本文提供了通过胞内染色和流式细胞术鉴定和定量小鼠肾脏、主动脉及淋巴结中功能性T淋巴细胞亚群的详细方法。以血管紧张素II诱导的高血压模型为例,逐步阐述流式细胞术和胞内染色的技术流程与基本原理。
方法文章
本文提供了通过胞内染色和流式细胞术鉴定和定量小鼠肾脏、主动脉及淋巴结中功能性T淋巴细胞亚群的详细方法。以血管紧张素II诱导的高血压模型为例,逐步阐述流式细胞术和胞内染色的技术流程与基本原理。
目前众所周知,T 淋巴细胞在多种心血管疾病的发生发展中起着关键作用1,2,3,4,5。例如,我们课题组的研究表明,在实验性高血压发展过程中,高血压与血管和肾脏中 T 细胞的过度积聚密切相关6。一旦进入这些组织,T 细胞会分泌多种细胞因子,影响血管和肾脏功能,导致血管收缩以及钠和水潴留1,2。为了全面理解 T 细胞如何引发心血管和肾脏疾病,必须能够识别并定量这些组织中存在的特定 T 细胞亚群。T 细胞亚群由其表面标志物、分泌的细胞因子以及表达的转录因子共同定义。由于 T 细胞群体具有高度复杂性,流式细胞术结合胞内染色技术成为解析组织中淋巴细胞表型的不可或缺的方法。本文提供了一套详细的实验方案,用于在血管紧张素 II 诱导的高血压小鼠模型中,鉴定从小鼠肾脏、主动脉及主动脉引流淋巴结分离的 T 细胞的表面及胞内标志物(包括细胞因子和转录因子)。文中详细描述了以下步骤:组织分离、单细胞悬液制备、ex vivo 刺激、固定、通透化和染色。此外,还讨论了流式细胞术分析中的若干基本原则,包括正确选择对照以及合理的设门策略。
最近的证据表明,适应性免疫系统,特别是T淋巴细胞,在多种心血管疾病的发生过程中发挥着关键作用1,2,3,4,5。例如,在血管紧张素II诱导的高血压模型中,已有研究描述了T细胞在小鼠血管和肾脏中的积聚6。血管中的T细胞主要积聚于外膜和血管周围脂肪组织。在肾脏中,T细胞则在髓质和肾皮质中均有积聚。根据所涉及的T细胞亚群不同,这些T细胞会分泌不同的细胞因子,从而影响血管和肾脏功能,并促进病理过程的发展(McMaster et al.6对此进行了综述)。
根据功能和特征性细胞因子,CD4+ 辅助性T淋巴细胞可分为多个亚群:辅助性T细胞1(Th1)、Th2、Th9、Th17、Th22、调节性T(Treg)细胞以及滤泡辅助性T(Tfh)细胞7。类似地,CD8+ 细胞毒性T细胞可被分为Tc1、Tc2、Tc17或Tc9亚群8。此外还存在双阴性T细胞(即不表达CD4或CD8 T细胞标志物的细胞)。其中一部分细胞具有替代性的γδ T细胞受体(而非经典的α和β受体),因此被称为γδ T细胞。通过流式细胞术对表面标志物、细胞因子和转录因子进行多参数分析,是鉴定这些细胞的最佳方法。尽管该方法在免疫学领域被广泛应用,但在实体器官以及心血管疾病背景下的相关描述仍较为有限。
传统上,组织中淋巴细胞的鉴定仅限于免疫组织化学或逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法。尽管免疫组织化学和免疫荧光是确定特定抗原在组织中分布的有力手段,但它们无法充分进行表型鉴定所涉及的细胞亚群。此外,虽然RT-PCR分析可用于检测抗原、细胞因子或转录因子的mRNA表达,但它不能在单个细胞水平上同时检测多种蛋白质。
流式细胞术的出现,尤其是结合细胞内染色以检测细胞因子和转录因子的技术,为研究者提供了一种强大的方法,能够在单细胞水平上识别和定量实体器官中的免疫细胞亚群。我们优化了一种细胞内染色实验方法,可在血管紧张素II诱导的高血压小鼠模型中,通过流式细胞术鉴定肾脏、主动脉及主动脉引流淋巴结中的主要T细胞亚群。通过对组织消化、ex vivo 激活、通透化处理以及表面和细胞内染色等每一步骤的优化,建立了一种高度可重复的实验方案,该方案可应用于其他心血管和肾脏疾病模型的研究。
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范德比尔特大学机构动物护理和使用委员会已批准本文所述的实验程序。小鼠的饲养和护理均遵循《实验动物护理与使用指南》(国家科学院出版社,2010年修订版)。
1. 小鼠主动脉引流淋巴结、肾脏和主动脉的分离
2. 从每种组织制备单细胞悬液
3. 离体 用于流式细胞术检测细胞因子的刺激方法
4. 表面染色
5. 固定、通透与胞内染色
6. 补偿、设门、归一化及注意事项
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本方案描述了在血管紧张素II诱导的高血压小鼠模型中,对从小鼠肾脏、主动脉及主动脉引流淋巴结分离的T细胞进行表面和细胞内标志物鉴定的方法。代表性结果如下所示。
图1展示了用于鉴定从经血管紧张素II输注诱导高血压的野生型小鼠主动脉制备的单细胞悬液中T细胞群体的设门策略。在肾脏和淋巴结中也采用类似策略。调整前向散射面积(FSC-A)和侧向散射面积(SSC-A)电压以检测白细胞群体(G1)并排除碎片。活细胞(G2)对与Pacific Blue偶联的活力标记物呈阴性。随后根据前向散射高度(FSC-H)和前向散射面积(FSC-A)对活细胞设门,仅选择单细胞群体(G3)。然后通过SSC-A和CD45设门选择白细胞(G4)。在此示例中,CD45与AmCyan偶联。最后,T细胞被设门为CD45+CD3+群体(G5)。在此示例中,CD3与PerCP-Cy5.5偶联。
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本文所述方案已优化,可准确鉴定存在于小鼠肾脏、主动脉和淋巴结中的T细胞亚群。该方案可轻松调整以检测其他免疫细胞亚群,如B淋巴细胞和固有免疫细胞,并可修改用于其他组织类型。消化步骤至关重要,需针对每种组织进行调整和优化9。消化时间过长或使用不合适的酶可能影响抗原表达的稳定性;同样,消化不完全也会影响实验结果,导致阳性细胞数量减少。此外,每种细胞类型或细胞因子的体外(ex vivo)刺激时间需仔细调整,以实现最佳刺激效果并尽量减少细胞毒性。
尽管细胞内染色结合流式细胞术分析是研究血液和组织中免疫过程最强大的方法之一,但该技术也存在局限性。这些局限性包括心血管和肾脏组织中免疫细胞的相对数量较少。因此,根据所检测的细胞类型,可能需要合并多只小鼠的器官以获得一个样本。此外,标记物的不稳定性是另一个限制因素,因为在实验过程中多个步骤都可能影响标记物的表达。基于这一原因,建议同时进行组织学分析,以验证流式细胞术获得的结果。在流式细胞仪的使用和结果解读方面也需特别注意。流式细胞仪是一种精密仪器,需要经过高度培训的操作人员。重要的是,尽管使用了补偿对照,仍存在...
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MSM 得到了吉利德心血管科学基金的资助。
本研究得到了美国心脏协会博士后奖学金(16POST29950007)对FL的资助,美国国立卫生研究院(NIH T32 HL069765)培训项目对BLD的资助,美国心脏协会博士后奖学金(14POST20420025)对MA Saleh的资助,以及NIH K08基金(HL121671)对MSM的资助。MSM还获得了吉利德科学公司(Gilead Sciences, Inc.)的研究资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胶原酶D | ROCHE | 11088882001 | |
| 胶原酶A | ROCHE | 10103586001 | |
| 胶原酶B | ROCHE | 11088815001 | |
| Dnase | ROCHE | 10104159001 | |
| 1× 红细胞裂解缓冲液 | eBioscience | 00-4333-57 | |
| RPMI 1640培养基(1×) | Gibco | 11835-030 | |
| 不含钙和镁的DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-5445-02 | 用于密度梯度离心 |
| GentleMACS™ C管 | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS组织解离仪 | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | 使用SPLEEN_04程序 |
| 细胞激活剂混合物(含布雷菲德菌素A) | Biolegend | 423303 | |
| 抗-CD16/32抗体 | eBioscience | 14-0161-81 | 按1:100稀释 |
| LIVE/DEAD可固定紫光死细胞染色试剂盒 | Life Technologies | L34955 | |
| 转录因子缓冲液套装 | BD Pharmingen | 562725 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| 123计数eBeads | eBioscience | 01-1234-42 | |
| CD45 AmCyan(克隆号30-F11) | BioLegend | 103138 | |
| CD3 PerCP-Cy5.5(克隆号17A2) | BioLegend | 100218 | |
| IL-17A FITC(克隆号TC11-18H10.1) | BioLegend | 506910 | |
| IL-17F APC(克隆号9D3.1C8) | BioLegend | 517004 | |
| CD4 APC-Cy7(克隆号GK1.5) | BD Biosciences | 560181 | |
| CD8 APC(克隆号53-67) | eBioscience | 17-0081-82 | |
| T-bet PE-Cy7(克隆号4B10) | BioLegend | 644823 | |
| IFNγ FITC(克隆号XMG1.2) | BD Biosciences | 557724 |
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