在此，我们描述了一种四阶段方案，用于将人类胚胎干细胞分化为NKX6-1阳性细胞。+ 胰腺前体细胞 体外 该方案可应用于多种人类多能干细胞系。
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摘要
摘要
多能干细胞具有自我更新和向多个谱系分化的潜能，因此成为生成胰腺前体细胞的理想来源，可用于糖尿病的研究及未来的治疗。本文介绍一种四阶段分化方案，旨在由人胚胎干细胞（hESCs）诱导生成胰腺前体细胞。该方案适用于多种人多能干细胞（hPSC）系。该方法通过模拟胰腺发育过程中的关键阶段，逐步将hESCs分化为胰腺前体细胞。首先，通过在含Activin A、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和CHIR990210的培养体系中培养细胞，诱导其向定型内胚层分化。随后，在成纤维细胞生长因子10（FGF10）和Dorsomorphin的作用下进一步分化并进行模式形成，获得类似于后部前肠的细胞。接着，加入视黄酸、NOGGIN、SANT-1和FGF10，将后部前肠细胞分化为具有胰腺内胚层特征的细胞。最后，联合使用表皮生长因子（EGF）、烟酰胺和NOGGIN，可高效生成PDX1阳性细胞。+NKX6-1+ 细胞。通过流式细胞术检测胰腺发育关键阶段特定标志物的表达。PDX1+NKX6-1+ 第4阶段结束时的胰腺前体细胞在移植到免疫缺陷小鼠体内后能够生成成熟的β细胞，并可进一步分化为产生胰岛素的细胞 体外因此，高效生成PDX1+NKX6-1+ 胰腺前体细胞，如本方案所示，具有重要意义，因为它为研究人类胰腺发育提供了平台 体外 并提供了具有分化为β细胞潜能的细胞来源，这些细胞未来可能用于糖尿病的治疗。
引言
糖尿病的发病率正在上升，根据加拿大糖尿病协会的数据，预计加拿大有超过1100万人患有糖尿病或处于糖尿病前期，其中5%至10%为1型糖尿病（T1D）11型糖尿病（T1D）是一种自身免疫性疾病，由位于朗格汉斯胰岛内的胰岛素分泌β细胞遭到破坏所致。目前，患有T1D的个体需要依赖外源性胰岛素来源2尽管胰岛素治疗已取得进展，但1型糖尿病（T1D）患者仍难以维持血糖水平稳定，持续经历低血糖和高血糖。一种有望恢复T1D患者正常血糖水平的治疗方法是利用人类胚胎干细胞（hESCs），该细胞可被用于生成无限量的胰岛素分泌β细胞 体内 和 体外3,4,5,6,7将hESCs分化为类β细胞可能有助于糖尿病的研究 体外，从而有助于发现2型糖尿病的新型治疗靶点，并为1型糖尿病患者的移植治疗提供细胞来源。
从人胚胎干细胞生成胰岛素产生细胞的最成功尝试 体外 旨在重现胰腺发育过程中发生的胚胎事件
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方案
1. 溶液与培养基的制备
注意：所有细胞培养用培养基均需在无菌环境中配制。培养基需现配现用。试剂详情见材料表。
- 分化培养基
- 制备第0天分化培养基：含1%谷氨酰胺、2 µM CHIR 99021、100 ng/ml Activin A 和 104 M MTG 的RPMI培养基。
- 制备第1–2天分化培养基：含1%谷氨酰胺、100 ng/ml Activin A、104 M MTG、5 ng/ml bFGF 和 50 µg/ml 抗坏血酸的RPMI培养基。
- 制备第3–5天分化培养基：含1%谷氨酰胺、1% B27、104 M MTG、0.75 µM Dorsomorphin 和 50 ng/ml FGF10 的RPMI培养基。
- 制备第6–7天分化培养基：含1%谷氨酰胺、1% B27、50 µg/ml 抗坏血酸、50 ng/ml FGF10、0.25 µM SANT-1、2 µM 视黄酸 和 50 ng/ml NOGGIN 的DMEM培养基。
注意：视黄酸应最后加入培养基中，且培养基需避光保存，以防止氧化降解15。 - 制备第8–12天分化培养基：含1%谷氨酰胺....
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结果
高效生成胰腺前体细胞依赖于未分化细胞的正常生长与维持，随后在分化方案中精确添加特定的信号分子，如图1A示意图所示。第0天时，未分化细胞应达到80-95%的融合度，且细胞集落应具有清晰的边界（图1A）。在第1阶段期间，培养基可能会呈现浑浊状态，因为此阶段细胞死亡较为常见。至第1阶段结束时，细胞应共表达定型内胚层标志物CXCR4和CD117，阳性比例应超过90%（图1B）。
在四阶段诱导方案中，随着细胞的分化，其形态从细长的椭圆形（在第1阶段和第2阶段观察到）逐渐转变为更小、更圆的细胞（如第3阶段和第4阶段所示）（图1A）。至第4阶段结束时，通过流式细胞术确认PDX1+/NKX6-1+细胞的高效诱导。在图1C所示的代表性图中，第13天NKX6-1.......
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讨论
成功生成NKX6-1+ 由人多能干细胞分化而来的胰腺前体细胞 体外 依赖高质量的hPSC培养以及通过精确调控在胰腺发育关键发育阶段起决定性作用的特定信号通路来实现定向分化。尽管本方案如先前所示，可用于在多种hPSC细胞系中诱导NKX6-1的强效表达3，为确保高效生成NKX6-1，需注意以下事项。所有细胞培养和培养基配制操作均应在无菌环境中进行，以防止污染。人胚胎干细胞（hESC）集落必须达到适当的汇合度，且在启动分化第0天前不得出现自发分化。若起始使用的hESC状态不理想，可能导致定型内胚层及其后续发育阶段的诱导效率低下。因此，必须在分化第3天通过流式细胞术对细胞进行分析，以确认定型内胚层的高效诱导。CXCR4双阳性细胞的比例+CD117+ 第3天的细胞存活率应高于90%，以确保有效的胰腺发育3如果同时表达CXCR4和CD117的细胞比例低于90%，则向胰腺前体细胞的有效诱导可能会受到影响（结果未显示）。此外，与先前发表的研究不同，使用第1阶段培养基喂养细胞前.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由多伦多综合医院与西部医院基金会及班廷基金提供资助 & 最佳糖尿病中心-大学健康网络研究生奖
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 培养基与细胞因子 | |||
| 1-硫代甘油（MTG） | Sigma | M6145 | |
| Activin A | R&D | 338-AC/CF | |
| 抗坏血酸 | Sigma | A4544 | |
| B-27 补充剂 | Life Technologies | 12587-010 | |
| BD Cytofix/Cytoperm 固定/透化缓冲液 | BD Bioscience | 554722 | |
| BD Perm/Wash 缓冲液，1x | BD Bioscience | 554723 | |
| bFGF | R&D | 233-FB | |
| CHIR990210 | Tocris | 4423a | |
| Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基（DMEM） | Life Technologies | 11995 | |
| DNase I | VWR | 80510-412 | |
| Dorsomorphin | Sigma | P5499 | |
| EGF | R&D | 236-EG | |
| 胎牛血清（FBS） | Wisent | 88150 | |
| FGF10 | R&D | 345-FG | |
| 猪皮明胶 | Sigma | G1890 | |
| 谷氨酰胺 | Life Technologies | 25030 | |
| 烟酰胺 | Sigma | NO636 | |
| NOGGIN | R&D | 3344-NG | |
| 青霉素/链霉素 | Life Technologies | 15070-063 | |
| 视黄酸 | Sigma | R2625 | |
| RPMI 1640 培养基 | Life Technologies | 11875 | |
| SANT-1 | Tocris | 1974 | |
| TrypLE Express 酶（1x），含酚红 | Life Technologies | 12605-010 | |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 流式细胞术抗体（工作稀释度） | |||
| CD117 PE（1:100） | Life Technologies | CD11705 | |
| CXCR4 APC（1:50） | BD Bioscience | 551966 | |
| 驴抗小鼠 IgG（H+L），Alexa Fluor 647 标记（1:400） | Life Technologies | A-31571 | |
| 驴抗山羊 IgG（H+L），Alexa Fluor 488 标记（1:400） | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 705-546-147 | |
| 同型对照小鼠 IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 015-000-003 | |
| 同型对照山羊 IgG | R&D | AB-108-C | |
| NKX6-1（1:2,000） | DSHB | F55A10 | |
| PDX1（1:100） | R&D | AF2419 |
参考文献
- Canadian Diabetes Association. , Available from: http://www.diabetes.ca/about-diabetes/types-of-diabetes (2016).
- Cogger, K., Nostro, M. C. Recent advances in cell replacement therapies for the treatment of type 1 diabetes. Endocrinology. 156 (1), 8-15 (2015).
- Nostro, M. C., et al.
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