DAN矩阵升华为神经节苷脂对大鼠脑组织的检测和可视化MALDI成像质谱

基质辅助激光解吸/电离（MALDI）成像质谱（IMS）正在成为一种高度寻求技术为脂质，肽和蛋白质穿过完好样品表面的空间分布的可视化之后。 MALDI IMS的以前被称为预纯化的分析物的分析技术，但在最近几年中，已经在因为具有高分辨率视觉/解剖参考点，而质谱的精确度结合的能力许多其他学科提请注意需要任何外部标记。作为利用这种技术的研究的科学池继续增长，所需要增加的标准化，易于后续的协议，以协助IMS实验开发和优化。神经节苷脂，一组膜脂质在中枢神经系统高度丰富的，是理想的MALDI IMS实验作为它们的位置，嵌入在膜中，使某些特定上课不可能使用常规的免疫标记以检测。此外，我们已经表明，使用MALDI IMS中，这些脂质，其充当细胞信号的调节剂，除其他事项外，有在被脑损伤^3，4，5后改变了健康啮齿动物脑独特的解剖分布模式。神经节苷脂位于较高质量范围相比，大多数脂质种类，并因此最适合于MALDI成像平台。

图1:MALDI IMS实验的工作流程。使用升华在MALDI IMS实验的一般流程的图。组织在-80℃冷冻于低温恒温器被分段和10微米的部分是安装在导电的ITO载玻片解冻。然后将载玻片置于干燥器直到升华。 SLIDES插入升华装置和偶数层矩阵施加到组织样本表面。样品在-20℃冷冻然后置于干燥器中10分钟，冷冻过夜。一旦标准被应用，将样品插入到其中激光跨越引起解吸分子在基质中以电离所述组织指示MALDI仪器。离子行进向下根据它们的质量（时间飞行/ TOF）直到它们到达了检测器的飞行管和分离。上一个预定的质量 - 电荷（M / Z）范围内的离子丰度分析物的信息显示为两个分子图像和质谱。这个数据可以用来既可视化和量化的成像组织内感兴趣的分析物的离子丰度。 请点击此处查看该图的放大版本。

样品制备用于MALDI IMS是高度可变的过程的每个步骤必须进行定制，以所关注的分析物。基于MALDI-实验限定特征是使用沉积到分析前的样品表面上的基质的涂层。除了吸收和在消融过程中从激光转印辐射能量的作用，该基质也用于各种分析物从样品中分离，从而有利于感兴趣^6,7化合物的分析。基质样品表面的均匀的应用是在样品制备过程中最关键的步骤。不正确的基质沉积可导致大量异构基质晶体形态和文物的发展，低离子信号，重复性差^7。

由于某些矩阵的亲和力来分离特定的分析物，被选择用于实验矩阵的类型可以显著改变的结果。用于蛋白质和肽的成像矩阵常常不同于用于成像脂质不同，此过程是通过需要额外的方法，如为了从组织成功地检测信号的洗涤和再水合步骤进一步复杂化。虽然脂质信号⁸的增强存在洗涤步骤，它们不是用于检测最脂质种类的一个先决条件。当选择的脂成像实验的矩阵，它考虑的兴趣，因为这脂质的极性将缩小合适矩阵的范围是重要的。例如，神经节苷脂含有唾液酸残基这给他们一个整体的负极性。有许多的矩阵，可以有效地解吸和电离来自组织神经节苷脂;然而，因素，如在频谱并在真空下基质的稳定性基质衍生的峰必须在考虑服用。 1,5-diaminonapthalene（DAN）矩阵是仪器的真空条件对于大多数成像应用下足够稳定，并表现出高度的脂质解吸灵敏度和可用于在正和负离子模式²脂质的分析。 DAN基质，相对于其他负脂质亲和基质如二羟基苯甲酸（DHB），9-氨基吖啶（9-AA）和5-氯-2-巯基苯并（CMBT）时，能够最有效地解吸从大鼠脑神经节苷脂组织在负离子模式（手稿准备中）。

选择基质沉积的适当的方法是同等重要选择矩阵本身。湿基质沉积方法，其中所述固体基质溶解在有机溶剂中，并通过气动沉积或自动喷雾器或检举，作为液体渗透的样品，以允许额外的用于蛋白质和肽的解吸特别有效化合物和共结晶与基质的ction。尽管这些技术也可用于脂质应用，分析物离域和不均匀的基质晶体地层是屡见不鲜由于脂质的在溶剂中的高丰度和溶解度，特别是在组织^2,9。因为脂质易于从组织电离，干燥基质沉积技术，如升华，提供一种简单的，成本效益的替代喷雾器而绕过许多这些技术的缺点的。升华的MALDI IMS实验的成功归功于功能，如微晶矩阵的形态这增加了矩阵分析物结合的表面面积，增加基质纯度和均匀的基质的沉积，从而增加可重复性比较潮湿的矩阵技术^1，10。

升华invoLVES正下方产生的固体，粉状基质随后沉积在组织样品表面的气相过渡冷却的样品表面加热真空下粉状基质。期间升华，基质沉积可通过改变因素例如时间，温度和压力，以提供高度可重复的结果来控制。单个升华试验可以在任何地方需要5至20分钟取决于矩阵的选择的类型，处理前可重复使用数次。该装置可商购于自动喷雾器的价格的几分之一处购买，并且很容易被拆开进行清洁和维护。成本低，这种基质沉积技术相对简单使其非常适用于开始后，或MALDI IMS脂质成像应用拓展的研究人员。虽然详细说明了组织对IMS的升华协议的信息已报告^11，少数标准化协议存在W¯¯HICH重点涉及进行升华实验在负离子模式成像高质量脂质，使得难以建立的技术中没有广泛的试验和错误的基本工作流程。下面是一个试验性协议旨在填补DAN矩阵的升华到大鼠脑切片用于高分辨率成像和神经节苷脂的检测该间隙。

图2:升华设备。照片（A）和升华装置的示意图（ 二 ）。真空泵由橡胶管连接到冷阱充满300毫升乙醇。冷阱，然后由橡胶管的升华装置相连。该装置是由两个独立的玻璃器皿的件所用的金属U形接头密封在一起。升华器的上半部分包含填充有冰凌冷凝器。该样品板贴到所述冷凝器的底部，所述密封的玻璃装置内。升华设备的下半部分包含DAN矩阵，摊开均匀面临的样板。期间升华，玻璃装置被放置在砂浴中加热至140℃用热板正下方。温度探头有助于维持整个升华试验通过沙浴温度的反馈相比为实验的预设温度稳定的温度。 请点击此处查看该图的放大版本。

坚持以下描述西方安大略省的动物护理委员会（2016-014）的大学所有的动物处理程序。

1.组织准备和剖分

1. 通过所谓的"新鲜冷冻萃取"（FFE）的过程中提取从大鼠脑组织。
   1. 安乐死大鼠的戊巴比妥钠的过量和监测四肢反射。一旦所有的反射都停止了，断绝使用断头台鼠的头上。
   2. 仔细的肌肉和其他组织使用手术刀颅骨分离。使用骨切割钳打破颅骨以暴露脑，从头骨（枕骨大孔）的底部开始到前部。
   3. 一旦大脑暴露出来，小心地舀出来用手术锅铲，立即放在闪存冷冻碎干冰。
      注:大脑会很可塑性。因此，放置在大脑时要格外小心干冰。如果大脑被压碎或针对一个表面按压时，它会改变其形状和在该位置结冰。
2. 取下新鲜冷冻组织（未用甲醛灌注或嵌入在OCT） - 80℃的冰箱中放干冰。
3. 放置几滴水上低温恒温器保持器和地点上或干冰或低温恒温器冻结栏。按组织上轻轻低温恒温器支架，因为它开始冻结并按住，直到组织的基地周围水结冰和主持人到位。添加额外的水，如果必要，以进一步固定在支架上的组织。
   注:水是用来代替OCT介质中，以避免与这会影响所希望的信号的检测化合物的组织的污染安装组织。
4. 位置组织低温恒温器。部组织到所需的解剖位置。确保切割厚度为8之间 - 12微米。
   注:当切片在公共组织的低温恒温器设备，当务之急是独立的材料，如刀片，刷子，防倾杆，并持有人按顺序使用，以避免与嵌入化合物污染。低温恒温器的内也应在使用前与乙醇彻底清洁。
5. 使用低温恒温器防倾杆，慢慢的部分扁平的组织切片。如果倾杆的位置不正确，或刀片变钝可以发生在组织孔或标记。移动至组织，使用干净的漆刷切片平台的中心。
6. 安装
   1. 通过将它们放置在低温恒温器，而切片冷冻导电幻灯片或金属板。当滑动被完全冻结，小心移动切片组织上使用清洁漆刷滑动的导电表面。一旦所有的组织切片的幻灯片正确定位，请将手指滑动下，组织对面，按直到部分融化。
      注:章节可以折叠或在解冻过程中，当卷曲使用这种安装方法。这可以通过解冻组织时保持滑动在低温恒温器被减少。如果这些问题成为问题，或者，预热安装方法如下。
   2. 可替代地，采取室温铟锡氧化物（ITO）滑动（或金属板），并轻轻地向下压上的切片平台表面冷冻组织部分，导电性的一面朝下。这将导致该组织部分解冻均匀到具有小卷曲或组织的折叠滑动的表面上。
      注意:使用这种方法可能导致某些蛋白质和脂质的损失时安装冷凝可能会出现部分的下方。
7. 放置与组织切片中进行5干燥器 - 10分钟。

2.升华器设备建立

注:在通风橱中执行这些步骤。

1. 放置在铝容器中的砂浴上热板，以在金属剪式升降热板适当的表面积（ 即比热板大）。开启热板，并设置温度至140℃。
   注:熔点DAN矩阵是187之间 - Visual C 190°。不要超过在烤盘这个温度。
   1. 如果加热板配有一个温度反馈探针，用它来监视砂温度在整个实验，确保温度一致。此功能可以帮助实验在不同的升华实验重复性。
      注:砂浴应铝容器如玻璃容器内被包含在高温下可能碎裂。
2. 放置300毫克DAN基质上升华装置的底表面上。放置基质在该装置的中心，并在近似宽度和滑动的长度的偶数层摊开被升华。
   注意:DAN矩阵是有毒的。因此，重要的是戴手套，口罩，和安全在任何时候都护目镜处理粉状基质时。 DAN应贮存在黑暗中，因为它是光敏感。
3. 带的金属板到具有制版与冷凝器的底部直接接触，以确保均匀的温度的升华期间横跨滑板的整个表面的冷却分布装置的内表面上。可替代地，砂冷凝器的底部，以确保一个平的表面。
   1. 放置胶带沿板的外边缘和附着到内玻璃器皿的侧面。如果磁带被放置在板下，并附着在内层玻璃表面的底部，温度分布可能不连，并可能导致在横跨滑板的表面凹凸不平矩阵分布。
   2. 带的空白（测试）跨越与再次放置在滑动件的外边缘带的金属板的表面上对角滑动。
4. 连接装置的顶部和底部，W第i个中间橡胶O型圈，以确保完全密封。
5. 放置一个金属U型关节周围的装置的中心并拧紧虎钳直到该装置的顶部和底部一半被密封紧密在一起。在金属O型圈的沙浴以上的地方。
6. 以碎冰一把，并将其放置在冷凝器中。填写冷凝器¼到½充分用冷水创建冰凌。冰雪泥会冷却在装置的内部，并且随后将滑动附着于它的金属板。等待至少5分钟，使温度达到稳定状态。
7. 倒300毫升乙醇中的冷阱容器和玻璃器皿放置到容器中。降2 - 3小块干冰入乙醇中的冷阱容器的底部。冷阱输入具有运行在气缸底部的玻璃管，而不会输出。
8. 连接真空泵使用橡胶管冷阱输出。用另一块橡胶油管冷阱输入连接到升华设备。确保油管（如果可用）使用金属夹子关紧。
9. 使用真空泵以提供30的真空 - 为50mT。允许泵为至少5分钟，使压力平衡运行。升华装置的U形环上的虎钳可能必须被重新拧紧，一旦真空泵被接通，因为在该装置中的压力降低上。
   注:强烈建议真空计被连接到泵以监测在实验过程中的真空的压力和以达到实验之间的最高可能的再现性来测试泄漏的压力。然而，大多数的泵被设计成维持恒定的压力，因此该计可能不是经验丰富的用户是必不可少的。此外，真空密封润滑脂可用于帮助维持真空压力。

3.升华

1. 确保砂浴温度具有STABIL源化在140℃，并且该装置被固定在该金属O型环的砂浴具有连接所有管路的上方和真空接通。
2. 设置计时器7分钟，但不启动定时器。慢慢地将剪叉式升降机和沙浴直至升华设备，直至升华的万向节是很好的金属O型圈以上。这额外的空间允许在砂设备的调整。
   1. 迅速轻轻按下升华的砂表面上的，以确保该装置是坐在均匀在沙滩上，然后立即启动定时器。
3. 当计时器的声音，关闭真空泵，并小心地将剪叉式升降机，直到升华不再接触沙浴，并在金属O型圈安全坐着。
   1. 缓慢地松开微排气阀来释放在装置的压力。松开周围的升华设备的橡皮管金属夹，慢慢地开始放松管。一旦RUBBER管已略有松动，弯曲管一侧，使残余压力逃脱。
   2. 当环境压力的回报，小心地取出从升华设备的橡胶管。
4. 松开装置的万向节的恶习，并删除。仔细分离升华装置的两个半部，并从内玻璃器皿的顶部拉断的幻灯片。检查幻灯片确认连矩阵分布。
   注意:如果矩阵是不均匀的，在升华的底部粉状基质可以重新定位或升华器设备所用的砂为下一幻灯片重新定位。升华工序可以重复使用相同的矩阵数次，但是，基质最终将成为反复热暴露和粉末的量更暗将减小，使得升华时间将必须稍微调整以补偿。出于这个原因，重要的是监测矩阵贝的量是非常重要的纳克实验后升华，以确保幻灯片之间的基质沉积的一致性
5. 如果基质的升华的分布和数量是足够的，用胶带与组织新的幻灯片到升华器，并重复第3节的内侧。
   注:对于质量控制（QC）的目的，升华基质的量可以在每个实验后通过称量滑动之前和升华后除以与滑动²的表面积升华基质的重量计算，其应注意的是由于缺乏超过4小数点和鳞之间的变异最秤的精度，这些测量应仅用于最佳基质沉积的引导，而不是质量控制的一个完全量化手段，除非使用高精密天平（ 见图3）。

4.组织存储/补液

1. 升华后，储存滑动在密封容器或小卡斯ETTE在密封的塑料袋中。
2. 孵育在-20℃冷冻载玻片2小时或过夜。
   注:冷冻过程的目标是充当组织材料的解吸到矩阵的复水的步骤。冷冻过程也被证明当储存在-80℃下¹²以防止脂质的信号的劣化长达1周。出于这个原因，时间的样值存储在冰箱的量可以改变，以一定的程度，以满足实验者的需要而不显著改变的信号检测（如在我们的实验室观察到的）。但是，我们已经注意到矩阵的一些变色当样品在-20℃冷冻的时间超过24小时。因此，我们建议成像升华组织该时间之前或在-80℃储存组织更长的潜伏期。
3. 10分钟 - 在5干燥器卸下从冰箱（集装箱），地点幻灯片。

5.成像和Analysis

1. 从干燥器中取出的幻灯片和应用仪器标准，以确保在成像MALDI仪器的质量精确度。的类型的标准将取决于仪器而有所不同。标准一般横跨整个幻灯片施加均匀，周围组织将被成像（ 图3D）。
2. 将滑入MALDI仪器，并按照制造商的成像实验说明（仪器方法应针对1000进行优化 - 2000质量范围）。代表性的结果（ 图4）在反射器负模式获得具有70微米的光栅和20张/谱（采集时间〜2小时）。

经升华实验结束后，将玻璃仪器的两半在通风柜和滑动分离，贴在冷凝器，可以去除（ 图3A）。此时，滑动应检查在沙浴中的装置的不均匀矩阵分布和时间，温度，或位置可能必须调整为下一幻灯片。一个成功的DAN升华实验将导致甚至涂层沿着那里的组织的解剖特征可以清楚地显现在滑动和载玻片上基质的量的表面灰色/褐色矩阵的类似于量在组织上（ 图3B）。例如，如果过多基质已经升华在组织上，基质的厚度将覆盖组织和唯一的一般形状的特征将是可以辨认的。然而，如果太少矩阵升华，组织将哈已经比滑动（ 图3C）的其余部分更暗的外观。既过多和过少的矩阵将导致在MALDI仪器差信号。对于质量控制的目的，托马斯等人。称量附着在滑动基质的量和由滑动表面面积除以重量。他们报告基质沉积的最佳量为几个矩阵包括DAN（110微克/平方厘米）2。虽然大多数余额缺乏复制这样的结果所需的精度，我们试图QC这种方法;然而，由于高度的变异性，我们只能建议要关联发现基质沉积的一个合适的范围与成功与丹矩阵不成功的升华实验，通过仪器信号检测来确定。低于100微克/平方厘米的基质测定用"太少"矩阵的条件有关，而高于140微克/平方厘米的测量是与"太多"有关。 100和140微克/平方厘米之间基质沉积被认为是用于与DAN矩阵成像的最佳量。校准标准应在组织样本周围的载玻片被应用，以确保检测到的IMS信号的质量准确度（ 图3D）

在一个电离的IMS实验中，分子图像允许所关注的分析物的任何未知物种可能存在于一个给定的质量范围沿空间分布的可视化。神经节苷脂在该实验的分子图像使用ImageJ软件，以显示几种神经节苷脂物种横跨鼠脑（ 图4A）的皮质和皮质下区域的解剖分布重叠。在大脑中最丰富的神经节苷脂是A系列品种神经节苷脂GD1a和GM1而且还含有可以全部之间找到GM2神经节苷脂GM3和1000-2000 M / Z质量范围，更高的质量范围比最常见的脑脂质，使得这些神经节苷脂易于沿谱（ 图4B）确定。各神经节苷脂物种的离子丰度可用于半定量同一图像内神经节苷脂物种差异或变化。因为变异性的样品制备一定量的无法避免在IMS中，间扫描的比较被认为是半定量的。

图3. DAN升华。对大鼠脑组织DAN矩阵的升华的代表性结果。 （A）在升华后，该装置的两半分开，并在滑动从冷凝器除去。 （B）的DAN矩阵跨越多个大鼠脑组织切片均匀地分布在滑动的表面上，以允许高度再版oducible结果（100之间 - 150微克/平方厘米）。 （C）的，其中太少矩阵（左- <90微克/平方厘米）或过多矩阵（右- >失败升华实验实施例150微克/平方厘米）沉积。太少矩阵将导致分析物的解吸不充分，而太大矩阵将不允许激光采集期间穿透到组织，导致低离子检测。 （D）含有与施加DAN矩阵和校准标准升华大鼠脑组织切片幻灯片是准备用于插入到用于成像的MALDI仪器。 请点击此处查看该图的放大版本。

图神经节苷脂对大鼠脑4. MALDI IMS。代表SourceÈMALDI IMS分子图像和DAN矩阵升华后在大鼠脑神经节苷脂的质谱。分子图像是重叠的频谱的多个神经节苷脂物种的复合物，并使用的Image J软件来显示整个大脑神经节苷脂物种的独特解剖学分布伪彩色。种GM1d18:1（红色，大众〜1547道尔顿），GM1d20:1（绿色，大众〜1573道尔顿），GM3d18:1（蓝，大规模〜1178道尔顿），以及GM3d20:1（水鸭，大众〜1207道尔顿）是表示。分析物的质谱显示离子丰度1000内 - 2000质量范围。主要的A系列神经节苷脂沿频谱标记。 请点击此处查看该图的放大版本。

作者没有什么可透露的。