新生大鼠幼崽神经发育反射测试

摘要

行为学测试是判断脑损伤后结局的金标准，能够识别婴儿和儿童发育障碍的存在。神经发育反射是这些异常的早期指标。本文开发并描述了一系列在新生啮齿类动物中易于实施的发育反射测试。

摘要

神经发育反射测试在临床实践中常用于评估神经系统的成熟程度。神经发育反射也被称为原始反射。这类反射具有较高的敏感性和与后期结局的一致性。异常反射表现为反射的缺失、持续存在、重新出现或潜伏期异常，这些均可作为预测婴儿存在神经发育障碍高风险的指标。神经发育障碍的动物模型（如脑性瘫痪模型）通常会表现出发育反射的异常，这与人类婴儿中观察到的情况相似。本文所述技术可用于评估新生大鼠的多种神经发育反射。神经发育反射测试为研究者提供了一种在如此年幼的动物中难以获得的检测方法。本文介绍的方法旨在帮助研究者通过观察新生大鼠的发育里程碑，以识别早期脑损伤或评估治疗干预的效果。本文所提供的方法旨在为研究者提供一个通用的操作指南。

引言

神经发育反射或发育里程碑是用于人类新生儿和婴儿的最早评估方法之一。神经反射是不受意识控制且重复性的动作，可反映脑干和脊髓的反射功能。随着迁移、髓鞘化和突触发生的不断演进，高级皮层网络逐渐成熟，促进自主控制和皮层抑制功能的发展。中枢神经系统正常发育进程的改变可能干扰大脑发育，导致皮层连接异常、功能障碍和髓鞘化异常，从而引起神经发育反射的延迟或缺失。具有神经发育障碍高风险的人类婴儿常表现出异常的早期反射。异常反射可表现为获得延迟、反射缺失、持续存在时间过长或在生命后期重新出现，这些均提示可能存在发育障碍。^1,2 因此，在神经发育障碍的实验模型中模拟反射延迟具有重要意义。

啮齿类动物常被用作实验模型。新生大鼠幼崽属于晚成性动物，出生时发育程度较低，无法完成特定或复杂的运动、感觉和/或认知行为任务。这种发育不成熟与其身体和器官的发育状态密切相关。大鼠出生时无毛发，无法调节体温，眼睛未睁开，也不能行走。就脑部发育而言，大脑皮层的显著成熟过程主要发生在出生后。研究表明，新生大鼠幼崽（出生日定义为出生后第1天，PD1）的脑发育水平相当于妊娠23至28周的早产儿大脑，而出生后第7至10天（PD7–10）的幼崽脑发育水平则相当于接近足月的新生儿大脑。 ^3,4,5,6 这种相关性基于大体解剖学分析，然而，其他脑成熟度的评估指标，如髓鞘化程度和振幅整合脑电图，也已有相关描述。 ^5,7 例如，前少突胶质细胞是23至32周发育中的人类胎儿大脑中的主要细胞 在子宫内，这一成熟阶段对应于出生后第1-3天（PD1-3）的啮齿类动物。 ^5,8,9,10 此外，髓鞘化开始 在子宫内 在人类中，而在大鼠幼崽中，它大约在出生后第7至10天出现在前脑；新生啮齿类动物的大脑基本上仍处于无髓鞘状态。 ^11,12 塔克 等 发现P1大鼠的振幅整合脑电图模式与23周孕龄的人类胎儿相似，而PD7和PD10幼鼠则分别类似于30至32周及足月婴儿。⁷ 因此，对新生大鼠幼崽进行新生儿反射测试，为研究脑发育的个体发生过程及/或发育干扰提供了机会。

以下描述的反射测试系列改编自 W.M. Fox 和 A. Lubics 的研究^13,14。W.M. Fox 是最早研究小鼠反射发生过程的研究者之一 ¹³。这些反射包括但不限于肢体抓握与放置、悬崖回避、翻正反射、加速翻正、步态、听觉惊跳、姿势和睁眼。前肢和后肢抓握（在人类中分别称为手掌抓握和足底抓握）由脊髓反射以及非初级运动区的皮质脊髓抑制所介导 ^15,16。后肢放置（足底反射）反映皮质脊髓束的成熟过程 ^16,17,18。悬崖回避（保护性反应）、翻正反射（迷路反射）和加速翻正涉及感觉输入与运动输出之间的整合与协调（例如与触须系统和前庭系统相关的通路） ^19,20,21。步态反映运动能力¹⁴。听觉惊跳用于评估声学刺激以及脑桥尾侧网状核中巨大神经元的突触连接²¹。姿势涉及适当的皮质-脊髓/脊髓-皮质投射、肌肉力量以及神经肌肉支配 ^22,23。gamma-氨基丁酸受体的成熟可能与睁眼相关²⁴。需要牢记的是，这些反射反映的是更为复杂的神经网络，此处仅提供一般性关联。此外，这些反射为评估极幼龄阶段的神经系统发育提供了一种快速且简便的方法，而在这些阶段更复杂的行为学测试尚不可行。

本文的目的是提供一种神经发育反射测试的通用指南，可轻松整合到新生大鼠实验研究中。所述方法在Long-Evans新生大鼠幼崽中实施，结果的量化基于反射首次出现的日期。反射测试的起始时间及所用设备可根据不同的实验模型（如不同品系或物种）进行适当调整。通过建立特定动物模型中反射成熟的正常生理进程，研究人员可评估外界应激因素、内源性干预和/或治疗性干预对新生大鼠模型神经发育的影响。总体而言，利用反射作为脑成熟度的判断指标，有助于预测围产期脑损伤，并能反映后续的神经发育结局。

方案

阿尔伯塔大学健康科学动物护理与使用委员会批准了所有动物实验研究。

注意：尽管本方案可适用于其他物种和品系，但本文所述方案专为Long-Evans大鼠编写。研究表明，与其他啮齿类品系相比，该品系大鼠具有更优越的运动表现和视觉敏锐度 ^25,26。定时妊娠、饮食补充、母体炎症及神经发育反射的实验方案如下。

1. 实验动物

1. 大鼠到达动物饲养设施后，应避免与其接触一到两天，以使其适应新环境。适应环境后，每天对大鼠进行操作，持续约五天，或直至大鼠不再表现出应激迹象。人为引起的应激可能改变实验结果，并导致妊娠丢失。
2. 待大鼠状态稳定后，开始繁殖。将两只雌鼠和一只雄鼠放入双层繁殖笼中过夜（下午3点至次日上午8点）（笼高38 cm，底面积1,800 cm²）。此类笼具可防止应激和过度拥挤。次日早晨，使用移液管将约0.25 mL生理盐水冲洗雌鼠阴道，将冲洗液转移至微量离心管中。
3. 将两只雌鼠和雄鼠放回各自的标准饲养笼中。
4. 在光学显微镜下（100倍）观察步骤1.2中收集的液体，以确定大鼠所处的动情周期阶段以及是否存在精子。若发现精子，将该日记录为胚胎发育第1天（E1）（图1）。若确认怀孕，于E14天为雌鼠提供单独饲养的笼具。
   注意：阴道涂片中的细胞透明，因此应使用较低的光照强度。确保聚光镜调节至最低位置，并调节亮度控制以降低光线强度。若设备配备亮度调节旋钮，应将其设置为1。

2. 饮食补充

注意：本方案旨在评估妊娠末期食用膳食用西兰花芽苗的治疗效果。西兰花芽苗的培养方法请参照 Wu et al. ²⁷。

1. 将西兰花种子浸泡 2 - 3 小时。将种子均匀铺在台面用的种子发芽盒中，并置于温暖处以促进萌发。
2. 每天浇水两次，分别在上午（8 - 9 点）和下午（15 - 16 点）各一次。
3. 第 5 天，将发芽的种子放置于窗边一整天（此时芽苗应已长出两片叶子，并在当天逐渐变绿）。
4. 当天结束时，轻轻将西兰花芽苗从筛盒中取出，平铺于表面晾干。
5. 待芽苗完全干燥后，称取 200 mg 并放入密封塑料袋中保存。
6. 从胚胎第 14 天（E14）开始，每天给每只怀孕大鼠喂食 200 mg 干燥的西兰花芽苗，持续至出生后第 21 天（PD21，即幼鼠断奶日）。

3. 炎症

1. 为了诱导炎症并使子代出现白质损伤，在妊娠第19天（E19）和第20天（E20）每12小时向怀孕大鼠注射一次脂多糖（LPS）。注射当天，将鼠笼从饲养室移至实验室，让怀孕大鼠适应环境并安静至少1小时。 如果大鼠出现永久性全身或肾脏损伤的临床症状，应立即实施安乐死并从研究中剔除。 
2. 称量怀孕母鼠的体重。
3. 将200 µg/kg的LPS（血清型0127:B8）溶解于100 µL生理盐水中。用配备30 G ½针头的1 mL注射器吸取该溶液。
   1. 每次注射均使用新针头。让溶液静置数分钟以达到室温，从而减少注射不适。
4. 记录注射时间，并对怀孕母鼠进行腹腔注射。交替在左右两侧注射，以确保药物分布均匀。
   注：Machholz et al. 描述了正确的固定和注射操作方法。 ²⁸

4. 发育反射测试

1. 在出生后第1天（PD1，出生当天），将幼鼠从母鼠身边取出并记录出生体重。随后将幼鼠放回各自笼中，并转移至动物房饲养至出生后第3天（PD3），以确保母鼠与幼鼠之间的亲子联系。
   1. 记录反射测试以进行可靠评估。调整摄像机，使其快门速度达到最高（1/1,000 秒），以便进行逐帧分析。将摄像机置于幼鼠正上方或侧方，确保能完整记录每项反射测试所用的所有材料及操作过程。例如，在进行后肢放置反射测试时，应将摄像机置于幼鼠侧面，以清晰捕捉后肢抬起和放置的动作。
   2. 在进行加速翻正反射测试时，将摄像机置于幼鼠和软垫着陆区的正上方，以记录幼鼠在空中翻正的能力。
2. 每日记录体重直至实验结束。在PD3开始进行神经发育反射测试（图4）。测试前至少将笼子移至安静房间1小时，使幼鼠适应环境。
3. 由于大鼠为夜行性动物，每日应于固定时间进行神经发育反射测试。例如，每天上午9:00至12:00之间进行测试。测试过程中始终将幼鼠置于加热灯下或加热垫上，以维持其体温稳定在36.5 °C；此阶段的幼鼠极易散热。使用直肠温度探头进行测量。 若操作迅速，则幼鼠体温不会发生明显变化，因其未脱离母鼠和同窝幼鼠过久。注意：需监测加热灯温度，确保不超过37 °C。
   1. 每日记录每项反射的评分，直至观察到阳性反应。当幼鼠连续两天能够完成某项任务时，即视为出现阳性反射反应。以首次出现阳性反应的日期作为量化依据。一旦出现阳性反应，无需再进行后续测试。因此，每项反射的测试终止日期可能不同。
4. 前肢抓握反射
   1. 从PD3开始进行前肢抓握反射测试。将一根钝头棒置于每只前爪掌心，并手动施加轻微压力。轻压应使前爪略有位移，以确保接触并使幼鼠感知到棒的存在。抓握表现为所有脚趾围绕棒屈曲。当双侧前爪连续两天均能成功抓握棒时，视为该反射成功获得。
   2. 前肢抓握评分标准：
      0分：无抓握动作
      1分：单侧前爪成功抓握（可注明左或右前爪）
      2分：双侧前爪均成功抓握
5. 后肢抓握反射
   1. 从PD3开始进行后肢抓握反射测试。将一根钝头棒置于每只后爪足底，并手动施加轻微压力。轻压应使后爪略有位移，以确保接触并使幼鼠感知到棒的存在。成功抓握表现为脚趾围绕棒屈曲。当双侧后爪连续两天均能成功抓握棒时，视为该反射成功获得。
   2. 后肢抓握评分标准：
      0分：无抓握动作
      1分：单侧后爪成功抓握（可注明左或右后爪）
      2分：双侧后爪均成功抓握
6. 翻正反射
   1. 从PD3开始进行翻正反射测试。牢固地将幼鼠以仰卧位持握，四肢朝上。松开幼鼠的同时立即启动计时器。当幼鼠能够翻身或滚动至四肢着地，且每只脚均与身体垂直时，视为完成翻正。每只幼鼠最多给予15秒完成该动作。
   2. 翻正反射评分标准：
      0分：仰卧不动（或耗尽15秒最大时限）
      1分：侧卧（可注明左侧或右侧），或虽能翻正但姿势不正确（或耗尽15秒最大时限）
      2分：成功翻正并保持正确姿势
7. 后肢放置反射
   1. 从PD4开始进行后肢放置反射测试。用手握住幼鼠躯干，使其垂直悬空。用钝面（如桌面边缘）轻轻划过后爪背侧。正确的放置反射表现为幼鼠收回受刺激的后肢，随后将该后肢放置于接触面上。
   2. 后肢放置反射评分标准：
      0分：无成功放置
      1分：单侧后爪成功放置（可注明左或右后爪）
      2分：双侧后爪均成功放置
8. 悬崖回避反射
   1. 从PD4开始进行悬崖回避测试。将幼鼠置于平坦表面边缘，使其前爪和鼻部悬于边缘之外。正确反应为保护性回避行为，即幼鼠主动远离悬崖边缘。 实验者应在悬崖下方用手或泡沫垫接住幼鼠，防止其跌落。
   2. 悬崖回避评分标准：
      0分：无移动或跌落悬崖
      1分：试图远离悬崖但肢体悬空
      2分：成功远离悬崖
9. 步态
   1. 从PD6开始进行步态评估。将幼鼠置于直径15 cm的圆圈中心，给予30秒时间完成任务。¹⁴ 若幼鼠在30秒内将双侧前爪均移出圆圈外，则视为步态成功。
   2. 步态评分以幼鼠将双侧前爪移出圆圈所需时间（秒）记录。若幼鼠未能在规定时间内完成任务，则记为30秒。
10. 听觉惊跳反射
    1. 从PD10开始进行听觉惊跳反射分析。在幼鼠正上方发出响亮声音（如铃声），观察是否出现惊跳反应。阳性反应表现为幼鼠出现远离声源的“抽动”动作。
    2. 听觉惊跳评分：
       （否）：无惊跳反应
       （是）：出现阳性惊跳反应
11. 姿势
    1. 从PD12开始进行姿势分析。将幼鼠置于不打滑的开阔表面上，观察其移动时的姿势。不成熟姿势表现为移动时腹部拖地，前肢和后肢均与身体呈垂直方向。成熟姿势表现为幼鼠能在移动时将腹部抬离表面，且前肢和后肢均向前伸直或与身体平行。
    2. 姿势评分标准：
       0分：无移动
       1分：移动时呈不成熟姿势
       2分：移动时呈成熟姿势
12. 睁眼
    1. 从PD12开始进行睁眼分析。记录双眼眼睑完全张开的日期：
       0分：眼睛不可见
       1分：单眼可见（可注明左或右眼）
       2分：双眼均可见
13. 加速翻正反射
    1. 从PD14开始进行加速翻正测试。将幼鼠以仰卧位置于距泡沫着陆垫30.48厘米高处，释放幼鼠并观察其翻正能力。翻正指幼鼠能在空中翻身至俯卧位并四肢着地。
    2. 加速翻正评分标准：
       0分：背部着地
       1分：侧身着地（可注明左侧或右侧）
       2分：四肢着地

注意：根据研究人员的研究问题，可采用不同类型的反射量化方法。反射的量化可以包括反射的初始观察、反射首次出现的日期直至消失的日期、成功完成任务所需的时间、执行速度和/或随时间推移的表现改善 ^{13, 14, 29,30,31}。在本研究中，采用反射首次出现的日期作为评分指标。在使用多产模型时，同窝幼崽由于其遗传构成、in utero 及产后环境以及营养供应情况相似，通常表现出类似的行为³²。因此，由于同窝偏差的存在，单个幼崽不能被视为独立的 n = 1 样本。同一窝内的幼崽数据可取平均值，使每窝代表一个 n = 1 ^{32, 33}。或者，也可采用混合效应模型分析同一窝内的多个幼崽，该模型能够将同窝幼崽的因素纳入统计分析 ^{32, 33}。

结果

本实验设计的时间线如下所示 图2. ³⁰ 该方法与结果此前已被发表。 ³⁰ 本研究的目的是评估在妊娠期和断奶前期间通过饮食补充西兰花芽是否能够保护子代免受由...引起的神经发育迟缓 在子宫内 暴露于LPS。对妊娠时间明确的大鼠给予腹腔注射生理盐水（对照组， 100 µL）或 LPS（200 µg/kg 稀释于 100 μL 在E19和E20每12小时注射一次无菌生理盐水（100 μL）。随机选取的妊娠母鼠从E14至产后第21天（PD21）每天给予200 mg干燥的西兰花芽苗粉作为膳食补充。使用LPS模拟母体炎症，同时给予西兰花芽苗粉作为潜在的治疗干预措施以保护子代。幼鼠于E23自然分娩出生即，PD1）并记录出生体重（表1）。从出生后第3天（PD3）开始，幼鼠接受一系列神经发育反射测试，反射获得的定义为该反射出现的天数（

讨论

神经发育反射测试是预测皮层发育和成熟异常的一种指标，在无明显神经病理表现的情况下可能具有重要意义。进行神经发育测试时，必须确保每天在同一时间对幼鼠进行检查。大鼠为夜行性动物，因此若在一天中不同时间进行测试，其昼夜节律可能影响测试表现³⁴。测试应在安静的房间内完成，因为噪音会增加幼鼠的应激反应³⁵。幼鼠需要至少1小时来适应新环境，因为运输、人为操作以及新环境均可能引发其应激反应³⁵。此外，测试过程中幼鼠应直接置于加热灯下或加热垫上。幼鼠年龄越小，体温调节能力越差³⁶。因此，在出生后第3天（PD3）进行翻正反射测试时给予15秒，在出生后第6天（PD6）进行步态测试时给予30秒³⁶。另外，对照组幼鼠出生时不应存在生长受限情况，因为体重是一个混杂因素。每窝幼鼠数量应调整为8至10只，以保证营养供给均等且性别比例具有代表性。幼鼠出生后，应给予母鼠一天时间与幼鼠建立亲子关系，以防止母鼠忽视幼仔。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
繁殖
移液管	Fisherbrand	12-711-9AM	用于阴道冲洗。
无菌生理盐水	Hospira	7983254	用于阴道冲洗过程中收集细胞的溶液。
400 µL 微量离心管	Fisherbrand	05-408-120	用于盛装生理盐水溶液。
光学显微镜	Leica	Leica ATC 2000	用于观察生理盐水溶液。可使用实验室中任何光学显微镜。
载玻片	Fisherbrand	12-552-5	将生理盐水溶液置于载玻片上。可使用实验室中任何载玻片。
盖玻片	Fisherbrand	12-545-F	用于覆盖载玻片。可使用实验室中任何盖玻片。
饮食补充
西兰花种子	Mumm's Sprouting Seeds		订购西兰花种子并在实验室中培养。
台面种子发芽盒	Mumm's Sprouting Seeds		用于种子收获前的发芽和生长。
250 mL 烧杯			用于浸泡种子。可使用任何尺寸合适且能容纳种子的烧杯。
母体炎症
脂多糖（LPS）	Sigma	L3129	用于模拟母体炎症的内毒素。
1 mL 注射器	BD Syringe	309659	用于给怀孕大鼠注射。
针头规格（30 G x 1/2）	BD PrecisionGlide Needle	305106	使用最小规格的针头以避免疼痛和不适。
无菌生理盐水（0.9% 氯化钠，USP）	Hospira		用于溶解 LPS。
体重测量
天平	Denver Instrument		用于记录体重。可使用实验室中任何具有两位小数精度的天平。
神经发育反射
细钝棒			可使用回形针或牙签。用于前肢和后肢抓握测试。
圆形滤纸	Whatman	1001 150	直径 15 cm 的滤纸，用于步态分析。
计时器	Fisher Scientific	06-662-51	用于计时翻正反射和步态测试的时间。
钝面			可使用桌子边缘。用于后肢放置和悬崖回避测试。
泡沫着陆垫			用于幼鼠进行加速翻正测试时的缓冲着陆。
录像设备	Sony	VCT-D580RM	用于记录所有测试的反射行为。必须能够以每秒 1/1,000 帧的速度录制。
铃铛			用于听觉惊跳反应测试。
加热灯或加热垫			用于维持接受检查幼鼠的体温。