本文介绍了一种在大鼠脑组织上沉积DAN基质的升华方案，用于通过基质辅助激光解吸电离成像质谱技术检测神经节苷脂。
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摘要
摘要
在基质辅助激光解吸/电离成像质谱（MALDI成像质谱，IMS）实验中，样品制备是实现分析物最佳检测与可视化效果的关键。在整个样品制备过程中，确定合适的操作方案可能具有挑战性，因为每一步都必须根据目标分析物的独特性质进行优化。该过程不仅包括寻找一种能够高效解吸并电离目标分子的相容性基质，还需选择合适的基质沉积技术。例如，湿法基质沉积技术需将基质溶解于溶剂中，适用于大多数蛋白质和肽类的解吸；而干法基质沉积技术则对脂质的电离尤为有效。已有文献报道，升华法作为一种高效的干法基质沉积方法，在MALDI IMS检测组织中脂质时表现出优势，其基质晶体沉积均匀，且与多种湿法沉积方法相比，分析物的位移程度显著降低1,2。该方法通常将样品与粉末状基质置于真空密封的腔室内，样品紧贴冷表面；随后将装置浸入加热浴（如沙浴或油浴）中，使粉末基质升华并沉积于冷却的组织样品表面。本文介绍了一种使用1,5-二氨基萘（DAN）基质，通过MALDI成像质谱技术对大鼠脑组织中神经节苷脂进行检测与可视化的升华沉积方案。
引言
基质辅助激光解吸/电离（MALDI）成像质谱（IMS）正成为一种备受青睐的技术，可用于可视化完整样品表面脂质、肽和蛋白质的空间分布。MALDI IMS 以往主要用于预纯化分析物的分析，但近年来，由于其能够将质谱技术的高准确性与高分辨率的视觉/解剖学参考点相结合，且无需任何外部标记，因而受到多个学科领域的广泛关注。随着应用该技术的研究人员群体不断扩大，迫切需要标准化且易于遵循的操作流程，以协助开展和优化IMS实验。神经节苷脂是一类在中枢神经系统中高度富集的膜脂，非常适合用于MALDI IMS实验，因为它们嵌入在膜内的位置使得某些种类无法通过传统的免疫标记方法检测到。此外，我们已通过MALDI IMS证明，这些脂质除了具有调控细胞信号传导等多种功能外，在健康啮齿类动物脑组织中具有独特的解剖分布模式，而在脑损伤后其分布会发生改变3,4,5。与其他大多数脂质种类相比，神经节苷脂位于较高的质荷比范围，因此特别适用于MALDI成像平台。
图1：MALDI成像质谱实验的工作流程。 使用升华法的MALDI成像质谱（IMS）实验通用工作流程示意图。在-80 °C下冷冻的组织于冷冻切片机中切片，获得10 µm厚的切片，并将其贴附至导电的氧化铟锡（ITO）载玻片上。将载玻片置于干燥器中直至进行升华处理。随后将载玻片插入升华装置，在组织样本表面均匀涂布一层基质。样品在-20 °C冰箱中过夜冷冻，然后置于干燥器中10分钟。在施加标准品后，将样品插入MALDI仪器中，激光束扫描组织表面，使基质中的分子解吸并离子化。离子沿飞行管行进，并根据其质量（飞行时间/TOF）分离，最终到达检测器。系统将特定质荷比（m/z）范围内的分析物离子丰度信息，以分子图像和质谱图两种形式呈现。该数据可用于对成像组织中目标分析物的离子丰度进行可视化和定量分析。请点击此处查看此图的放大版本。
基质辅助激光解吸电离成像质谱（MALDI IMS）的样品制备具有高度可变性，因为该过程的每一步都必须根据目标分析物进行定制。基于MALDI的实验的关键特征是在分析前将基质涂层沉积到样品表面。除了在解吸过程中吸收并传递激光辐射能量外，基质还可将样品中的各种分析物分离开来，从而促进目标化合物的分析6,7。将基质均匀地涂布于样品表面是样品制备过程中最关键的步骤。基质沉积不当可能导致形成大而不均一的基质晶体，进而产生伪影、离子信号弱以及重复性差等问题7。
由于某些基质对特定分析物具有亲和性，实验所选用的基质类型可能显著影响结果。用于蛋白质和多肽成像的基质通常不同于用于脂质成像的基质，而为了成功检测组织中的信号，还需额外的步骤如洗涤和再水化，这进一步增加了实验的复杂性。尽管存在用于增强脂质信号的洗涤步骤8，但这些步骤并非检测大多数脂质种类的必要前提。在为脂质成像实验选择基质时，必须考虑目标脂质的极性，因为这将缩小合适基质的选择范围。例如，神经节苷脂含有唾液酸残基，使其整体呈现负极性。目前已有多种基质可有效从组织中解吸附并离子化神经节苷脂；然而，还需考虑诸如质谱中基质自身产生的峰干扰以及基质在真空条件下的稳定性等因素。1,5-二氨基萘（DAN）基质在大多数成像应用的仪器真空条件下具有足够的稳定性，并且在脂质解吸附方面表现出高灵敏度，可用于正离子和负离子模式下的脂质分析2。与其它针对负极性脂质的基质如二羟基苯甲酸（DHB）、9-氨基吖啶（9-AA）和5-氯-2-巯基苯并噻唑（CMBT）相比，DAN基质在负离子模式下能更高效地从大鼠脑组织中解吸附神经节苷脂（相关论文正在准备中）。
选择合适的基质沉积方法与选择基质本身同样重要。湿法基质沉积技术是将固态基质溶解于有机溶剂中，再通过气动或自动喷雾器或点样仪进行沉积，该方法特别适用于蛋白质和肽类的解吸，因为液体能够渗透样品，从而实现化合物的提取并与基质共结晶。尽管这些技术也可用于脂质分析，但由于脂质在溶剂中丰度高且溶解性好，尤其是在组织中，常常会导致分析物的扩散以及基质晶体分布不均2,9。由于脂质在组织中易于离子化，干法基质沉积技术（如升华法）提供了一种简单且经济的替代喷雾法的方案，同时避免了上述技术的诸多缺点。升华法在基质辅助激光解吸电离成像质谱（MALDI IMS）实验中的成功归因于其多种优势，例如微晶状的基质形态可增加基质与分析物结合的表面积、基质纯度更高，以及基质沉积更加均匀，从而相比湿法基质技术具有更高的重复性1,10。
升华是指在真空条件下，将粉末基质置于冷却的样品表面正下方进行加热，使粉末基质发生从固相到气相的转变，随后沉积到组织样品表面。在升华过程中，可通过调节时间、温度和压力等因素来控制基质的沉积，从而获得高度可重复的结果。一次升华实验通常需要5至20分钟，具体时间取决于所选基质的类型，且该基质可在废弃前多次重复使用。该装置可商业购得，价格仅为自动喷涂仪的一小部分，且易于拆卸，便于清洁和维护。由于该基质沉积技术成本低且操作相对简单，因此非常适合刚开始或正在拓展MALDI成像质谱（IMS）中脂质成像应用的研究人员。尽管已有文献报道了用于IMS的组织升华技术方案11，但目前仍缺乏标准化的操作流程，特别是针对在负离子模式下对高分子量脂质进行成像时所涉及的基本升华实验步骤，导致在没有大量试错的情况下难以建立该技术。以下实验方案旨在填补这一空白，提供将DAN基质升华沉积至大鼠脑切片上，用于高分辨率成像及神经节苷脂检测的详细操作流程。
图2：升华装置。 升华装置的实物照片（A）和示意图（B）。真空泵通过橡胶管连接至装有300 mL乙醇的冷阱，冷阱再通过橡胶管连接至升华装置。该装置由两个独立的玻璃部件组成，通过金属U型接头密封连接。升华仪的上半部分包含冷凝器，其中填充冰泥。样品板用胶带固定在密封玻璃装置内部的冷凝器底部。升华仪下半部分放置DAN基质，均匀铺开并朝向样品板。升华过程中，将玻璃装置置于沙浴上，沙浴由正下方的加热板加热至140 °C。温度探头通过反馈沙浴温度与实验预设温度的比较，帮助在整个升华实验过程中维持稳定的温度。请点击此处查看该图的放大版本。
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方案
以下所述的所有动物操作程序均遵守西安大略大学动物护理委员会（2016-014）的规定。
1. 组织制备与切片
- 通过一种称为“新鲜冷冻提取”（FFE）的方法从大鼠中提取脑组织。
- 使用过量的戊巴比妥钠处死大鼠，并监测其四肢的反射。当所有反射完全停止后，使用断头器切断大鼠头部。
- 使用手术刀小心分离颅骨上的肌肉和其他组织。使用骨剪钳从颅底（枕骨大孔）向前部逐步破碎颅骨以暴露脑组织。
- 脑组织暴露后，用外科刮勺小心将其取出，并立即置于粉碎的干冰上进行速冻。
注意：脑组织此时非常柔软易变形。因此，在将其放置于干冰上时需格外小心。若脑组织被挤压或压在表面上，其形状将发生改变并在此位置冻结。
- 从 -80°C 冰箱中取出未经灌注甲醛或包埋于OCT中的新鲜冷冻组织，并置于干冰上。
- 在冷冻切片机持样器上滴加数滴水，并将其放置于干冰或冷冻切片机冷冻条上。当水开始结冰时，轻轻将组织压在持样器上，并保持至水在组织基部周围冻结并将其固定。如有必要，可添加额外的水以进一步加固组织在持样器上的位置。
注意：使用水而非OCT介质来固定组织，是为了避免因OCT中化合物污染组织而影响目标信号的检测。 - 将组织置于冷冻切片机中，切片至所需的解剖位置。确保切片厚度在 8 - 12 µm 之间。
注意：在共用冷冻切片机设备中进行切片时，必须使用独立的刀片、刷子、防卷板和持样器，以避免包埋化合物的交叉污染。使用前还应使用乙醇彻底清洁冷冻切片机内部。 - 使用冷冻切片机的防卷板缓慢切下展平的组织切片。若防卷板位置不当或刀片钝化，可能导致切片出现孔洞或划痕。使用洁净的画笔将切下的组织移至切片平台中央。
- 贴片
- 将导电载玻片或金属板放入冷冻切片机中冷冻。当载玻片完全冻结后，使用洁净的画笔小心将切好的组织转移至载玻片的导电表面。待所有组织切片在载玻片上正确排布后，将手指置于载玻片下方、与组织相对的位置，轻轻按压，直至切片解冻贴附。
注意：采用此贴片方法时，切片在解冻过程中可能发生折叠或卷曲。可通过在冷冻切片机内完成解冻过程来减轻该问题。若上述问题较为严重，可参考下方列出的替代性温贴法。 - 或者，取一张室温下的氧化铟锡（ITO）导电载玻片（或金属板），将其导电面朝下，轻轻压在切片平台表面的冷冻组织切片上。这将使组织切片均匀解冻并贴附于载玻片表面，显著减少卷曲或折叠现象。
注意：采用此方法贴片时，切片下方可能出现冷凝水，可能导致某些蛋白质和脂质的丢失。
- 将导电载玻片或金属板放入冷冻切片机中冷冻。当载玻片完全冻结后，使用洁净的画笔小心将切好的组织转移至载玻片的导电表面。待所有组织切片在载玻片上正确排布后，将手指置于载玻片下方、与组织相对的位置，轻轻按压，直至切片解冻贴附。
- 将带有组织的载玻片放入干燥器中，放置 5 - 10 分钟。
2. 升华装置的搭建
注意：请在通风橱中进行这些步骤。
- 将沙浴置于铝制容器中，再将铝制容器放置在加热板上，加热板位于具有适当表面积的金属剪刀式升降台上即 大于加热板）。打开加热板，将温度设为 140 °C.
注意：DAN 基质的熔点为 187 - 190 °C. 切勿超过加热板的此温度。- 如果加热板配有温度反馈探针，请使用该探针在整个实验过程中监测沙浴温度，以确保温度的一致性。该功能有助于提高不同升华实验之间的实验可重复性。
注意：沙浴应置于铝制容器中，因为玻璃容器在高温下可能破裂。
- 如果加热板配有温度反馈探针，请使用该探针在整个实验过程中监测沙浴温度，以确保温度的一致性。该功能有助于提高不同升华实验之间的实验可重复性。
- 将300 mg的DAN基质置于升华装置的底面上。将基质放置在装置中央，并均匀铺展成一层，其大致宽度和长度与待升华的载玻片相同。
注意：DAN基质具有毒性，因此在操作粉末状基质时必须始终佩戴手套、口罩和护目镜。DAN应避光保存，因其对光敏感。 - 将金属板用胶带固定在装置内表面，使金属板与冷凝器底部直接接触，以确保在升华过程中载玻片表面温度冷却均匀。或者，可将冷凝器底部打磨以确保其表面平整。
- 将胶带沿载板外边缘放置，并粘附于内层玻璃器皿的侧壁。若将胶带置于载板下方并粘附在内层玻璃表面的底部，可能导致温度分布不均，进而引起载玻片表面基质分布不均。
- 用胶带将空白（测试）载玻片以对角线方向固定在金属板表面，胶带仍置于载玻片的外边缘。
- 将装置的上部和下部连接，中间放置橡胶O形圈以确保完全密封。
- 在装置中心位置放置一个金属U型接头，拧紧夹具，使装置的上下两部分紧密密封。将装置置于沙浴上方的金属O型圈上。
- 取一把碎冰放入冷凝器中。填充冷凝器 ¼ 至 ½ 用冷水注满以形成冰泥。冰泥将冷却装置内部的金属板，进而冷却粘附在其上的载玻片。等待至少5分钟，使温度达到稳定状态。
- 向冷阱容器中倒入 300 mL 乙醇，并将玻璃器皿放入容器内。向冷阱容器底部的乙醇中加入 2 - 3 小块干冰。冷阱的进气口配有延伸至筒体底部的玻璃管，而出气口则没有。
- 使用橡胶管将真空泵连接至冷阱的出口。使用另一段橡胶管将冷阱的入口连接至升华装置。如有金属夹，应确保使用金属夹牢固固定管路。
- 使用真空泵将系统抽真空至30 - 50 mT。保持真空泵运行至少5分钟，以使压力达到平衡。由于装置内压力降低，在开启真空泵后，可能需要再次拧紧升华装置U型环上的夹具。
注意：建议将真空计连接至泵上，以监测实验过程中真空压力并检测是否存在漏气，从而确保实验间尽可能高的可重复性。然而，大多数泵设计为可维持恒定压力，因此对于有经验的使用者而言，真空计可能并非必需。此外，可使用真空密封脂以帮助维持真空压力。
3. 升华
- 确保沙浴温度已稳定在 140 °C，并且装置已固定在沙浴上方的金属 O 形圈上，所有管路均已连接且真空泵已开启。
- 设置计时器为 7 分钟，但暂不启动计时器。缓慢升起剪式升降台和沙浴，直至升华装置的 U 形接头明显高于金属 O 形圈。预留的额外空间可用于在沙子上调整装置的位置。
- 迅速但轻柔地将升华装置压在沙子表面，以确保装置在沙子上平稳放置，然后立即启动计时器。
- 当计时器响起时，关闭真空泵，并小心降低剪式升降台，直至升华装置不再接触沙浴，且已安全固定在金属 O 形圈中。
- 缓慢打开微通气阀以释放装置内的压力。松开升华装置橡胶管上的金属夹，并缓慢开始松开橡胶管。当橡胶管略微松动后，将其向一侧弯曲，以使残余压力得以释放。
- 当压力恢复至环境大气压时，小心地将橡胶管从升华装置上取下。
- 松开装置 U 形接头上的夹具并取下。小心地将升华装置的两半分开，并从内层玻璃器皿顶部取下载玻片。检查载玻片以确认基质分布均匀。
注意：如果基质分布不均，可重新调整升华装置底部的粉末基质位置，或在沙子上重新调整装置位置以用于下一张载玻片。同一份基质粉末可重复进行多次升华，但随着反复受热，基质颜色会逐渐变深，粉末量也会减少，因此需要略微调整升华时间以作补偿。因此，每次实验后应监测升华的基质量，以确保各载玻片之间基质沉积的一致性。 - 如果升华的基质分布和量均足够，则将一张带有组织的新载玻片用胶带固定在升华装置内侧，并重复第 3 节操作。
注意：出于质量控制（QC）目的，每次实验后可通过称量载玻片在升华前后的重量，并将升华基质的重量除以载玻片表面积来测量升华基质的量2。需要注意的是，由于大多数天平在小数点后四位以上的精度有限，且不同天平之间存在差异，因此这些测量值仅可作为优化基质沉积的参考，而不能作为完全可量化的质量控制手段，除非使用高精度天平（见 Figure 3）。
4. 组织储存/再水化
- 升华后，将载玻片存放在密封容器或小型盒匣中，并置于密封塑料袋内。
- 将载玻片在 -20 °C 冰箱中孵育 2 小时 或过夜。
注意：冷冻过程的目的是作为组织材料从基质中脱附的再水合步骤。已有研究表明，将样品在 -80 °C 下储存时，该冷冻过程可防止脂质信号降解长达 1 周12。因此，在一定程度上可根据实验人员的需求调整样品在冰箱中的储存时间，而不会显著影响信号检测（本实验室观察结果）。然而，我们注意到当样品在 -20 °C 下冷冻超过 24 小时后，基质会出现一定程度的变色。因此，建议在 24 小时内对升华后的组织进行成像，或在需要较长时间孵育时将组织存放在 -80 °C 下。 - 从冰箱（及容器）中取出载玻片，放入干燥器中放置 5 - 10 分钟。
5. 成像与分析
- 从干燥器中取出载玻片，并施加仪器标准品以确保成像过程中基质辅助激光解吸电离（MALDI）仪器的质量准确性。标准品的类型将根据具体仪器而有所不同。通常将标准品均匀地施加在整个载玻片上，围绕待成像的组织区域（图 3D）。
- 将载玻片插入MALDI仪器中，并按照制造商的说明进行成像实验（仪器方法应针对1,000 - 2,000质量范围进行优化）。代表性结果（图 4）是在反射负离子模式下获取的，光栅步长为70 µm，每谱采集20次激光 shot（采集时间约2 h）。
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结果
升华实验完成后，应在通风橱中将玻璃装置的两半分开，并取下固定在冷凝器上的载玻片（图 3A）。此时应检查基质分布是否均匀，必要时可调整下一张载玻片实验时的升华时间、温度或装置在沙浴中的位置。成功的 DAN 升华实验应在载玻片表面形成均匀的灰褐色基质涂层，组织的解剖结构可清晰可见，且载玻片上的基质量与组织上的基质量相近（图 3B）。例如，若组织上沉积的基质过多，基质厚度将掩盖组织特征，仅能辨识其大致轮廓；反之，若基质沉积过少，组织区域将比载玻片其余部分颜色更深（图 3C）。基质过多或过少均会导致 MALDI 仪器中信号质量下降。为进行质量控制，Thomas et al. 称量了沉积在载玻片上的基质量，并将其除以载玻片的表面积。他们报告了多种基质（包括 DAN）的最佳沉积量为 110 µg/cm²2。尽管大多数天平缺乏精确复现该结果所需的精度，我们亦曾尝试采用此质量控制方法，但由于变异性较高，仅能建议一个与 DA...
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讨论
本研究详细阐述了一种用于基质辅助激光解吸电离成像质谱（MALDI IMS）实验中检测带负电荷脂质（如神经节苷脂）的组织基质升华标准化操作流程。MALDI IMS 的样品制备方法具有高度可变性，必须根据目标分析物的独特性质进行个性化优化。将基质施加到组织样品表面是样品制备过程中影响成像质谱结果质量的关键环节。在选择基质时需格外谨慎，应确保所选基质与目标分析物相容，并且在质谱图中不会产生基质来源的干扰信号。升华法是一种干法基质沉积技术，可实现高度均匀的基质晶体分布，同时几乎不会引起组织中脂质的位移。特别是 DAN 基质，对一类称为神经节苷脂的带负电荷膜脂具有很高的解吸灵敏度，这已在大鼠脑切片中得到验证；此外，DAN 基质在真空条件下长时间保持稳定，因而适用于绝大多数成像应用。DAN 基质的另一优势在于其对带正电荷的脂质种类也具有高亲和力，从而提高了该基质在 MALDI IMS 应用中的广泛适用性2。还应注意的是，采用此 IMS 操作流程可同时检测多种脂质种类，包括磷脂。
此前已发表一项关于DAN基质与其他9种常用基质特性的系统比较研究
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢西安大略大学MALDI质谱平台的Kristina Jurcic提供的技术协助，同时也感谢自然科学与工程研究委员会（NSERC）对本研究的资金支持。作者还要感谢范德堡大学（田纳西州）的Caprioli团队和蒙特利尔大学（魁北克省）的Chaurand团队，他们在优化本文所述升华技术方面提供了宝贵建议。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 升华器 | Chemglass Life Sciences | CG3038-01 | |
| 1,5-二氨基萘（DAN）基质 | Sigma-Aldrich | D21200 | 100 G |
| 冷冻切片机 | Thermo-Fisher Scientific | CryoStar NX50 | |
| 带温度反馈的加热板 | Thermo-Fisher Scientific | HP88857290 | Isotemp ADVD 7x7 HP 100 - 120 V |
| 不锈钢千斤顶 | Thermo-Fisher Scientific | 2216479 | 10x10 |
| 冷阱 | 现场定制 | ||
| 真空泵 | Franklin Electric | 1102180403 | Savant VP100 两级 |
| 氧化铟锡（ITO）载玻片 | Hudson Surface Technology | PSI 1111000 | II型，1.1 mm/每盒25片 |
| MALDI TOF/TOF 5800 仪器 | AB Sciex | ||
| 干燥器 | Sigma-Aldrich | D2797 | 台式干燥器 |
参考文献
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