通过细胞内染色和流式细胞术鉴定高血压模型小鼠主动脉、肾脏及淋巴结中的淋巴细胞亚群

摘要

本文提供了通过胞内染色和流式细胞术鉴定和定量小鼠肾脏、主动脉及淋巴结中功能性T淋巴细胞亚群的详细方法。以血管紧张素II诱导的高血压模型为例，逐步阐述流式细胞术和胞内染色的技术流程与基本原理。

摘要

目前众所周知，T 淋巴细胞在多种心血管疾病的发生发展中起着关键作用^1,2,3,4,5。例如，我们课题组的研究表明，在实验性高血压发展过程中，高血压与血管和肾脏中 T 细胞的过度积聚密切相关⁶。一旦进入这些组织，T 细胞会分泌多种细胞因子，影响血管和肾脏功能，导致血管收缩以及钠和水潴留^1,2。为了全面理解 T 细胞如何引发心血管和肾脏疾病，必须能够识别并定量这些组织中存在的特定 T 细胞亚群。T 细胞亚群由其表面标志物、分泌的细胞因子以及表达的转录因子共同定义。由于 T 细胞群体具有高度复杂性，流式细胞术结合胞内染色技术成为解析组织中淋巴细胞表型的不可或缺的方法。本文提供了一套详细的实验方案，用于在血管紧张素 II 诱导的高血压小鼠模型中，鉴定从小鼠肾脏、主动脉及主动脉引流淋巴结分离的 T 细胞的表面及胞内标志物（包括细胞因子和转录因子）。文中详细描述了以下步骤：组织分离、单细胞悬液制备、ex vivo 刺激、固定、通透化和染色。此外，还讨论了流式细胞术分析中的若干基本原则，包括正确选择对照以及合理的设门策略。

引言

最近的证据表明，适应性免疫系统，特别是T淋巴细胞，在多种心血管疾病的发生过程中发挥着关键作用^1,2,3,4,5。例如，在血管紧张素II诱导的高血压模型中，已有研究描述了T细胞在小鼠血管和肾脏中的积聚⁶。血管中的T细胞主要积聚于外膜和血管周围脂肪组织。在肾脏中，T细胞则在髓质和肾皮质中均有积聚。根据所涉及的T细胞亚群不同，这些T细胞会分泌不同的细胞因子，从而影响血管和肾脏功能，并促进病理过程的发展（McMaster et al.⁶对此进行了综述）。

根据功能和特征性细胞因子，CD4⁺ 辅助性T淋巴细胞可分为多个亚群：辅助性T细胞1（Th1）、Th2、Th9、Th17、Th22、调节性T（Treg）细胞以及滤泡辅助性T（Tfh）细胞⁷。类似地，CD8⁺ 细胞毒性T细胞可被分为Tc1、Tc2、Tc17或Tc9亚群⁸。此外还存在双阴性T细胞（即不表达CD4或CD8 T细胞标志物的细胞）。其中一部分细胞具有替代性的γδ T细胞受体（而非经典的α和β受体），因此被称为γδ T细胞。通过流式细胞术对表面标志物、细胞因子和转录因子进行多参数分析，是鉴定这些细胞的最佳方法。尽管该方法在免疫学领域被广泛应用，但在实体器官以及心血管疾病背景下的相关描述仍较为有限。

方案

范德比尔特大学机构动物护理和使用委员会已批准本文所述的实验程序。小鼠的饲养和护理均遵循《实验动物护理与使用指南》（国家科学院出版社，2010年修订版）。

1. 小鼠主动脉引流淋巴结、肾脏和主动脉的分离

1. 通过吸入 CO₂ 处死小鼠。用 70% 乙醇喷洒胸部，用剪刀小心切开皮肤和胸壁，暴露心脏。
2. 为灌注血管系统，用 21 或 23 号针头向左心室心尖部稳定注入至少 10 ml 冷磷酸盐缓冲液（PBS）（约 1 ml/秒），同时在右心房做一小切口。持续灌注直至所有器官变白。心脏最先变白，肝脏变白表明灌注效果良好。
3. 使用小型镊子和精细剪刀，轻柔剪除并取出肠道、胃、脾脏、胰腺和肝脏，以更好地暴露主动脉。
   注意：此步骤必须操作精确，因胃肠道损伤可能导致污染。
4. 用剪刀切除并移除双侧肺组织。使用无针头注射器以磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗胸腔。用无菌纱布清除多余血液和液体。
5. 用精细解剖镊子摘除腹主动脉引流淋巴结。注意勿破坏包膜。用解剖镊子去除每个淋巴结表面残留的脂肪组织。用精细剪刀切除双侧肾脏。
6. 用精细弯头剪刀解剖整段主动脉（胸主动脉和腹主动脉）。从心脏水平开始，小心沿食管和椎体分离，向下至髂动脉分叉处，注意保留附着于主动脉周围的血管周围脂肪组织。
   注意：可在显微镜下进一步解剖主动脉以去除周围结构。具体包括去除动脉分支（颈动脉、锁骨下动脉、腹腔干、肠系膜动脉和肾动脉....

结果

本方案描述了在血管紧张素II诱导的高血压小鼠模型中，对从小鼠肾脏、主动脉及主动脉引流淋巴结分离的T细胞进行表面和细胞内标志物鉴定的方法。代表性结果如下所示。

图1展示了用于鉴定从经血管紧张素II输注诱导高血压的野生型小鼠主动脉制备的单细胞悬液中T细胞群体的设门策略。在肾脏和淋巴结中也采用类似策略。调整前向散射面积（FSC-A）和侧向散射面积（SSC-A）电压以检测白细胞群体（G1）并排除碎片。活细胞（G2）对与Pacific Blue偶联的活力标记物呈阴性。随后根据前向散射高度（FSC-H）和前向散射面积（FSC-A）对活细胞设门，仅选择单细胞群体（G3）。然后通过SSC-A和CD45设门选择白细胞（G4）。在此示例中，CD45与AmCyan偶联。最后，T细胞被设门为CD45⁺CD3⁺群体（G5）。在此示例中，CD3与PerCP-Cy5.5偶联。

讨论

本文所述方案已优化，可准确鉴定存在于小鼠肾脏、主动脉和淋巴结中的T细胞亚群。该方案可轻松调整以检测其他免疫细胞亚群，如B淋巴细胞和固有免疫细胞，并可修改用于其他组织类型。消化步骤至关重要，需针对每种组织进行调整和优化⁹。消化时间过长或使用不合适的酶可能影响抗原表达的稳定性；同样，消化不完全也会影响实验结果，导致阳性细胞数量减少。此外，每种细胞类型或细胞因子的体外（ex vivo）刺激时间需仔细调整，以实现最佳刺激效果并尽量减少细胞毒性。

尽管细胞内染色结合流式细胞术分析是研究血液和组织中免疫过程最强大的方法之一，但该技术也存在局限性。这些局限性包括心血管和肾脏组织中免疫细胞的相对数量较少。因此，根据所检测的细胞类型，可能需要合并多只小鼠的器官以获得一个样本。此外，标记物的不稳定性是另一个限制因素，因为在实验过程中多个步骤都可能影响标记物的表达。基于这一原因，建议同时进行组织学分析，以验证流式细胞术获得的结果。在流式细胞仪的使用和结果解读方面也需特别注意。流式细胞仪是一种精密仪器，需要经过高度培训的操作人员。重要的是，尽管使用了补偿对照，仍存在.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胶原酶D	ROCHE	11088882001
胶原酶A	ROCHE	10103586001
胶原酶B	ROCHE	11088815001
Dnase	ROCHE	10104159001
1× 红细胞裂解缓冲液	eBioscience	00-4333-57
RPMI 1640培养基（1×）	Gibco	11835-030
不含钙和镁的DPBS	Gibco	14190-144
Percoll	GE Healthcare	17-5445-02	用于密度梯度离心
GentleMACS™ C管	Miltenyi Biotec	130-096-334
GentleMACS组织解离仪	Miltenyi Biotec	130-093-235	使用SPLEEN_04程序
细胞激活剂混合物（含布雷菲德菌素A）	Biolegend	423303
抗-CD16/32抗体	eBioscience	14-0161-81	按1:100稀释
LIVE/DEAD可固定紫光死细胞染色试剂盒	Life Technologies	L34955
转录因子缓冲液套装	BD Pharmingen	562725
OneComp eBeads	eBioscience	01-1111-42
123计数eBeads	eBioscience	01-1234-42
CD45 AmCyan（克隆号30-F11）	BioLegend	103138
CD3 PerCP-Cy5.5（克隆号17A2）	BioLegend	100218
IL-17A FITC（克隆号TC11-18H10.1）	BioLegend	506910
IL-17F APC（克隆号9D3.1C8）	BioLegend	517004
CD4 APC-Cy7（克隆号GK1.5）	BD Biosciences	560181
CD8 APC（克隆号53-67）	eBioscience	17-0081-82
T-bet PE-Cy7（克隆号4B10）	BioLegend	644823
IFNγ FITC（克隆号XMG1.2）	BD Biosciences	557724