靶向 原位 酿酒酵母组蛋白基因的诱变

摘要

介绍了一种在Saccharomyces cerevisiae基因组原位对组蛋白基因进行突变的策略。

摘要

我们描述了一种基于PCR和同源重组的系统，用于在芽殖酵母细胞中对组蛋白基因进行靶向突变。所获得的突变等位基因位于其内源基因组位点，且在操作完成后基因组中不残留任何外源DNA序列。由于在单倍体酵母细胞中，四种核心组蛋白中的每一种均由两个非等位基因编码，且这些基因具有高度同源的开放阅读框（ORF），因此针对编码特定组蛋白的两个基因之一进行特异性靶向诱变可能存在困难。本文所述策略通过在同源重组步骤中利用靶基因ORF以外的序列而非其内部序列，从而规避了这一问题。该系统的另一特点是，驱动同源重组的DNA区域可设计得非常长，从而提高成功整合事件的发生概率。这些特点使该策略特别适用于组蛋白基因的诱变，但也可适用于酵母基因组中其他基因的诱变。

引言

核心组蛋白H2A、H2B、H3和H4在真核生物染色体的压缩、组织和功能中发挥着核心作用。每种组蛋白各两份共同形成组蛋白八聚体，这一分子“卷轴”可引导约147个碱基对的DNA缠绕其上，最终形成核小体¹。核小体积极参与多种基于染色体的过程，例如基因转录的调控以及常染色质和异染色质在染色体上的形成，因此在过去数十年中一直是深入研究的重点。已有多种机制被描述，表明核小体可通过这些机制被调控，从而促进特定生物学过程的执行——这些机制包括组蛋白残基的翻译后修饰、ATP依赖性的核小体重塑，以及ATP非依赖性的核小体重组与组装/去组装^2,3。

芽殖酵母Saccharomyces cerevisiae 是研究真核生物组蛋白功能的极为强大的模式生物。这主要归因于组蛋白在真核生物域内具有高度的进化保守性，以及酵母适用于多种遗传学和生物化学实验方法⁴。酵母中的反向遗传学方法已被广泛用于研究特定组蛋白突变对染色质生物学多个方面的效应。在进行此类实验时，通常更倾向于使用突变组蛋白在其天然基因组位点表达的细胞，因为由自主型质粒表达可能导致组蛋白蛋白在细胞内水平异常（由于细胞中质粒拷贝数不均），并随之改变染色质环境，最终干扰实验结果的解释。

方案

注意：靶向实验策略的 原位 组蛋白基因诱变包含多个步骤（概括如下） 图1）。这些步骤包括：（1）用目标组蛋白基因的替换 URA3 基因，（2）利用带有目标突变的引物扩增并纯化对应于目标组蛋白基因两个部分重叠片段的PCR产物，（3）通过融合PCR将两个部分重叠的片段连接，获得用于整合的全长PCR产物，（4）将全长PCR产物与骨架质粒共转化，并基于质粒上的标记进行筛选，（5）筛选对5-FOA具有抗性的转化子，（6）纯化5-FOA抗性菌落并确认骨架质粒的丢失，（7）分子分析以检测突变等位基因的正确整合。

图1：靶向策略概述 原位 酿酒酵母组蛋白基因的诱变 在此示例中，靶基因为 HHT2，但也可使用此策略对任何其他核心组蛋白基因进行诱变。A单倍体酵母细胞含有两个编码组蛋白H3的基因（HHT1 和

结果

我们以生成表达组蛋白H3突变蛋白的hht2等位基因为例，该突变蛋白在第53位氨基酸上发生由精氨酸到谷氨酸的置换（H3-R53E突变体），以此作为靶向原位诱变策略的代表性示例。

我们构建了一个菌株，其中 HHT2 的整个开放阅读框被 URA3 基因完全取代（见方案步骤1）。该菌株 yAAD156 还携带一个 his3Δ200 等位基因，导致细胞对组氨酸营养缺陷。根据方案中步骤2所述的操作流程，我们随后扩增出两个部分重叠的 HHT2 片段。用于第一片段的引物如下：正向引物（OAD20）：5' GCGTTCATTATCGCCCAATGTG 3'，反向引物（R53Erev）：5' GTTCAGTAGATTTTTGGAATtcTCTAATTTCTCTCAAG 3'。用于第二片段的引物如下：正向引物（R53Efor）：5' CTTGAGAGAAATTAGAg.......

讨论

在单倍体 S. cerevisiae 细胞中，编码四种核心组蛋白蛋白的两个非等位基因之间存在高度的序列同源性，这对希望特异性靶向其中一个基因进行诱变的研究人员构成了挑战。以往报道的酵母诱变方法，包括 Delitto Perfetto、位点特异性基因组（SSG）诱变以及无需克隆的基于PCR的等位基因替换方法^5,6,7，以及较新的基于CRISPR的酵母技术¹⁵，通常至少部分依赖靶基因ORF内的序列，以将重组或修复机制招募至目标基因组位点，最终产生突变等位基因。相比之下，本文所提出的方法利用靶向ORF两侧的DNA序列来驱动同源重组事件，从而实现突变的整合；因此，即使两个基因的ORF高度同源，该方法仍可实现对其中一个基因的更特异性靶向。这一特点使本策略特别适用于组蛋白的诱变研究。然而，该策略也可适用于酵母基因组中其他基因的诱变。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 kb DNA Ladder（DNA标准品）	New England BioLabs	N3232L
Agarose	Sigma	A5093-100G
硼酸	Sigma	B0394-500G
dNTP混合物（每种10 mM）	ThermoFisher Scientific	R0192
EDTA溶液（0.5 M，pH 8.0）	AmericanBio	AB00502-01000
乙醇（200 Proof）	Fisher Scientific	16-100-824
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）	Sigma	E4884-500G
乙酸锂二水合物	Sigma	L6883-250G
MyCycler Thermal Cycler	BioRad	170-9703
聚乙二醇（PEG）	Sigma	P3640-1KG
PrimeSTAR HS DNA Polymerase（高保真DNA聚合酶） 及5x缓冲液	Fisher Scientific	50-443-960
鲑鱼精DNA溶液	ThermoFisher Scientific	15632-011
Sigma 7-9（Tris碱，粉末状）	Sigma	T1378-1KG
三水合乙酸钠	Sigma	236500-500G
Supra Sieve GPG Agarose（低熔点琼脂糖）	AmericanBio	AB00985-00100
Taq聚合酶及10x缓冲液	New England BioLabs	M0273X
牙签	Fisher Scientific	S67859
Tris-HCl（1 M，pH 8.0）	AmericanBio	AB14043-01000
a-D(+)-葡萄糖	Fisher Scientific	AC170080025	用于酵母培养基
琼脂	Fisher Scientific	DF0140-01-0	用于酵母培养基
蛋白胨	Fisher Scientific	DF0118-07-2	用于YPD培养基
酵母提取物	Fisher Scientific	DF0127-17-9	用于YPD培养基
4-氨基苯甲酸	Sigma	A9878-100G	用于完全最小缺陷培养基
腺嘌呤	Sigma	A8626-100G	用于完全最小缺陷培养基
甘氨酸盐酸盐	Sigma	G2879-100G	用于完全最小缺陷培养基
L-丙氨酸	Sigma	A7627-100G	用于完全最小缺陷培养基
L-精氨酸单盐酸盐	Sigma	A5131-100G	用于完全最小缺陷培养基
L-天冬酰胺一水合物	Sigma	A8381-100G	用于完全最小缺陷培养基
L-天冬氨酸钠盐一水合物	Sigma	A6683-100G	用于完全最小缺陷培养基
L-半胱氨酸盐酸盐一水合物	Sigma	C7880-100G	用于完全最小缺陷培养基
L-谷氨酸盐酸盐	Sigma	G2128-100G	用于完全最小缺陷培养基
L-谷氨酰胺	Sigma	G3126-100G	用于完全最小缺陷培养基
L-组氨酸单盐酸盐一水合物	Sigma	H8125-100G	用于完全最小缺陷培养基
L-异亮氨酸	Sigma	I2752-100G	用于完全最小缺陷培养基
L-亮氨酸	Sigma	L8000-100G	用于完全最小缺陷培养基
L-赖氨酸单盐酸盐	Sigma	L5626-100G	用于完全最小缺陷培养基
L-甲硫氨酸	Sigma	M9625-100G	用于完全最小缺陷培养基
L-苯丙氨酸	Sigma	P2126-100G	用于完全最小缺陷培养基
L-脯氨酸	Sigma	P0380-100G	用于完全最小缺陷培养基
L-丝氨酸	Sigma	S4500-100G	用于完全最小缺陷培养基
L-苏氨酸	Sigma	T8625-100G	用于完全最小缺陷培养基
L-色氨酸	Sigma	T0254-100G	用于完全最小缺陷培养基
L-酪氨酸	Sigma	T3754-100G	用于完全最小缺陷培养基
L-缬氨酸	Sigma	V0500-100G	用于完全最小缺陷培养基
肌醇（myo-Inositol）	Sigma	I5125-100G	用于完全最小缺陷培养基
尿嘧啶	Sigma	U0750-100G	用于完全最小缺陷培养基
硫酸铵	Fisher Scientific	A702-500	用于完全最小缺陷培养基
酵母氮源基础	Fisher Scientific	DF0919-07-3	用于完全最小缺陷培养基
5-氟乳清酸（5-FOA）	AmericanBio	AB04067-00005	用于 5-FOA培养基