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方法文章

高效地将多能干细胞分化为NKX6-1+胰腺前体细胞

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DOI：

10.3791/55265

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2017年3月7日

 , 
1Toronto General Research Institute, University Health Network, 2McEwen Centre for Regenerative Medicine, University Health Network, 3Department of Physiology, University of Toronto

本文内容

摘要

在此，我们描述了一种四阶段方案，用于将人类胚胎干细胞分化为NKX6-1阳性细胞。+ 胰腺前体细胞 体外 该方案可应用于多种人类多能干细胞系。

摘要

多能干细胞具有自我更新和向多个谱系分化的潜能，因此成为生成胰腺前体细胞的理想来源，可用于糖尿病的研究及未来的治疗。本文介绍一种四阶段分化方案，旨在由人胚胎干细胞（hESCs）诱导生成胰腺前体细胞。该方案适用于多种人多能干细胞（hPSC）系。该方法通过模拟胰腺发育过程中的关键阶段，逐步将hESCs分化为胰腺前体细胞。首先，通过在含Activin A、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和CHIR990210的培养体系中培养细胞，诱导其向定型内胚层分化。随后，在成纤维细胞生长因子10（FGF10）和Dorsomorphin的作用下进一步分化并进行模式形成，获得类似于后部前肠的细胞。接着，加入视黄酸、NOGGIN、SANT-1和FGF10，将后部前肠细胞分化为具有胰腺内胚层特征的细胞。最后，联合使用表皮生长因子（EGF）、烟酰胺和NOGGIN，可高效生成PDX1阳性细胞。+NKX6-1+ 细胞。通过流式细胞术检测胰腺发育关键阶段特定标志物的表达。PDX1+NKX6-1+ 第4阶段结束时的胰腺前体细胞在移植到免疫缺陷小鼠体内后能够生成成熟的β细胞，并可进一步分化为产生胰岛素的细胞 体外因此，高效生成PDX1+NKX6-1+ 胰腺前体细胞，如本方案所示，具有重要意义，因为它为研究人类胰腺发育提供了平台 体外 并提供了具有分化为β细胞潜能的细胞来源，这些细胞未来可能用于糖尿病的治疗。

引言

糖尿病的发病率正在上升，根据加拿大糖尿病协会的数据，预计加拿大有超过1100万人患有糖尿病或处于糖尿病前期，其中5%至10%为1型糖尿病（T1D）11型糖尿病（T1D）是一种自身免疫性疾病，由位于朗格汉斯胰岛内的胰岛素分泌β细胞遭到破坏所致。目前，患有T1D的个体需要依赖外源性胰岛素来源2尽管胰岛素治疗已取得进展，但1型糖尿病（T1D）患者仍难以维持血糖水平稳定，持续经历低血糖和高血糖。一种有望恢复T1D患者正常血糖水平的治疗方法是利用人类胚胎干细胞（hESCs），该细胞可被用于生成无限量的胰岛素分泌β细胞 体内 和 体外3,4,5,6,7将hESCs分化为类β细胞可能有助于糖尿病的研究 体外，从而有助于发现2型糖尿病的新型治疗靶点，并为1型糖尿病患者的移植治疗提供细胞来源。

从人胚胎干细胞生成胰岛素产生细胞的最成功尝试 体外 旨在重现胰腺发育过程中发生的胚胎事件4,5这涉及调控不同的信号通路，以精确模拟胰腺发育的关键阶段。胰腺发育始于定型内胚层的诱导，该阶段以 CXCR4 和 CD117（c-KIT）的表达为特征。8,9精确调控定型内胚层的组织结构对于原肠管的形成至关重要，随后原肠管经历从头端到尾端以及腹侧到背侧的模式形成。背侧和腹侧胰腺芽从表达胰腺和十二指肠同源框基因（pancreatic and duodenal homeobox gene）的后部前肠区域发育而来。Pdx1），这对胰腺发育是必需的10背侧和腹侧芽融合形成胰腺，随后胰腺经历广泛的上皮重塑和扩张11向内分泌和外分泌谱系的分化伴随着多能祖细胞（MPCs）的产生，这些细胞表达多种转录因子，其中包括 Pdx1，Nkx6.1 和 Ptf1a12,13. 将分化为内分泌细胞和导管细胞的MPCs继续表达 Nkx6-1 同时减少 Ptf1a 表达。与此相反，外分泌谱系细胞将失去表达 Nkx6-1 并维持 Ptf1a 表达12.

转录因子 Nkx6-1 在胰腺发育中起关键作用，特别是在内分泌前体细胞向β细胞分化的过程中。如前所述，删除 Nkx6-1 导致胰腺发育过程中β细胞形成受损14因此，生成能产生胰岛素的β细胞 体外 和 体内 需要高效的诱导作用 Nkx6-1

我们近期开发了一种高效方案，可从人多能干细胞（hPSCs）诱导生成PDX1+/NKX6-1+胰腺前体细胞。这些由hPSCs衍生的胰腺前体细胞在移植至免疫缺陷小鼠体内后可进一步发育为成熟的β细胞3。该分化方案可分为四个阶段，分别对应于：1）定型内胚层诱导，2）后部前肠模式形成，3）胰腺特化，以及4）NKX6-1诱导。本文将详细描述定向分化的每一步操作。

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方案

1. 溶液与培养基的制备

注意：所有细胞培养用培养基均需在无菌环境中配制。培养基需现配现用。试剂详情见材料表。

  1. 分化培养基
    1. 制备第0天分化培养基：含1%谷氨酰胺、2 µM CHIR 99021、100 ng/ml Activin A 和 104 M MTG 的RPMI培养基。
    2. 制备第1–2天分化培养基：含1%谷氨酰胺、100 ng/ml Activin A、104 M MTG、5 ng/ml bFGF 和 50 µg/ml 抗坏血酸的RPMI培养基。
    3. 制备第3–5天分化培养基：含1%谷氨酰胺、1% B27、104 M MTG、0.75 µM Dorsomorphin 和 50 ng/ml FGF10 的RPMI培养基。
    4. 制备第6–7天分化培养基：含1%谷氨酰胺、1% B27、50 µg/ml 抗坏血酸、50 ng/ml FGF10、0.25 µM SANT-1、2 µM 视黄酸 和 50 ng/ml NOGGIN 的DMEM培养基。
      注意：视黄酸应最后加入培养基中，且培养基需避光保存，以防止氧化降解15。
    5. 制备第8–12天分化培养基：含1%谷氨酰胺、1% B27、50 µg/ml 抗坏血酸、50 ng/ml NOGGIN、100 ng/ml hEGF 和 10 mM 烟酰胺的DMEM培养基。
  2. 制备FACS缓冲液：含10%胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS），不含钙和镁离子。

2. 人类胚胎干细胞分化

注意：人胚胎干细胞（hESC）在经照射的小鼠胚胎成纤维细胞上，使用添加 bFGF 的 KOSR 培养基进行解冻、传代和扩增16。当细胞融合度达到 80–95% 时，hESC 即可进行分化。此时，细胞集落应较大，边界清晰，并呈现“圆顶样”结构（图 1A）。所有细胞培养均在经组织培养处理、并以 0.1% 明胶包被的平底培养板中进行。通常，细胞分别在 6 孔或 12 孔板中培养，培养基体积分别为 2 ml 或 1 ml。

  1. 第0天，通过将基于KOSR的培养基更换为第0天分化培养基，开始诱导分化。
  2. 第1天和第2天，在吸除培养基前，轻轻振荡培养板以去除单层细胞中的死细胞，随后更换为第1–2天分化培养基。
  3. 第3天，收集细胞进行流式细胞术检测。若细胞中CXCR4+/CD117+表达比例超过90%，则进入步骤2.4。
  4. 第3天和第5天，在吸除培养基前，轻轻振荡培养板以去除单层细胞中的死细胞，随后更换为第3–5天分化培养基。
  5. 第6天和第7天，更换为第6–7天分化培养基。
  6. 第8、10和12天，更换为第8–12天分化培养基。
  7. 第13天，收集细胞进行流式细胞术检测，以确定PDX1和NKX6-1的表达情况。

3. 用于流式细胞术分析的细胞收获

  1. 根据制造商说明书，使用1×商品化胰蛋白酶溶液消化细胞，并在37 °C孵育3分钟。
  2. 去除商品化胰蛋白酶溶液，将单细胞重悬于含30 µl DNase I的1,000 µl FACS缓冲液中。
  3. 使用35 µm尼龙网细胞滤筛过滤细胞，转移至微量离心管中。
  4. 在455 × g离心5分钟。根据需要准备活细胞或固定后染色的细胞。

4. 流式细胞术染色

  1. 第3天活细胞染色的流式制备
    1. 将细胞重悬于1,000 µl FACS缓冲液中。取200 µl（约1-3 × 105个细胞）加入96孔板的两个孔中（分别用于未染色和染色样本）。
    2. 以931 × g离心2分钟。通过倒置平板去除上清液。
    3. 使用偶联一抗CXCR4:APC和CD117:PE（见材料表）在室温避光孵育30分钟进行染色。
    4. 以931 × g离心2分钟。通过倒置平板去除上清液。
    5. 将样本重悬于100 µl FACS缓冲液中。
    6. 以931 × g离心2分钟。通过倒置平板去除上清液。
    7. 将每个样本重悬，并转移至总体积为300-500 µl的FACS缓冲液中，分别加入1 ml微量离心管或5 ml圆底管中。
    8. 在流式细胞仪上检测样本17。若无法立即检测，应于4 °C避光保存。
  2. 第13天固定后染色的流式制备
    1. 将细胞沉淀重悬于商品化固定/通透溶液中，在4 °C孵育24小时。
    2. 以455 × g离心5分钟。重悬于400 µl通透/洗涤溶液中。
    3. 取200 µl样本（约0.5-1 × 106个细胞）加入96孔板的两个孔中（分别用于IgG对照和PDX1/NKX6-1染色）。以931 × g离心2分钟。
    4. 将细胞沉淀重悬于含抗PDX1和抗NKX6-1一抗或同型对照抗体的100 µl通透/洗涤溶液中（见材料表）。在4 °C孵育过夜。
    5. 以931 × g离心2分钟。通过倒置平板去除上清液。将样本重悬于100 µl通透/洗涤溶液中。
    6. 以931 × g离心2分钟。通过倒置平板去除上清液。
    7. 将样本重悬于含二抗的100 µl通透/洗涤溶液中，在室温避光孵育1小时。
    8. 以931 × g离心2分钟。通过倒置平板去除上清液。
    9. 将样本重悬于100 µl通透/洗涤溶液中。
    10. 以931 × g离心2分钟。通过倒置平板去除上清液。
    11. 重复步骤4.2.9和4.2.10。
    12. 将每个样本重悬，并转移至总体积为300-500 µl的FACS缓冲液中，分别加入1 ml微量离心管或5 ml圆底管中。
    13. 在流式细胞仪上检测样本17。若无法立即检测，应于4 °C避光保存。

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结果

高效生成胰腺前体细胞依赖于未分化细胞的适当生长与维持，随后在分化方案中精确添加特定的信号分子，如图1A示意图所示。第0天时，未分化细胞应达到80-95%的融合度，且克隆应具有清晰的边界（图1A）。在第1阶段期间，由于此阶段细胞死亡较为常见，培养基可能呈现浑浊状态。至第1阶段结束时，细胞应共表达定型内胚层标志物CXCR4和CD117，且比例应超过90%（图1B）。

在四阶段分化方案过程中，随着细胞的分化，其形态从细长、椭圆形（第1和第2阶段观察到）逐渐转变为更小、更圆的细胞（第3和第4阶段可见）（图1A）。在第4阶段结束时，通过流式细胞术确认PDX1+/NKX6-1+的高效诱导。如图1C所示的代表性结果中，第13天NKX6-1+

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讨论

成功生成NKX6-1+ 由人多能干细胞分化而来的胰腺前体细胞 体外 依赖高质量的hPSC培养以及通过精确调控在胰腺发育关键发育阶段起决定性作用的特定信号通路来实现定向分化。尽管本方案如先前所示，可用于在多种hPSC细胞系中诱导NKX6-1的强效表达3，为确保高效生成NKX6-1，需注意以下事项。所有细胞培养和培养基配制操作均应在无菌环境中进行，以防止污染。人胚胎干细胞（hESC）集落必须达到适当的汇合度，且在启动分化第0天前不得出现自发分化。若起始使用的hESC状态不理想，可能导致定型内胚层及其后续发育阶段的诱导效率低下。因此，必须在分化第3天通过流式细胞术对细胞进行分析，以确认定型内胚层的高效诱导。CXCR4双阳性细胞的比例+CD117+ 第3天的细胞存活率应高于90%，以确保有效的胰腺发育3如果同时表达CXCR4和CD117的细胞比例低于90%，则向胰腺前体细胞的有效诱导可能会受到影响（结果未显示）。此外，与先前发表的研究不同，使用第1阶段培养基喂养细胞前...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由多伦多综合医院与西部医院基金会及班廷基金提供资助 & 最佳糖尿病中心-大学健康网络研究生奖

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
培养基与细胞因子
1-硫代甘油（MTG）SigmaM6145
Activin AR&D338-AC/CF 
抗坏血酸SigmaA4544
B-27 补充剂Life Technologies12587-010 
BD Cytofix/Cytoperm 固定/透化缓冲液BD Bioscience554722
BD Perm/Wash 缓冲液，1xBD Bioscience554723
bFGFR&D233-FB
CHIR990210Tocris4423a
Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基（DMEM）Life Technologies11995
DNase IVWR80510-412 
DorsomorphinSigmaP5499
EGFR&D236-EG
胎牛血清（FBS）Wisent88150
FGF10R&D345-FG
猪皮明胶SigmaG1890
谷氨酰胺Life Technologies25030
烟酰胺SigmaNO636
NOGGINR&D3344-NG
青霉素/链霉素Life Technologies15070-063
视黄酸SigmaR2625
RPMI 1640 培养基Life Technologies11875
SANT-1Tocris1974
TrypLE Express 酶（1x），含酚红Life Technologies12605-010
名称公司货号备注
流式细胞术抗体（工作稀释度）
CD117 PE（1:100）Life TechnologiesCD11705
CXCR4 APC（1:50）BD  Bioscience551966
驴抗小鼠 IgG（H+L），Alexa Fluor 647 标记（1:400）Life TechnologiesA-31571
驴抗山羊 IgG（H+L），Alexa Fluor 488 标记（1:400） Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.705-546-147
同型对照小鼠 IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. 015-000-003
同型对照山羊 IgGR&D  AB-108-C
NKX6-1（1:2,000）DSHBF55A10
PDX1（1:100）R&DAF2419

参考文献

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  17. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
  18. Nostro, M. C., et al. Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Development. 138 (5), 861-871 (2011).
  19. Schulz, T. C., et al. A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells. PLoS One. 7 (5), e37004(2012).

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