新生大鼠幼崽神经发育反射测试

摘要

行为学测试是判断脑损伤后结局的金标准，能够识别婴儿和儿童发育障碍的存在。神经发育反射是这些异常的早期指标。本文开发并描述了一系列在新生啮齿类动物中易于实施的发育反射测试。

摘要

神经发育反射测试在临床实践中常用于评估神经系统的成熟程度。神经发育反射也被称为原始反射。这类反射具有较高的敏感性和与后期结局的一致性。异常反射表现为反射的缺失、持续存在、重新出现或潜伏期异常，这些均可作为预测婴儿存在神经发育障碍高风险的指标。神经发育障碍的动物模型（如脑性瘫痪模型）通常会表现出发育反射的异常，这与人类婴儿中观察到的情况相似。本文所述技术可用于评估新生大鼠的多种神经发育反射。神经发育反射测试为研究者提供了一种在如此年幼的动物中难以获得的检测方法。本文介绍的方法旨在帮助研究者通过观察新生大鼠的发育里程碑，以识别早期脑损伤或评估治疗干预的效果。本文所提供的方法旨在为研究者提供一个通用的操作指南。

引言

神经发育反射或发育里程碑是用于人类新生儿和婴儿的最早评估方法之一。神经反射是不受意识控制且重复性的动作，可反映脑干和脊髓的反射功能。随着迁移、髓鞘化和突触发生的不断演进，高级皮层网络逐渐成熟，促进自主控制和皮层抑制功能的发展。中枢神经系统正常发育进程的改变可能干扰大脑发育，导致皮层连接异常、功能障碍和髓鞘化异常，从而引起神经发育反射的延迟或缺失。具有神经发育障碍高风险的人类婴儿常表现出异常的早期反射。异常反射可表现为获得延迟、反射缺失、持续存在时间过长或在生命后期重新出现，这些均提示可能存在发育障碍。^1,2 因此，在神经发育障碍的实验模型中模拟反射延迟具有重要意义。

啮齿类动物常被用作实验模型。新生大鼠幼崽属于晚成性动物，出生时发育程度较低，无法完成特定或复杂的运动、感觉和/或认知行为任务。这种发育不成熟与其身体和器官的发育状态密切相关。大鼠出生时无毛发，无法调节体温，眼睛未睁开，也不能行走。就脑部发育而言，大脑皮层的显著成熟过程主要发生在出生后。研究表明，新生大鼠幼崽（出生日定义为出生后第1天，PD1）的脑发育水平相当于妊娠23至28周的早产儿大脑，而出生后第7至10天（PD7–10）的幼崽脑发育水平则相当于接近足月的新生儿大脑。 ^3,

方案

阿尔伯塔大学健康科学动物护理与使用委员会批准了所有动物实验研究。

注意：尽管本方案可适用于其他物种和品系，但本文所述方案专为Long-Evans大鼠编写。研究表明，与其他啮齿类品系相比，该品系大鼠具有更优越的运动表现和视觉敏锐度 ^25,26。定时妊娠、饮食补充、母体炎症及神经发育反射的实验方案如下。

1. 实验动物

1. 大鼠到达动物饲养设施后，应避免与其接触一到两天，以使其适应新环境。适应环境后，每天对大鼠进行操作，持续约五天，或直至大鼠不再表现出应激迹象。人为引起的应激可能改变实验结果，并导致妊娠丢失。
2. 待大鼠状态稳定后，开始繁殖。将两只雌鼠和一只雄鼠放入双层繁殖笼中过夜（下午3点至次日上午8点）（笼高38 cm，底面积1,800 cm²）。此类笼具可防止应激和过度拥挤。次日早晨，使用移液管将约0.25 mL生理盐水冲洗雌鼠阴道，将冲洗液转移至微量离心管中。
3. 将两只雌鼠和雄鼠放回各自的标准饲养笼中。
4. 在光学显微镜下（100倍）观察步骤1.2中收集的液体，以确定大鼠所处的动情周期阶段以及是否存在精子。若发现精子，将该日记录为胚胎发育第1天（E1）（图1

结果

本实验设计的时间线如下所示 图2. ³⁰ 该方法与结果此前已被发表。 ³⁰ 本研究的目的是评估在妊娠期和断奶前期间通过饮食补充西兰花芽是否能够保护子代免受由...引起的神经发育迟缓 在子宫内 暴露于LPS。对妊娠时间明确的大鼠给予腹腔注射生理盐水（对照组， 100 µL）或 LPS（200 µg/kg 稀释于 100 μL 在E19和E20每12小时注射一次无菌生理盐水（100 μL）。随机选取的妊娠母鼠从E14至产后第21天（PD21）每天给予200 mg干燥的西兰花芽苗粉作为膳食补充。使用LPS模拟母体炎症，同时给予西兰花芽苗粉作为潜在的治疗干预措施以保护子代。幼鼠于E23自然分娩出生即，PD1）并记录出生体重（表1）。从出生后第3天（PD3）开始，幼鼠接受一系列神经发育反射测试，反射获得的定义为该反射出现的天数（

讨论

神经发育反射测试是预测皮层发育和成熟异常的一种指标，在无明显神经病理表现的情况下可能具有重要意义。进行神经发育测试时，必须确保每天在同一时间对幼鼠进行检查。大鼠为夜行性动物，因此若在一天中不同时间进行测试，其昼夜节律可能影响测试表现³⁴。测试应在安静的房间内完成，因为噪音会增加幼鼠的应激反应³⁵。幼鼠需要至少1小时来适应新环境，因为运输、人为操作以及新环境均可能引发其应激反应³⁵。此外，测试过程中幼鼠应直接置于加热灯下或加热垫上。幼鼠年龄越小，体温调节能力越差³⁶。因此，在出生后第3天（PD3）进行翻正反射测试时给予15秒，在出生后第6天（PD6）进行步态测试时给予30秒³⁶。另外，对照组幼鼠出生时不应存在生长受限情况，因为体重是一个混杂因素。每窝幼鼠数量应调整为8至10只，以保证营养供给均等且性别比例具有代表性。幼鼠出生后，应给予母鼠一天时间与幼鼠建立亲子关系，以防止母鼠忽视幼仔。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
繁殖
移液管	Fisherbrand	12-711-9AM	用于阴道冲洗。
无菌生理盐水	Hospira	7983254	用于阴道冲洗过程中收集细胞的溶液。
400 µL 微量离心管	Fisherbrand	05-408-120	用于盛装生理盐水溶液。
光学显微镜	Leica	Leica ATC 2000	用于观察生理盐水溶液。可使用实验室中任何光学显微镜。
载玻片	Fisherbrand	12-552-5	将生理盐水溶液置于载玻片上。可使用实验室中任何载玻片。
盖玻片	Fisherbrand	12-545-F	用于覆盖载玻片。可使用实验室中任何盖玻片。
饮食补充
西兰花种子	Mumm's Sprouting Seeds		订购西兰花种子并在实验室中培养。
台面种子发芽盒	Mumm's Sprouting Seeds		用于种子收获前的发芽和生长。
250 mL 烧杯			用于浸泡种子。可使用任何尺寸合适且能容纳种子的烧杯。
母体炎症
脂多糖（LPS）	Sigma	L3129	用于模拟母体炎症的内毒素。
1 mL 注射器	BD Syringe	309659	用于给怀孕大鼠注射。
针头规格（30 G x 1/2）	BD PrecisionGlide Needle	305106	使用最小规格的针头以避免疼痛和不适。
无菌生理盐水（0.9% 氯化钠，USP）	Hospira		用于溶解 LPS。
体重测量
天平	Denver Instrument		用于记录体重。可使用实验室中任何具有两位小数精度的天平。
神经发育反射
细钝棒			可使用回形针或牙签。用于前肢和后肢抓握测试。
圆形滤纸	Whatman	1001 150	直径 15 cm 的滤纸，用于步态分析。
计时器	Fisher Scientific	06-662-51	用于计时翻正反射和步态测试的时间。
钝面			可使用桌子边缘。用于后肢放置和悬崖回避测试。
泡沫着陆垫			用于幼鼠进行加速翻正测试时的缓冲着陆。
录像设备	Sony	VCT-D580RM	用于记录所有测试的反射行为。必须能够以每秒 1/1,000 帧的速度录制。
铃铛			用于听觉惊跳反应测试。
加热灯或加热垫			用于维持接受检查幼鼠的体温。