1.12）。在此，我们始终使用自动匀浆器对骨骼肌组织进行10次冲程的匀浆处理。过多的冲程次数可能会损伤线粒体并导致其解偶联。使用玻璃匀浆器手动（且主观）匀浆的组织样本可...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由瑞士国家科学基金会（资助号 32003B_127619）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ADP | Sigma | A 4386 | 化学试剂 |
| 抗霉素A | Sigma | A 8674 | 化学试剂，溶于乙醇 |
| 抗坏血酸 | Merck | 1.00127 | 化学试剂 |
| ATP | Sigma | A 7699 | 化学试剂 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma | A 6003 | 化学试剂 |
| EGTA | fluka | 3779 | 化学试剂 |
| 谷氨酸 | Sigma | G 1626 | 化学试剂 |
| Hepes | Sigma | H 7523 | 化学试剂 |
| KCl | Merck | 1.04936 | 化学试剂 |
| KH2PO4 | Merck | 1.04873 | 化学试剂 |
| 乳酸钾 | Sigma | L 2398 | 化学试剂 |
| MgCl2 | Sigma | M 9272 | 化学试剂 |
| 3-吗啉丙磺酸（MOPS） | Merck | 1.06129 | 化学试剂 |
| O2k-Core：Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | 高分辨率呼吸测定仪 |
| 细菌蛋白酶 | Sigma | P 8038 | 化学试剂 |
| 叠氮化钠 | Sigma | S2002 | 化学试剂 |
| 鱼藤酮 | Sigma | R 8875 | 化学试剂，溶于乙醇 |
| 琥珀酸 | Sigma | S 2378 | 化学试剂 |
| Schuett homogen-plus 半自动匀浆器 | schuett-biotec GmbH | 3.201 011 | 组织匀浆器 |
| 牛磺酸 | Sigma | T 8691 | 化学试剂 |
| TMPD | Sigma | T 3134 | 化学试剂 |
参考文献
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