通过细胞内染色和流式细胞术鉴定高血压模型小鼠主动脉、肾脏及淋巴结中的淋巴细胞亚群

摘要

本文提供了通过胞内染色和流式细胞术鉴定和定量小鼠肾脏、主动脉及淋巴结中功能性T淋巴细胞亚群的详细方法。以血管紧张素II诱导的高血压模型为例，逐步阐述流式细胞术和胞内染色的技术流程与基本原理。

摘要

目前众所周知，T 淋巴细胞在多种心血管疾病的发生发展中起着关键作用^1,2,3,4,5。例如，我们课题组的研究表明，在实验性高血压发展过程中，高血压与血管和肾脏中 T 细胞的过度积聚密切相关⁶。一旦进入这些组织，T 细胞会分泌多种细胞因子，影响血管和肾脏功能，导致血管收缩以及钠和水潴留^1,2。为了全面理解 T 细胞如何引发心血管和肾脏疾病，必须能够识别并定量这些组织中存在的特定 T 细胞亚群。T 细胞亚群由其表面标志物、分泌的细胞因子以及表达的转录因子共同定义。由于 T 细胞群体具有高度复杂性，流式细胞术结合胞内染色技术成为解析组织中淋巴细胞表型的不可或缺的方法。本文提供了一套详细的实验方案，用于在血管紧张素 II 诱导的高血压小鼠模型中，鉴定从小鼠肾脏、主动脉及主动脉引流淋巴结分离的 T 细胞的表面及胞内标志物（包括细胞因子和转录因子）。文中详细描述了以下步骤：组织分离、单细胞悬液制备、ex vivo 刺激、固定、通透化和染色。此外，还讨论了流式细胞术分析中的若干基本原则，包括正确选择对照以及合理的设门策略。

引言

最近的证据表明，适应性免疫系统，特别是T淋巴细胞，在多种心血管疾病的发生过程中发挥着关键作用^1,2,3,4,5。例如，在血管紧张素II诱导的高血压模型中，已有研究描述了T细胞在小鼠血管和肾脏中的积聚⁶。血管中的T细胞主要积聚于外膜和血管周围脂肪组织。在肾脏中，T细胞则在髓质和肾皮质中均有积聚。根据所涉及的T细胞亚群不同，这些T细胞会分泌不同的细胞因子，从而影响血管和肾脏功能，并促进病理过程的发展（McMaster et al.⁶对此进行了综述）。

根据功能和特征性细胞因子，CD4⁺ 辅助性T淋巴细胞可分为多个亚群：辅助性T细胞1（Th1）、Th2、Th9、Th17、Th22、调节性T（Treg）细胞以及滤泡辅助性T（Tfh）细胞⁷。类似地，CD8⁺ 细胞毒性T细胞可被分为Tc1、Tc2、Tc17或Tc9亚群⁸。此外还存在双阴性T细胞（即不表达CD4或CD8 T细胞标志物的细胞）。其中一部分细胞具有替代性的γδ T细胞受体（而非经典的α和β受体），因此被称为γδ T细胞。通过流式细胞术对表面标志物、细胞因子和转录因子进行多参数分析，是鉴定这些细胞的最佳方法。尽管该方法在免疫学领域被广泛应用，但在实体器官以及心血管疾病背景下的相关描述仍较为有限。

传统上，组织中淋巴细胞的鉴定仅限于免疫组织化学或逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法。尽管免疫组织化学和免疫荧光是确定特定抗原在组织中分布的有力手段，但它们无法充分进行表型鉴定所涉及的细胞亚群。此外，虽然RT-PCR分析可用于检测抗原、细胞因子或转录因子的mRNA表达，但它不能在单个细胞水平上同时检测多种蛋白质。

流式细胞术的出现，尤其是结合细胞内染色以检测细胞因子和转录因子的技术，为研究者提供了一种强大的方法，能够在单细胞水平上识别和定量实体器官中的免疫细胞亚群。我们优化了一种细胞内染色实验方法，可在血管紧张素II诱导的高血压小鼠模型中，通过流式细胞术鉴定肾脏、主动脉及主动脉引流淋巴结中的主要T细胞亚群。通过对组织消化、ex vivo 激活、通透化处理以及表面和细胞内染色等每一步骤的优化，建立了一种高度可重复的实验方案，该方案可应用于其他心血管和肾脏疾病模型的研究。

方案

范德比尔特大学机构动物护理和使用委员会已批准本文所述的实验程序。小鼠的饲养和护理均遵循《实验动物护理与使用指南》（国家科学院出版社，2010年修订版）。

1. 小鼠主动脉引流淋巴结、肾脏和主动脉的分离

1. 通过吸入 CO₂ 处死小鼠。用 70% 乙醇喷洒胸部，用剪刀小心切开皮肤和胸壁，暴露心脏。
2. 为灌注血管系统，用 21 或 23 号针头向左心室心尖部稳定注入至少 10 ml 冷磷酸盐缓冲液（PBS）（约 1 ml/秒），同时在右心房做一小切口。持续灌注直至所有器官变白。心脏最先变白，肝脏变白表明灌注效果良好。
3. 使用小型镊子和精细剪刀，轻柔剪除并取出肠道、胃、脾脏、胰腺和肝脏，以更好地暴露主动脉。
   注意：此步骤必须操作精确，因胃肠道损伤可能导致污染。
4. 用剪刀切除并移除双侧肺组织。使用无针头注射器以磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗胸腔。用无菌纱布清除多余血液和液体。
5. 用精细解剖镊子摘除腹主动脉引流淋巴结。注意勿破坏包膜。用解剖镊子去除每个淋巴结表面残留的脂肪组织。用精细剪刀切除双侧肾脏。
6. 用精细弯头剪刀解剖整段主动脉（胸主动脉和腹主动脉）。从心脏水平开始，小心沿食管和椎体分离，向下至髂动脉分叉处，注意保留附着于主动脉周围的血管周围脂肪组织。
   注意：可在显微镜下进一步解剖主动脉以去除周围结构。具体包括去除动脉分支（颈动脉、锁骨下动脉、腹腔干、肠系膜动脉和肾动脉）以及淋巴结。应始终保留一层稳定的血管周围脂肪组织，因为在高血压状态下，此处是大量炎症细胞聚集的部位。将每种组织分别置于含有冷 PBS 的独立离心管中。

2. 从每种组织制备单细胞悬液

1. 肾脏
   注意：可通过结合机械解离与酶消化的方法将肾脏解离为单细胞悬液。
   1. 通过向 RPMI 1640 培养基（添加 5% 胎牛血清 (FBS)）中加入胶原酶 D（2 mg/ml）和 DNase I（100 µg/ml）来制备肾脏消化液。每份肾脏样品准备 10 ml。
   2. 使用镊子将两个肾脏转移至含有 10 ml 肾脏消化液的解离管中。
   3. 根据制造商说明书，使用半自动解离仪进行机械解离。
   4. 机械解离后，将管子从仪器上取下并进行酶消化。在 37 ºC 下持续旋转孵育 20 分钟。立即加入含 5% FBS 的冷 RPMI 1640 培养基以终止酶消化。
   5. 经 40 µm 滤器过滤后，用移液器将溶液转移至 50 ml 圆底离心管中。用 1 ml 注射器的推杆按压残留组织，使其分散成单细胞悬液。离心收集细胞（500 × g，8 分钟，4 ºC）。
   6. 将细胞沉淀重悬于 3 ml 的 36% 密度梯度离心介质中，转移至 15 ml 圆底离心管。在 3 ml 36% 细胞悬液下方小心加入 3 ml 72% 密度梯度离心介质，避免混合。离心（1,000 × g，无刹车，20 分钟，4 °C）。
   7. 免疫细胞将位于界面处。移除最上层的黄白色碎片层，然后用冷 PBS 补充体积至 15 ml。充分振荡以破坏梯度。离心细胞（300 × g，8 分钟，4 °C），并将沉淀重悬于 3 ml 含 5% FBS 的 RPMI 培养基中。使用台盼蓝染色排除法在血细胞计数板上计数活细胞数量。
2. 主动脉
   1. 通过向 RPMI 1640 培养基（添加 5% FBS）中加入胶原酶 A（1 mg/ml）、胶原酶 B（1 mg/ml）和 DNase I（100 µg/ml）来制备主动脉消化液。
   2. 使用精细镊子将主动脉转移至含有 1 ml 主动脉消化液的 2 ml 管中。在 1 ml 消化液中用精细剪刀将整个主动脉剪成极小片段。保持在冰上。在 37 °C 下持续旋转孵育 30 分钟。
   3. 将溶液转移至组织培养皿中，并加入 5 倍体积的含 5% FBS 的冷 RPMI 培养基以终止酶消化。
   4. 经 40 µm 滤器过滤后，用移液器将溶液转移至 50 ml 圆底离心管中。用 1 ml 注射器的推杆按压残留组织，使其分散成单细胞悬液。冲洗滤器，并离心收集细胞（300 × g，8 分钟，4 ºC）。
   5. 加入 10 ml 含 5% FBS 的 RPMI 培养基洗涤细胞沉淀。离心（300 × g，8 分钟，4 °C），并将沉淀重悬于 3 ml 含 5% FBS 的 RPMI 培养基中。使用台盼蓝染色排除法在血细胞计数板上计数活细胞数量。
3. 主动脉引流淋巴结
   1. 将 40 µm 滤器置于组织培养皿（60 mm × 15 mm）中。将淋巴结置于滤器上，用 1 ml 注射器的推杆按压使其分散成单细胞悬液。用 2 ml 含 5% FBS 的 RPMI 培养基冲洗滤器。收集培养皿中的细胞。
   2. 将细胞转移至 15 ml 离心管中，离心收集细胞（300 × g，8 分钟，4 ºC）。将沉淀重悬于 500 µl 含 5% FBS 的 RPMI 培养基中。使用台盼蓝染色排除法在血细胞计数板上计数活细胞数量。

3. 离体 用于流式细胞术检测细胞因子的刺激方法

1. 准备细胞培养基：RPMI 加 5% FBS、0.1 mM 非必需氨基酸、50 µM β-巯基乙醇和 1% 青霉素/链霉素。
2. 将从肾脏、主动脉和淋巴结获得的每种细胞悬液分别离心（300 × g，8 分钟，4 °C）。用细胞培养基将每种沉淀重悬，细胞浓度为 1 × 10⁶ 每毫升细胞数
3. 通过向每1 ml细胞培养液中加入2 µl细胞激活剂混合物（含佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯（PMA）、钙离子载体离子霉素和高尔基体抑制剂布雷菲德菌素A），刺激细胞。
   注意：各组分的终浓度分别为：81 nM PMA、1.33 µM 离子霉素（ionomycin）和 5 µg/ml 布雷菲德菌素A（Brefeldin A）。PMA 与离子霉素处理可激活细胞产生细胞因子。细胞因子是通常被分泌到胞外的蛋白质，必须将其保留在细胞内才能被检测。布雷菲德菌素A可导致正常情况下分泌的蛋白质在内质网和高尔基体中蓄积。因此，本方法通过流式细胞术提高了对产生细胞因子的淋巴细胞的检测能力。
4. 在12孔低黏附板（主动脉或肾脏）或24孔低黏附板（淋巴结）中接种100万至200万个细胞。将培养板置于37 °C、加湿的CO₂培养箱中。₂ 孵育3小时
   注意：对照组小鼠淋巴结中的铺板细胞数量可能较低。此外，针对每种细胞群体和所研究的细胞因子，刺激时间需通过实验经验确定。对于从主动脉、肾脏或淋巴结分离的T细胞，建议刺激3至4小时。更长的刺激时间不会增加细胞因子的分泌，反而会进一步下调多种T细胞表面标志物（如CD3、CD4和CD8）的表达。（需注意，即使3-4小时的刺激也会引起这些标志物一定程度的下调。）

4. 表面染色

1. 将细胞转移至聚苯乙烯FACS管中，离心（300 × g，8分钟，4 °C）。用FACS缓冲液（含4% FBS和2 mM EDTA的无Ca²⁺和Mg⁺ PBS）洗涤细胞两次，并根据所需抗体组合的数量及所需对照管的数量，将细胞悬液均分至不同的FACS管中（见下文）。
2. 为每个抗体组合进行补偿调节，需为每种组织类型和每个抗体组合准备未染色对照管和单染对照管。此外，为每个抗体组合准备荧光减一（FMO）对照管，即加入除一种抗体外的所有抗体。
3. 用FACS缓冲液将每管体积调至2 ml。离心细胞悬液（300 × g，8分钟，4 °C），弃去上清液，并通过在冰上孵育10分钟，每百万个细胞加入0.5 µg抗CD16/CD32抗体，以阻断Fc受体。
   注：CD16为低亲和力IgG Fc受体III（FcR III），CD32为FcR II。CD16/CD32表达于粒细胞、肥大细胞、单核细胞/巨噬细胞、自然杀伤细胞、B细胞、树突状细胞以及部分活化的成熟T细胞。
4. 进行活率染色：用1× PBS洗涤细胞，离心（300 × g，8分钟，4 °C），重悬于1,000 µl的1× PBS中。加入1 µl不可透过细胞膜的胺反应性染料（活率染色剂）。在4 °C避光孵育15分钟。
5. 孵育期间，在适量FACS缓冲液中配制抗体混合液（用于表面染色）。用1–2 ml FACS缓冲液洗涤细胞两次，离心（300 × g，8分钟，4 °C），将每份细胞沉淀重悬于100 µl抗体混合液中。在4 °C避光孵育30分钟。
   注：对于每种流式细胞术抗体，建议通过剂量滴定曲线确定所需的最佳抗体用量。
6. 用2 ml FACS缓冲液洗涤细胞两次，离心收集细胞沉淀（300 × g，8分钟，4 °C）。

5. 固定、通透与胞内染色

1. 使用含有适当缓冲液的固定和透化试剂盒，按照制造商说明书进行细胞内染色。将细胞重悬于适当的缓冲液中，以进行固定和透化。样品在4 °C避光孵育40分钟。
2. 向已固定和透化的细胞中直接加入1 ml 1×透化和洗涤缓冲液。离心（500 × g，8分钟，4 °C），弃去上清液。用2 ml 1×洗涤缓冲液重悬沉淀。
3. 在适量的1×洗涤缓冲液（通常每管100 µl）中配制抗体混合物（仅用于细胞内染色）。
   注意：如上所述，每种抗体在抗体组合中的最佳浓度需单独确定。例如，针对IL-17A或IL-17F的抗体，我们使用1:30的稀释比例；而对于IFNγ和T-bet的抗体，则使用1:100的稀释比例。
4. 离心细胞（500 × g，8分钟，4 °C），将每管沉淀用100 µl抗体混合物重悬。在4 °C避光孵育40分钟。
5. 用2 ml 1×洗涤缓冲液洗涤细胞两次，每次离心（500 × g，8分钟，4 °C）。将沉淀用300 µl 1×洗涤缓冲液重悬，并使用配备适当滤光片的流式细胞仪进行分析。
6. 为定量每份组织样本中的细胞总数，可使用计数微球。在上机前，向每管中加入推荐体积或数量的计数微球。

6. 补偿、设门、归一化及注意事项

1. 补偿与设门
   1. 运行未染色和单染对照管进行补偿，以校正光谱重叠。
      注意：当样本中目标抗原或细胞群含量极低，难以通过细胞进行补偿时，必须使用补偿微球而非基于细胞的补偿对照。另外，使用串联染料时，建议每次实验均制备补偿样本，因为串联染料在不同批次之间以及每日使用时均可能存在差异。
   2. 在开始新的多色实验时，应对面板中所有荧光素运行“减去一荧光”对照（FMO）。
      注意：FMO对照是指包含面板中所有抗体、唯独缺少一种抗体的样本。此类对照可准确区分被省略抗体的阳性与阴性信号，从而正确设定设门。当表达水平较低或目标细胞群分离效果较差时（例如目标为细胞因子或转录因子），这些对照尤为重要。尽管并非总是必需，但在某些情况下，同型对照可能优于FMO对照，因其可在无抗原特异性的情况下，为抗体同型与荧光素偶联物提供适当的补偿。
   3. 设定初始门：调整前向散射面积（FSC-A）和侧向散射面积（SSC-A）电压，以识别白细胞群。
   4. 排除死细胞。
      注意：活力染料可与细胞表面及内部暴露的游离胺基反应。与活细胞不同，死细胞（膜完整性受损）允许染料进入胞质，导致蛋白标记量增加。因此，死细胞荧光信号更强，易于区分。应圈选活细胞群。
      注意：由于额外的消化步骤，来自主动脉和肾脏的细胞悬液活力可能低于来自淋巴结的细胞悬液。
   5. 绘制前向散射面积（FSC-A）[y轴] 与前向散射高度（FSC-H）[x轴]。单细胞在该散点图中呈对角线分布。圈选该对角线区域以排除双联体。随后绘制SSC-A [y轴] 与CD45 [x轴]。
   6. CD45⁺ 白细胞群可被清晰识别。圈选该细胞群，并基于此进一步鉴定后续细胞亚群。
2. 细胞计数的标准化
   1. 计数微球具有低FSC和高SSC的特性。例如，若将50,000个微球加入300 µl单细胞悬液中，则每管中任意特定细胞类型的绝对数量计算公式如下：
           每管细胞数 = (50,000 / 流式细胞仪计数的微球数) × 计数的细胞数。
      通过该计算可确定每管中任意特定细胞类型的绝对数量。根据每个器官所制备的管数，可进一步计算出每个器官中的细胞总数。
      注意：实验全程应将所有细胞和试剂保持在4 °C。避免剧烈涡旋，以免损伤细胞。离心时使用最小离心力沉淀细胞。避免在FACS管中产生气泡，以防诱发细胞死亡。切勿让细胞沉淀干燥。

结果

本方案描述了在血管紧张素II诱导的高血压小鼠模型中，对从小鼠肾脏、主动脉及主动脉引流淋巴结分离的T细胞进行表面和细胞内标志物鉴定的方法。代表性结果如下所示。

图1展示了用于鉴定从经血管紧张素II输注诱导高血压的野生型小鼠主动脉制备的单细胞悬液中T细胞群体的设门策略。在肾脏和淋巴结中也采用类似策略。调整前向散射面积（FSC-A）和侧向散射面积（SSC-A）电压以检测白细胞群体（G1）并排除碎片。活细胞（G2）对与Pacific Blue偶联的活力标记物呈阴性。随后根据前向散射高度（FSC-H）和前向散射面积（FSC-A）对活细胞设门，仅选择单细胞群体（G3）。然后通过SSC-A和CD45设门选择白细胞（G4）。在此示例中，CD45与AmCyan偶联。最后，T细胞被设门为CD45⁺CD3⁺群体（G5）。在此示例中，CD3与PerCP-Cy5.5偶联。

讨论

本文所述方案已优化，可准确鉴定存在于小鼠肾脏、主动脉和淋巴结中的T细胞亚群。该方案可轻松调整以检测其他免疫细胞亚群，如B淋巴细胞和固有免疫细胞，并可修改用于其他组织类型。消化步骤至关重要，需针对每种组织进行调整和优化⁹。消化时间过长或使用不合适的酶可能影响抗原表达的稳定性；同样，消化不完全也会影响实验结果，导致阳性细胞数量减少。此外，每种细胞类型或细胞因子的体外（ex vivo）刺激时间需仔细调整，以实现最佳刺激效果并尽量减少细胞毒性。

尽管细胞内染色结合流式细胞术分析是研究血液和组织中免疫过程最强大的方法之一，但该技术也存在局限性。这些局限性包括心血管和肾脏组织中免疫细胞的相对数量较少。因此，根据所检测的细胞类型，可能需要合并多只小鼠的器官以获得一个样本。此外，标记物的不稳定性是另一个限制因素，因为在实验过程中多个步骤都可能影响标记物的表达。基于这一原因，建议同时进行组织学分析，以验证流式细胞术获得的结果。在流式细胞仪的使用和结果解读方面也需特别注意。流式细胞仪是一种精密仪器，需要经过高度培训的操作人员。重要的是，尽管使用了补偿对照，仍存在...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胶原酶D	ROCHE	11088882001
胶原酶A	ROCHE	10103586001
胶原酶B	ROCHE	11088815001
Dnase	ROCHE	10104159001
1× 红细胞裂解缓冲液	eBioscience	00-4333-57
RPMI 1640培养基（1×）	Gibco	11835-030
不含钙和镁的DPBS	Gibco	14190-144
Percoll	GE Healthcare	17-5445-02	用于密度梯度离心
GentleMACS™ C管	Miltenyi Biotec	130-096-334
GentleMACS组织解离仪	Miltenyi Biotec	130-093-235	使用SPLEEN_04程序
细胞激活剂混合物（含布雷菲德菌素A）	Biolegend	423303
抗-CD16/32抗体	eBioscience	14-0161-81	按1:100稀释
LIVE/DEAD可固定紫光死细胞染色试剂盒	Life Technologies	L34955
转录因子缓冲液套装	BD Pharmingen	562725
OneComp eBeads	eBioscience	01-1111-42
123计数eBeads	eBioscience	01-1234-42
CD45 AmCyan（克隆号30-F11）	BioLegend	103138
CD3 PerCP-Cy5.5（克隆号17A2）	BioLegend	100218
IL-17A FITC（克隆号TC11-18H10.1）	BioLegend	506910
IL-17F APC（克隆号9D3.1C8）	BioLegend	517004
CD4 APC-Cy7（克隆号GK1.5）	BD Biosciences	560181
CD8 APC（克隆号53-67）	eBioscience	17-0081-82
T-bet PE-Cy7（克隆号4B10）	BioLegend	644823
IFNγ FITC（克隆号XMG1.2）	BD Biosciences	557724