本文描述了利用iCRISPR平台生成人多能干细胞（hPSC）突变细胞系以及将hPSC分化为葡萄糖响应性β样细胞的实验方案。将基因组编辑技术与hPSC定向分化相结合，为系统分析谱系决定因子在人类发育和疾病进展中的作用提供了强有力的平台。
方法文章
利用基因组编辑和hPSC定向分化探究人类胰腺发育中的谱系决定因子
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
在自我更新或分化的人类多能干细胞（hPSCs）中研究基因功能，为在体外理解人类发育过程和解析疾病机制提供了重要的研究平台。充分发挥这一应用潜力，需要高效的基因组编辑工具，以在与疾病相关的基因中构建hPSC突变体，以及 体外 hPSC分化方案以生成与疾病相关的细胞类型，这些细胞类型能够高度模拟其体内对应物 体内 对应物。一种名为iCRISPR的高效hPSC基因组编辑平台已通过TALEN介导的Cas9表达盒靶向技术开发而成 AAVS1 基因座。本文描述了在化学成分明确的培养基中、无饲养层条件下培养的可诱导型Cas9人多能干细胞（hPSC）系的建立方案。详细介绍了利用iCRISPR系统在hPSC中实现基因敲除或精确遗传修饰的操作流程，分别通过非同源末端连接（NHEJ）或借助同源定向修复（HDR）模板实现精确核苷酸编辑。这些技术步骤包括CRISPR向导RNA（gRNA）的设计、制备与转染；通过T7E1或限制性片段长度多态性（RFLP）检测评估CRISPR突变效率；以及克隆突变细胞系的建立与验证。最后，我们记录了通过模拟体内发育过程将hPSC分化为葡萄糖响应性胰腺β样细胞的实验流程 体内 胰腺胚胎发育。结合iCRISPR技术与定向hPSC分化，可系统性研究基因功能，从而加深对胰腺发育及糖尿病疾病机制的理解。
引言
人类多能干细胞（hPSCs）具有自我更新的能力，并可分化为三个胚胎胚层的所有衍生物。它们为细胞替代疗法和疾病建模提供了宝贵的资源，作为一种独特平台，可在人类发育背景下重现细胞过程。此外，它们也是可用于大规模、高通量分析的实验细胞来源。然而，由于存在两个主要挑战，相关进展受到限制：一是缺乏高效的基因修饰工具，二是在培养皿中难以重现复杂的胚胎发育过程。
基因修饰是研究基因在正常发育和疾病中功能不可或缺的工具。然而，尽管通过同源重组的经典基因靶向方法已被证明是解析小鼠胚胎干细胞（mESCs）中基因功能的强大工具1，但该方法在人多能干细胞（hPSCs）中的应用效率极低2,3。近年来，自然界中可编程的位点特异性核酸酶迅速被引入实验室应用，包括锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）以及成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）系统4，这使得基因组编辑在包括hPSCs在内的多种生物体和细胞系中变得更加容易。这些基因编辑工具利用了嵌合核酸酶（如Cas9内切酶）能够在特定位置诱导双链断裂（DSBs）的特性，从而激活细胞内源性DNA修复机制，触发非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）。通过诱导随机插入和缺失突变（indels；via NHEJ）造成移码突变以使基因等位基因失活，或通过精确的核苷酸替换（via HDR）重现患者突变以建立人类疾病模型，或纠正致病突变用于基因治疗，这两种机制均可被用于遗传操作。
CRISPR/Cas介导的基因组编辑需要两个组分：一是恒定的RNA引导型Cas9内切酶，负责DNA切割；二是可变的CRISPR RNA（crRNA）与反式激活crRNA（tracrRNA）双链结构，用于特异性识别DNA靶位点。crRNA/tracrRNA双链可被一个单一的嵌合引导RNA（gRNA）替代，且研究发现后者效率更高5,6,7。尽管CRISPR/Cas9系统已被应用于大多数实验生物和细胞系，但Cas9与gRNA的递送和表达在不同体系中差异显著，仍需进一步优化，以实现在包括人多能干细胞（hPSCs）在内的多种系统中高效进行基因组编辑8。一种高效的基因组编辑平台iCRISPR已在hPSCs中建立5。在该系统中，采用TALEN介导的方法靶向hPSCs中AAVS1位点的两个等位基因——该位点被视为“转基因安全港”"transgene safe harbor locus"，其中一个等位基因插入反向四环素调控转录激活因子（M2rtTA），另一个等位基因插入四环素反应元件（TRE），以驱动Cas9（iCas9）在hPSCs中的表达。在已建立的克隆细胞系（iCas9 hPSCs）中，加入多西环素即可实现Cas9的高水平表达。同时，由于gRNA分子较小（100 nt），单个或多个gRNA均可高效递送至iCas9 hPSCs中，并引导Cas9在特定位点进行DNA切割，从而实现高效的非同源末端连接（NHEJ）介导的基因失活，以及在存在短单链DNA（ssDNA）供体模板的情况下，通过同源定向修复（HDR）实现精确的核苷酸修饰。iCRISPR系统已成功用于构建一系列模拟疾病的hPSC细胞系，这些细胞系在重要发育相关基因中携带双等位基因（纯合或复合杂合）或杂合的功能丧失性突变5,9。尽管已有多个研究团队报道了在hPSCs中使用CRISPR/Cas实现高效基因编辑，但成功案例仍局限于少数技术娴熟的实验室。iCRISPR平台为不同技术水平的研究人员提供了高效且简便的常规基因编辑解决方案，目前已在本课题组及他人的多项已发表研究中得到应用9,10,11,12。该方法还进一步拓展至基于dCas9-KRAB表达的可诱导基因沉默系统13。
随着基因组编辑技术的进步，人类多能干细胞（hPSC）的维持与定向分化也取得了显著进展。hPSC的培养条件已从依赖经辐照的小鼠胚胎成纤维细胞（iMEF）作为饲养层，发展为在明确的细胞外基质成分上进行无饲养层培养；培养基也从复杂的成分组合转变为化学成分明确的培养体系。14这些改进减少了因iMEF制备和knockout血清替代成分的批次间差异所导致的hPSCs变异，从而为hPSC分化提供了更可重复的环境。同时，对调控人类胚胎发育信号通路的深入认识，以及高通量药物筛选的研究发现，也推动了分化方案的优化。15,16,17,18这些方案更真实地模拟 体内 发育阶段并产生高度模拟其来源组织的细胞类型 体内 对应物。对于人多能干细胞（hPSC）向胰腺谱系的分化，早期方案在一定程度上较好地模拟了胰腺的早期发育过程，但最终产生的β细胞具有多激素表型，表现为不成熟的胎儿表型，且对葡萄糖刺激反应较差。近期进展16,17,19,20 已能够生成对葡萄糖有响应的胰腺β样细胞，这将使我们能够研究后续事件，例如单激素β细胞的形成及其进一步成熟过程。
在此，我们详细阐述了结合iCRISPR系统与基于hPSC的方法，利用基因组编辑细胞系研究胰腺发育的应用 体外 向葡萄糖响应性胰腺β样细胞分化的平台。将强大的基因组编辑工具与优化的人多能干细胞（hPSC）分化方案相结合，不仅提供了验证疾病因果关系所需的高效性与规模化能力，还可实现复杂的遗传操作，以进一步深入探究调控正常发育及疾病发生过程中的转录机制9.
方案
本方案基于我们在化学成分明确且无饲养层的条件下对hPSC系H1、HUES8和MEL-1的操作经验（详见材料与仪器表）。对于其他hPSC系或在不同培养条件下维持的hPSC，建议进行进一步优化。
1. 化学成分明确且无饲养层条件下的hPSC培养
- 将培养在iMEF饲养层上的hPSC适应至无饲养层条件。若冻存细胞在直接复苏至无饲养层条件下存活率较低，可先在iMEF条件下复苏，再逐步适应至无饲养层条件。
注意：通常情况下，培养在iMEF饲养层上的hPSC需要经过2次传代才能适应无饲养层条件。 - 每天更换培养基，当细胞融合度达到约80%时进行传代。一般每4–6天以约1:6–1:15的比例传代hPSC。在冻存细胞复苏或传代时，加入10 µM ROCK抑制剂Y-27632。
- 接种hPSC前，用5 µg/mL（1 mL/10 cm2）的截短型重组人源纤连蛋白（VTN）在室温（RT）下预包被培养皿，至少孵育1小时。同时，通过向基础培养基中添加补充剂配制完全化学成分明确的培养基。
- 移除培养基，用不含Ca2+和Mg2+的PBS洗涤细胞一次，然后在室温下用0.5 mM EDTA处理约2–5分钟。
- 在细胞集落尚未完全脱落前吸除EDTA，通过轻柔吹打将hPSC集落分散成小块，并用完全培养基重悬细胞。
- 收集解离后的hPSC，以200 × g离心5分钟。将沉淀的hPSC重悬于完全培养基中，并接种至VTN包被的培养板上。
2. iCas9 hPSC 细胞系的建立
- 订购并扩增以下质粒：AAVS1-TALEN-L、AAVS1-TALEN-R、AAVS1-Neo-M2rtTA 和 AAVS1-Puro-iCas9。
注意：为避免意外的重组事件，转化和扩增质粒时应使用重组缺陷型 Stbl3 感受态细胞，并在 30 °C 下培养。 - 通常，在一个10 cm培养皿中准备人多能干细胞（hPSCs）（约1 × 10⁶个细胞）7 细胞若汇合度约为80%）用于一次靶向实验。
注意：由于电穿孔通常会导致显著的细胞死亡，以及TALEN介导的基因靶向在 AAVS1 位点需要抗生素筛选，因此需要接种相对大量的细胞以鉴定正确靶向的细胞。建议针对每种细胞系和每种培养条件优化药物浓度。 - 开启 第 -1 天（电穿孔前一天），换液时加入10 µM ROCK抑制剂。
- 开启 第0天（电穿孔当天），提前准备VTN包被板。
- 使用1x解离试剂将hPSCs解离为单细胞（详见原文） 材料与设备表）。简而言之，移除培养基，用不含 Ca 的 PBS 洗涤细胞一次2+ 和 Mg2+，将细胞在37 °C下用1倍解离试剂处理约3分钟。在细胞完全脱落前吸除解离试剂。用移液管轻轻吹打，将hPSCs分散成单细胞悬液，溶于10.5 mL完全培养基中。
- 取0.5 mL细胞悬液，使用自动细胞计数仪计数细胞数量。在200 × g离心5分钟以沉淀hPSCs，并将细胞重悬于4 °C预冷的PBS中，浓度为12.5 × 106 cells/mL
- 加入质粒（参见 表1) 加入 800-µL hPSC 悬液（12.5 × 106 细胞/mL），充分混匀。将混合液转移至0.4 cm电穿孔比色皿中，冰上静置约5分钟。
- 使用电穿孔系统在250 V和500 µF条件下对细胞进行电穿孔；电穿孔后观察到的时间常数通常为9–13 ms。
- 电穿孔后，将细胞转移至含有5 mL预热完全培养基的15 mL锥形管中。 成功靶向的关键： 使用健康的增殖性hPSCs，并在电穿孔后的细胞转移、重悬和接种过程中轻柔操作细胞。
- 在200 × g下离心5分钟以沉淀细胞。用10 mL含10 µM ROCK抑制剂的完全培养基重悬细胞，并将细胞以1 × 10⁶、2.5 × 10⁶和5 × 10⁶接种6 将细胞接种至三个已包被VTN的10 cm培养皿中；这可确保至少其中一个培养皿中的细胞以单细胞克隆密度生长并形成足够数量的克隆用于挑取。
- 开启 第1天 （电穿孔后的第二天），更换培养基。
- 开启 第2至5天当细胞汇合度约为60%时，开始新霉素筛选。每天更换含500 µg/mL G418硫酸盐的培养基；通常在G418筛选两天后可观察到明显的细胞死亡。
- 开启 第6天更换不含抗生素的培养基。
- 开启 第7至9天，开始嘌呤霉素筛选。每天更换含1 µg/mL嘌呤霉素二盐酸盐的培养基；次日应观察到明显的细胞死亡。
- 开启 第10天，开始每天更换培养基，不加抗生素筛选，直至人多能干细胞单细胞克隆直径达到1 - 2 mm。
注意：通常情况下，在10 cm培养皿中可观察到约50个菌落，使用2.5 x 106 第0天接种的hPSCs。 - 在体视显微镜下挑选12至24个克隆。使用23号针头（也可用200 µL枪头）将hPSC克隆机械解离成小块（每克隆约10块），并将细胞直接转移至VTN包被的24孔板中。
- 每天更换培养基，直至细胞达到汇合。将24孔板中每孔的细胞传代至6孔板中的两个复孔。
- 当6孔板中的细胞达到融合状态时，取其中一孔用于制备冻存菌种，另一孔用于基因组DNA提取，以进行后续的鉴定。
- 通过PCR基因分型、Southern印迹、RT-qPCR分析、核型分析和多能性检测对已建立的iCas9细胞系进行表征与验证。参见Zhu 等21 有关详细的实验步骤。
3. 使用 iCRISPR 系统生成人多能干细胞突变株
- 人多能干细胞基因敲除系的建立
- gRNA设计与制备
- 选择目的基因中的靶向区域，以最大程度破坏野生型蛋白功能。对于注释完善 的基因，应选择关键功能域上游的区域作为靶向位点；或者，设计gRNA靶向起始密码子下游的区域。针对每个目的基因，应至少选择2个不同的靶向区域。
- 使用在线 CRISPR 设计工具（http://crispr.mit.edu）设计 gRNA。针对每个目标区域，设计 3 条潜在脱靶效应较低的 gRNA，并选择靶向效率最高的一条用于构建单克隆突变系22.
注意：为了实现高效的基因组编辑，建议将gRNA以RNA寡核苷酸形式而非质粒DNA形式递送，因为根据以往经验，小RNA的转染效率高于质粒。 - 订购含有T7启动子序列和可变的20个核苷酸crRNA识别序列的120个核苷酸（nt）DNA寡核苷酸 (N)20 （不含PAM序列）以及恒定的嵌合向导序列。用ddH₂O将寡核苷酸稀释至100 µM的储存液2O，并配制250 nM的工作液。
注意：TAATACGACTCACTATAGGG (N)20GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT - 使用 T7F 和 TracrR 引物对寡核苷酸进行 PCR 扩增（参见 表2以生成用于gRNA的双链DNA（dsDNA）模板 体外 体外转录（IVT）。使用50 µL的PCR反应混合物（参见 表3）和PCR循环条件（参见 表4).
- 使用高产率T7转录试剂盒进行 体外 使用PCR扩增模板在20 µL体系中进行gRNA转录， 体外 gRNA 转录反应体系（参见 表5按照制造商说明书进行操作。使用转录纯化试剂盒，根据制造商说明书纯化gRNA产物。
- 按照制造商说明，根据高通量纯化方案洗脱gRNA（通常为~50–100 µg），溶于100 µL洗脱缓冲液中。尽可能将浓度调整至320 ng/µL（10 µM），并于-80 °C保存备用。
- PCR与Sanger测序引物设计
- 设计并验证可扩增目标区域的PCR引物，产物大小通常在约500 - 1,000 bp范围内。
- 设计结合于PCR产物内部的Sanger测序引物，以实现对PCR产物的直接测序，无需纯化。
- iCas9 hPSCs 中的 gRNA 转染
- 开启 第 -1 天在gRNA转染前24小时，用2 µg/mL多西环素处理iCas9细胞。
- 开启 第0天 在进行gRNA转染之前，提前准备VTN包被的培养板。
- 使用1倍解离试剂将iCas9细胞解离为单细胞，具体操作如步骤2.5所述。
- 在 200 × g 条件下离心 hPSCs 5 分钟，收集细胞沉淀，并将细胞重悬于约 0.5 × 10⁶ 个/mL 的密度6 细胞/mL，完全培养基中添加 2 µg/mL 多西环素和 10 µM ROCK 抑制剂。
- 将重悬的细胞以每孔0.5 mL接种至24孔板的各个孔中。另设若干孔作为未转染对照。
- 为每种gRNA制备以下转染混合物：混合物A，50 µL低血清培养基 + 1 µL gRNA（10 µM）；混合物B，50 µL低血清培养基 + 3 µL转染试剂。
- 将混合液A和B混合，制成100 µL混合液。室温孵育5分钟。取50 µL混合液加入24孔板的复孔细胞中，充分混匀。
- 开启 第1天如有需要，可进行第二次转染以进一步提高靶向效率；否则更换不含多西环素的培养基。
- 开启 第2 - 3天每天更换培养基。
- 开启 第4天使用DNA提取试剂盒，从每孔转染和未转染的对照细胞中提取基因组DNA。将浓度调整至50 ng/µL。
- PCR扩增gRNA靶向序列侧翼的目标区域，并采用T7内切酶I（T7EI）消化法或限制性片段长度多态性（RFLP）分析来评估编辑效率，具体操作如前所述5.
- T7EI 检测
- 使用在步骤3.1中设计并验证的引物对目标区域进行PCR扩增。
- 制备混合物（参见 表6）并使用下述条件对PCR产物进行DNA变性及杂交 表7.
注意：根据我们的经验，在使用我们的PCR条件时，T7EI检测通常无需纯化PCR产物。然而，在其他条件下，纯化步骤可能具有益处。 - 在37 °C下使用10 µL变性并杂交的PCR产物和0.2 µL（2 U）T7E1（10 U/µL）进行T7EI消化反应，持续30分钟。
- 通过凝胶电泳分离经T7E1消化的PCR样本。使用ImageJ确定切割与未切割DNA条带的相对强度。利用公式计算插入缺失（indel）频率：(1 - (√(1-(b+c))/(a+b+c))) × 100，其中 a 是未消化的PCR产物的强度，且 b 和 c 是T7E1切割产物的强度。
- RFLP 分析
注意：当限制性酶切位点位于非常接近的位置时（< 5 bp）至Cas9切割位点（PAM序列5'端上游3 bp）的区域，可进行RFLP分析以定量插入缺失（indel）频率。- 使用与步骤 3.1.4.1 中所述相同的 PCR 产物。
- 用一种限制性内切酶消化PCR产物，该酶的限制性位点应位于Cas9切割位点附近。
- 通过凝胶电泳分离消化后的PCR样本。使用ImageJ确定切割与未切割DNA条带的相对强度。利用公式：a / (a+b+c) × 100 计算插入缺失（indel）频率，其中 a 未消化的PCR产物的强度 b 和 c 是消化产物的强度。
- 克隆突变株系的建立
注意：利用转染gRNA的iCRISPR系统对hPSCs进行基因组编辑具有高效性，无需抗生素筛选。为建立单克隆细胞系，需以相对较低的密度接种细胞，以确保形成源自单个细胞的克隆。- 筛选编辑效率最高（通过T7EI或RFLP检测）且细胞存活率良好的gRNA，利用对应的重复孔进行克隆突变株系的建立。
- 使用1×解离试剂将hPSCs解离为单细胞悬液，具体操作如步骤2.5所述。将500、1,000和2,000个细胞分别接种至三个VTN包被的10 cm培养皿中。
- 每天更换培养基，直至单细胞克隆的直径达到约 2 mm。
- 根据T7EI和/或RFLP检测对靶向效率的估计结果，为每个gRNA挑选24至48个克隆。使用23号针头（也可用200 µL枪头）将每个克隆机械性地分散成小块（约每克隆10块），然后将细胞重铺至两个经VTN包被的96孔板中，每孔重复接种。一个96孔板用于基因组DNA提取及Sanger测序，另一个用于后续扩增培养。
- 当96孔板中的细胞达到融合状态时，采用以下简化的方案提取基因组DNA（无需苯酚/氯仿抽提）。
- 移除培养基，用不含 Ca 的 PBS 洗涤细胞一次2+ 和 Mg2+加入50 µL裂解缓冲液（含5 µL蛋白酶K（10 mg/mL）、5 µL 10x PCR缓冲液和40 µL ddH₂O）2向96孔板的每个孔中加入O。用封板膜密封，在55 °C下孵育过夜。
- 第二天，将细胞裂解液转移至96孔PCR板中，在PCR仪中99 °C孵育10分钟，以灭活蛋白酶K。
- 使用与T7EI或RFLP检测相同的引物，以1 µL细胞裂解液为模板，对目标区域进行PCR扩增。
- 使用1 µL PCR产物进行Sanger测序，测序引物结合于PCR产物内部的引物结合位点。
- 扩增带有移码插入缺失突变的克隆用于制备冻存菌种。同时，从同一靶向实验中扩增数个野生型克隆，作为后续实验的同基因型对照品系。
- gRNA设计与制备
- 产生具有精确核苷酸改变的突变品系
注意：与通过非同源末端连接（NHEJ）产生的敲除突变体相比，在存在DNA修复模板的情况下，可通过同源定向修复（HDR）实现精确的核苷酸改变。此类精确的核苷酸改变可用于在野生型人多能干细胞（hPSCs）中引入患者特异性突变，或用于校正患者来源的诱导多能干细胞（iPSCs）中的突变。- ssDNA作为HDR模板的设计
- 设计并合成2-3个位于患者特异性突变位点附近的gRNA，具体方法见步骤3.1.1。
- 设计一条单链DNA（ssDNA），其中包含患者特异性的突变位点，并在其两侧各带有约40–80个核苷酸的同源序列，作为HDR模板。
- 为减少正确修复后的额外切割，可在单链DNA模板的gRNA识别序列内、靠近PAM序列的区域，或在PAM序列本身（若可能）引入一个同义突变。
- 如果可能，设计同义突变时可同时引入一个新的限制性酶切位点，以便利用RFLP分析评估修复效率。
- gRNA/ssDNA 共转染及单克隆细胞系的建立
- 按照步骤3.1.3所述方法，将gRNA/ssDNA共转染至iCas9细胞中，使用转染混合物A和B。针对每种gRNA及非转染对照组，均在24孔板中设置两个复孔进行转染。混合物A：50 µL低血清培养基 + 1 µL gRNA（10 µM） + 2 µL ssDNA（10 µM）。混合物B：50 µL低血清培养基 + 3 µL转染试剂。
- 转染后，从每种转染和未转染对照细胞的一个孔中提取基因组DNA，并利用以下方法估算修复效率 T7EI 和/或限制性片段长度多态性分析
- 确定修复效率最高且细胞存活良好的gRNA/ssDNA混合物，并使用相应的重复孔进行克隆突变株系的建立。
- 根据T7EI和/或RFLP检测对靶向效率的估计，挑取48至96个菌落。通常情况下，HDR介导的突变效率低于敲除突变，因此需要挑取更多菌落。
- 按照步骤 3.1.6 中所述，进行序列测定、扩增和克隆株系的验证。
- ssDNA作为HDR模板的设计
4. 体外 人多能干细胞向葡萄糖响应性胰岛β细胞的分化
注意：体外将人多能干细胞（hPSC）突变体分化为与疾病相关的细胞类型，为在培养皿中进行疾病建模提供了平台。以下方案重点介绍将hPSCs 体外分化为葡萄糖响应性胰腺β细胞，用于胰腺发育和糖尿病研究9,16,17。
- hPSC 向定型内胚层分化
- 按照步骤 1 所述，在化学成分明确且无饲养层的条件下维持 hPSC 突变体及野生型对照细胞系。
- 为准备 hPSC 分化，使用 1× 解离试剂将 hPSC 解离，并将其分散为单细胞悬液，置于完全培养基中。
- 在 200 × g 条件下离心 5 分钟，沉淀细胞，然后用含 10 µM ROCK 抑制剂的完全培养基重悬细胞。计数细胞数量，并以约 1.4 × 105 个细胞/cm2 的密度接种于 VTN 包被的培养板上。
- 接种后 24 小时更换培养基。
- 在 第 0 天，当细胞在 48 小时后达到约 80% 汇合度时，开始分化。
注：为获得较高的胰腺分化效率，建议针对每条细胞系优化 48 小时时的接种密度和汇合度。 - 吸除 hPSC 培养基，并用不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS 清洗细胞一次。
- 更换为分化第 0 天（d0）培养基。
- 在 第 1–2 天，根据 表 8 中的配方每日更换分化培养基。
- 在 第 3 天，通过免疫荧光染色和流式细胞术分析检测定型内胚层标志物 SOX17、FOXA2 和 CXCR4。
- 定型内胚层向胰腺前体细胞分化
- 在 第 3–9 天，根据 表 9 中的配方每日更换培养基，继续将定型内胚层向胰腺谱系分化。
- 在 第 7 天，通过免疫荧光染色和流式细胞术分析检测早期胰腺前体细胞（PP1）标志物 PDX1。
- 在 第 10 天，检测晚期胰腺前体细胞（PP2）标志物 PDX1 和 NKX6.1。同时，准备将 PP2 细胞转移至气液界面，以进一步分化为胰腺内分泌细胞。
- 在气液界面中进行胰腺内分泌分化
- 在解离前 4 小时，用 10 µM ROCK 抑制剂处理 PP2 细胞。
- 移除培养基，并用不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS 清洗细胞一次。
- 向一个 10 cm 培养皿中的 PP2 细胞加入 2 mL 1× 解离试剂，在 37 °C 下孵育 2–3 分钟。
- 在细胞尚未完全脱落前吸除解离试剂。加入 10 mL BLAR 培养基，通过轻柔吹打将 PP2 细胞分散为单细胞。
- 收集单细胞悬液。计数细胞数量，并在 200 × g 条件下离心 5 分钟以沉淀细胞。
- 用 S5 分化培养基将细胞沉淀重悬至浓度约为 0.5 × 105 个细胞/µL，并在 Transwell 插件滤膜上每点接种 5–10 µL 细胞。每个 6 孔插件放置 10–15 个点，每个 10 cm 插件放置约 100 个点。
- 向每个 Transwell 插件的底部加入 S5 培养基，6 孔插件加约 1.5 mL，10 cm 插件加约 8 mL。
- 根据 表 10 中的配方每日更换培养基。
- 在第 34 天通过免疫荧光染色和流式细胞术分析检测胰腺内分泌标志物 PDX1、NKX6.1、NEUROD1、NKX2.2、INSULIN 和 GLUCAGON17。
- 通过葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）实验检测 hPSC 来源的类 β 细胞功能16,17。
结果
人多能干细胞化学成分明确且无饲养层培养的适应与维持
在无饲养层培养条件下，培养于iMEF饲养层上的hPSCs可快速适应VTN包被的培养板。适应过程中可采用与常规iMEF饲养层培养相同的传代比例。 图1A 显示了人多能干细胞（hPSCs）在含KSR培养基中接种于iMEF饲养层上的典型形态，以及在VTN包被表面的无饲养层培养体系中的典型形态。 图1B 显示了人多能干细胞（hPSC）在适应性培养第一代（4天）期间典型的形态学变化及克隆生长情况。细胞可进一步传代或冻存以用于后续实验。在开始分化实验前，应完成2–3代的适应性培养。建议在适应性培养后进行核型分析，尽管我们在适应性阶段尚未观察到核型异常。
通过 TALEN 介导的 AAVS1 靶向生成 iCas9 hPSC 细胞系
如先前所示，hPSCs 通过电穿孔法转染了一对 AAVS1 TALEN 质粒以及 Cas9 和 M2rtTA 质粒5. 图 2A 和 B 展示了详细的供体质粒靶向设计以及生成iCas9 hPSC克隆细胞系的完整流程。抗生素筛选后，具有适当大小和典型hPSC形态的单细胞来源克隆即可进行挑取（电穿孔后10 - 12天） 图2C）。通常约 50% 的克隆正确靶向且无随机整合，经 Southern 印迹法验证（图 2D)5随机整合可能导致在未使用多西环素处理的情况下出现Cas9的渗漏表达。
利用iCRISPR平台在hPSCs中实现高效的基因修饰
在已建立的iCas9 hPSCs中，通过多西环素处理可诱导Cas9表达，并由转染的gRNAs引导至靶位点，从而产生DNA双链断裂（DSBs）。在无修复模板的情况下，细胞通过非同源末端连接（NHEJ）进行DNA修复，产生插入或缺失（indels），通常导致基因功能破坏或基因敲除。当存在修复模板（例如，单链DNA供体）时，则可利用同源定向修复（HDR）实现精确的遗传修饰，例如在野生型hPSC背景下引入患者特异性突变，或在患者来源的iPSCs中校正致病相关遗传变异（图3A）。利用iCRISPR系统生成克隆突变细胞系约需1个月时间。在诱导iCas9表达并转染gRNA后，采用T7EI和/或RFLP检测评估Cas9切割效率，随后将转染后的细胞以单细胞形式低密度接种至10 cm培养皿中（约500–2,000个细胞/10 cm培养皿）。10–12天后，将单细胞来源的克隆转移至96孔板中进行扩增及进一步表征（即，基因型鉴定和Western blotting）（图3B）。由于iCRISPR介导的基因敲除效率很高，无需进行筛选步骤，通常可轻松获得20–50%的双等位基因突变细胞（图3C）5。为实现高效且精确的遗传修饰，可将gRNA与携带特定序列改变的单链DNA供体共转染（用于实现基因组序列的小而特异性的改变）。通常，为防止在已修饰等位基因中再次被切割，建议在PAM序列附近或其中引入一个同义突变（图3D）。利用该系统，约有10%的克隆可在两个等位基因上均携带目标HDR介导的基因组修饰且无额外改变（图3E）。通过iCRISPR平台对hPSC基因组进行快速而精确的修饰，使我们能够快速高效地构建用于研究人类发育与疾病的hPSC模型细胞系。
人多能干细胞向葡萄糖响应性β样细胞的高效分化
近年来，人多能干细胞（hPSC）向胰腺分化的研究取得了进展，使得开发出能够紧密模拟胰腺胚胎发育过程的分化方案成为可能。未分化的hPSC首先分化为定型内胚层，随后分化为PDX1+早期胰腺前体细胞（PP1）和PDX1+NKX6.1+晚期胰腺前体细胞（PP2），最终生成对葡萄糖有响应的β样细胞16,17,19,20,23,24。这些方案进一步优化后，可稳定地生成PDX1+NKX6.1+胰腺前体细胞以及对葡萄糖有响应的β样细胞9。图4A展示了各分化阶段所使用的详细化学添加剂。通常情况下，在初始细胞接种后2天达到约80%的融合度时，是启动HUES8 hPSC分化过程的理想时机（图4B）。强烈建议测试多种不同的接种密度，以确定每种特定细胞系的最佳条件。通常可在定型内胚层阶段获得至少75%的FOXA2+SOX17+细胞，在PP2阶段获得40%的PDX1+NKX6.1+细胞（图4C）。在S5阶段，细胞聚集体周围出现类似光晕的形态，是细胞存活良好的指标，这对于进一步分化为NKX6.1+CPEP+、对葡萄糖有响应的β样细胞至关重要（图4D）。该方案适用于在体外研究人类胰腺发育及疾病。
图1. hPSC 化学成分明确且无饲养层的维持培养及从 iMEF 饲养层向无饲养层培养的适应过程。（A）第4天在iMEF饲养层或VTN上培养的hPSC代表性图像，已准备进行传代。（B）hPSC从iMEF饲养层转入无饲养层培养后首次传代期间的典型形态。第4天在iMEF饲养层上培养的hPSC被传代并接种至经VTN包被的培养板中，使用含ROCK抑制剂的化学成分明确培养基。传代比例与常规在iMEF饲养层条件下培养时的传代比例相同。此后每天更换培养基，但不再添加ROCK抑制剂。请点击此处查看该图的放大版本。
图2. iCas9 hPSC细胞系的建立。（A）构建iCas9 hPSC细胞系的靶向策略。通过一对AAVS1位点特异的TALENs，将Puro-Cas9供体质粒和Neo-M2rtTA供体质粒靶向整合至人AAVS1基因座。（B）完整靶向过程的示意图，包括电穿孔、抗生素筛选、克隆挑取与扩增，以及细胞系鉴定。（C）电穿孔后约10至12天，准备挑取的代表性单细胞克隆。（D）Southern印迹检测结果示例，用于鉴定未发生额外质粒整合的正确靶向克隆，正确克隆以红色标记。（A）和（D）经许可改编自参考文献5。请点击此处查看该图的放大版本。
图3. 利用iCRISPR系统在hPSCs中实现高效遗传修饰。 （A）使用iCRISPR系统生成基因敲除突变体或进行精确基因修饰的示意图。（B）靶向操作流程与克隆细胞系的建立。（C）通过NHEJ途径在hPSCs中实现的基因敲除效率9。（D）携带特定核苷酸修饰的ssDNA设计。P（红色）：患者特异性突变；X（绿色）：沉默突变。（E）HDR介导的精确核苷酸修饰效率。利用iCRISPR系统在GATA6 位点引入了一个精确的R456C突变（由特定核苷酸C>T突变引起）。（详见参考文献5）。图（C）和图（E）分别改编自参考文献9和参考文献5，并已获得授权。请点击此处查看该图的放大版本。
图4. hPSCs定向分化为葡萄糖响应性胰腺β样细胞。 （A）详细分化方案示意图，显示各分化阶段所添加的化学物质。分化过程中被激活或抑制的信号通路分别以绿色或红色标出。CHIR：GSK3抑制剂；GDF8：生长分化因子8，又称肌抑素（myostatin），属于TGF-β蛋白家族；HH：Hedgehog信号通路；DE：定型内胚层；PP1：PDX1+早期胰腺前体细胞；PP2：PDX1+NKX6.1+晚期胰腺前体细胞。（B）hPSCs接种后48小时，准备启动分化时的典型细胞汇合度（70–80%）。（C）代表性免疫荧光染色图像，显示定型内胚层（DE）阶段（FOXA2与SOX17共染色）、胰腺前体细胞阶段（PP2：PDX1与NKX6.1共染色）以及葡萄糖响应性β样细胞阶段（NKX6.1与C-肽共染色）的分化结果。通常，若要在β样细胞阶段获得超过10%的NKX6.1+CPEP+细胞，则在相应阶段需达到至少75%的FOXA2+SOX17+定型内胚层细胞，以及至少40%的PDX1+NKX6.1+ PP2细胞。（D）在气液界面培养条件下，S5阶段细胞聚集体在插入式滤膜上的典型形态。存活细胞迁移至聚集体中心（呈深色），边缘则形成类似光晕的结构。（A）和（D）经授权改编自参考文献9。请点击此处查看该图的高清版本。
| 质粒 | 用量 |
| AAVS1-TALEN-L | 5 µg |
| AAVS1-TALEN-R | 5 µg |
| AAVS1-Puro-iCas9 | 40 µg |
| AAVS1-Neo-M2rtTA | 40 µg |
表1
| 引物 | 序列 |
| T7F | TAATACGACTCACTATAGGG |
| TracrR | AAAAGCACCGACTCGGTGCC |
表2
| 组分 | 用量 |
| ddH2O | 35.5 μL |
| 5x PCR 反应缓冲液 | 10 μL |
| dNTP 混合液 (25 mM) | 0.5 μL |
| T7F (10 µM) | 1.25 μL |
| TracrR (10 μM) | 1.25 μL |
| T7-gRNA IVT 模板 (250 nM) | 1 μL |
| DNA 聚合酶 | 0.5 μL |
| PCR 总反应体系 | 50 μL |
表3
| PCR 循环条件 | |||
| 循环次数 | 变性 | 退火 | 延伸 |
| 1 | 94 ºC, 2 min | ||
| 2-31 | 94 ºC, 20 s | 60 ºC, 20 s | 72 ºC, 1 min |
| 32 | 72 ºC, 2 min | ||
表4
| 组分 | 量 |
| T7 ATP | 2 μL |
| T7 CTP | 2 μL |
| T7 GTP | 2 μL |
| T7 UTP | 2 μL |
| T7 10x 缓冲液 | 2 μL |
| T7 酶混合物 | 2 μL |
| PCR 扩增模板 | 8 μL |
| 总计 体外 gRNA 转录反应体系 | 20 μL |
| 37 ºC 下孵育 6 小时至过夜 |
表5
| 组分 | 体积 (μL) |
| 未纯化的 PCR 产物 | 8 |
| Buffer 2 10x | 2 |
| 蒸馏水 (dH2O) | 10 |
表6
| DNA 变性与杂交循环条件 | ||
| 温度 | 持续时间 | PCR 仪运行条件 |
| 95 °C | 10 min | |
| 85 °C | 1 min | 以 2 °C/s 的速率升至 85 °C |
| 75 °C | 1 min | 以 0.3 °C/s 的速率升至 75 °C |
| 65 °C | 1 min | 以 0.3 °C/s 的速率升至 65 °C |
| 55 °C | 1 min | 以 0.3 °C/s 的速率升至 55 °C |
| 45 °C | 1 min | 以 0.3 °C/s 的速率升至 45 °C |
| 35 °C | 1 min | 以 0.3 °C/s 的速率升至 35 °C |
| 25 °C | 1 min | 以 0.3 °C/s 的速率升至 25 °C |
| 4 °C | 保持 | |
表7
| 阶段 | 天数 | 培养基 | 添加物 | |
| S1 | d0 | S1 | GDF8 100 ng/mL | CHIR-99021 3 µM |
| d1 | S1 | GDF8 100 ng/mL | CHIR-99021 0.3 µM | |
| d2 | S1 | GDF8 100 ng/mL | ||
| S1 培养基：MCDB 131 + 1x L-谷氨酰胺补充剂 + 0.5% BSA + 1.5 g/L NaHCO3 + 10 mM 葡萄糖 | ||||
表8
| 阶段 | 天数 | 培养基 | 添加剂 | |||||||
| S2 | d3-d4 | S1 | LAA 0.25 mM | FGF7 50 ng/mL | IWP-2 2.5 µM | |||||
| S3 | d5-d6 | S3 | LAA 0.25 mM | FGF7 50 ng/mL | SANT-1 0.25 µM | RA 1 µM | LDN 100 nM | TPB 200 nM | ITS-X 1:200 | |
| S4 | d7-d9 | S3 | LAA 0.25 mM | FGF7 2 ng/mL | SANT-1 0.25 µM | RA 0.1 µM | LDN 200 nM | TPB 100 nM | ITS-X 1:200 | IWP-2 2.5 µM |
| S3 培养基：MCDB 131 + 1x L-谷氨酰胺添加剂 + 2% BSA + 2.5 g/L NaHCO3 + 10 mM 葡萄糖 | ||||||||||
表9
| 阶段 | 天数 | 培养基 | 添加物 | |||||||
| S5 | d10-d12 | S5 | T3 1 µM | ALK5i II 10 µM | SANT-1 0.25 µM | RA 0.05 µM | LDN 100 nM | ITS-X 1:200 | ZnSO4 10 µM | Heparin 10 µg/mL |
| S6 | d13- d19 | S5 | T3 1 µM | ALK5i II 10 µM | GSiXX 100 nM | LDN 100 nM | ITS-X 1:200 | ZnSO4 10 µM | Heparin 10 µg/mL | |
| S7 | d20- d33 | S5 | T3 1 µM | ALK5i II 10 µM | N-Cys 1mM | Trolox 10 µM | R428 2 µM | ITS-X 1:200 | ZnSO4 10 µM | Heparin 10 µg/mL |
| S5 培养基：BLAR + 1x L-谷氨酰胺补充剂 + 2% BSA + 1.5 g/L NaHCO3 + 20 mM 葡萄糖 | ||||||||||
表10
讨论
创建突变品系的时间安排
尽管基于CRISPR/Cas系统的基因组编辑新方法已成功实现靶向编辑，但若要进行更大规模的基因功能分析，仍需要一种更高效且通用的平台。iCRISPR平台提供了一种快速且高效的方法，可用于对任何目的基因引入突变5,9。首先，基于PCR的gRNA合成方法可在一天内以阵列化形式生成数百个gRNA，无需耗时的克隆步骤。其次，由于iCas9 hPSCs中Cas9的表达由多西环素诱导，gRNA转染步骤所需操作极少，因此可同时开展多个gRNA靶向实验。第三，由于本系统可实现较高的靶向效率，对每个转染的gRNA分析约24–48个克隆即足以建立针对单个基因的多个单等位和双等位突变细胞系，尽管效率因靶位点而异。由于经过培训的操作人员可在一次操作中机械挑取384个克隆（相当于4块96孔板），在解剖显微镜下耗时约4小时，因此可预期一名熟练人员在1–2个月内生成影响12个基因的突变细胞系。在短时间内高效生成hPSC突变体，使得能够系统性分析一系列相互作用、调控发育过程的转录因子和/或信号通路组分9。此外，高效的多重基因靶向也为研究复杂人类性状背后的遗传相互作用提供了可能。
精确基因修饰的构建
从易于获取的体细胞类型中获得患者特异性的诱导多能干细胞（iPSCs），并将其分化为与疾病相关的细胞类型，为功能验证疾病相关突变提供了重要机遇。然而，由于个体间遗传背景存在较大差异，直接比较患者来源与健康供体来源的iPSCs可能难以区分疾病表型与背景遗传效应。因此，有必要通过将致病突变修复为野生型序列，或如先前研究者所提出的，将患者特异性突变引入野生型人多能干细胞（hPSC）背景中，从而构建同基因型对照iPSCs25,26。除了功能缺失型（无效）突变外，目前还可通过将患者特异性序列变异精确引入hPSC的内源性基因位点，更深入地解析疾病机制，包括研究功能增强型（hypermorphic）、功能减弱型（hypomorphic）、获得新功能型（neomorphic）或显性负效应型（dominant-negative）的患者突变。
精确的基因修饰利用同源定向修复（HDR）在存在修复模板的情况下对双链断裂（DSB）进行修复。由于其效率远低于非同源末端连接（NHEJ）介导的DNA修复，以往通常使用包含患者特异性突变、药物筛选标记盒以及同源臂的供体质粒作为修复模板2。在完成药物筛选并验证患者特异性突变后，通常需要第二步操作以去除药物筛选标记盒。尽管目前最常用的Cre-loxP和FLP-FRT系统会在内源性基因座中留下残余序列，但利用piggyBac转座子可实现药物筛选标记盒的无缝移除27。最近的研究还表明，短单链DNA（ssDNA）模板也可支持工程化DNA核酸酶介导的高效HDR28。与供体质粒相比，ssDNA可直接合成，从而避免了耗时的克隆步骤。本文证明，通过共转染gRNA和ssDNA模板以诱导同源定向修复，iCRISPR可高效引入特定的核苷酸修饰。这对于解析蛋白质功能域中关键核苷酸的作用至关重要，同时也可用于模拟人类疾病相关突变，并有望为治疗性干预提供纠正这些致病突变的手段。由于存在大量易感位点，且每个位点均与多种序列变异相关，遗传学家在构建糖尿病等复杂多基因疾病的模型方面一直面临挑战。由于iCRISPR平台允许快速生成等位基因系列或实现多重基因靶向，因此可促进对多个疾病相关位点的研究，无论是在单个背景下还是在等基因背景下联合分析。
靶向效率与脱靶效应
我们发现，T7E1 和 RFLP 检测结果与通过测序鉴定出的突变株系数量之间具有良好的相关性。这强调了在建立单克隆株系时，平行开展这些检测的重要性。尽管靶向效率可能因基因组位点的不同而有所差异，但在大多数单基因靶向实验中，有 20 - 60% 的克隆在两个等位基因上均发生突变（包括同框突变和移码突变）9。在进行多重基因靶向的情况下，获得了效率为 5-10% 的三重双等位基因突变克隆5。此外，还通过 ssDNA 介导的 HDR 对多个基因进行了精确的遗传修饰，获得纯合敲入克隆的效率范围为 1 - 10%5。在 hPSCs 中使用 CRISPR/Cas 进行研究时，尚未检测到潜在脱靶位点中存在与 gRNA 靶序列不同的突变5,9,12。最近一项研究中进行的全基因组测序也未能在使用 CRISPR/Cas 生成的单克隆 hPSC 株系中发现显著的脱靶突变29。然而，为了尽量减少脱靶效应位点突变可能引入的干扰表型的影响，建议使用至少两个针对同一基因内不同序列的独立 gRNA 生成独立的突变株系。若在使用不同 gRNA 生成的多个株系中观察到相似的表型，则原则上可排除该表型来源于脱靶效应的可能性。
饲养层依赖性与非依赖性培养及靶向
传统的人多能干细胞（hPSC）培养方法依赖于饲养层细胞，并使用含有血清或含动物源成分（如牛血清白蛋白）的血清替代物的培养基进行维持和扩增。饲养层细胞、血清、血清替代物和白蛋白均含有复杂且未明确定义的成分，且存在显著的批间差异。采用无饲养层且化学成分明确的培养条件，可显著减少hPSC维持所需的工作量，更重要的是，提高了分化实验的一致性。目前，极少有研究描述在完全定义的培养条件下对hPSC进行基因组编辑的操作流程30。我们发现，在无饲养层条件下进行gRNA转染和单克隆接种时，CRISPR靶向效率高于依赖饲养层的培养条件。我们认为，这归因于转染后细胞存活率提高，以及单细胞接种形成克隆的效率更高。此外，已有研究显示，饲养层细胞可吸附转染试剂，从而降低转染效率。
将基因组编辑与定向分化相结合
既往的分化方案仅能获得少量胰岛素阳性细胞，其中大多数为多激素细胞，且类似于胎儿内分泌细胞23。近年来的进展已实现将人多能干细胞（hPSCs）分化为更成熟的、具有葡萄糖响应功能的类β细胞16,17,19,20。使用HUES8 hPSCs，我们通常可获得至少75%的定型内胚层细胞、40%的PDX1+NKX6.1+胰腺前体细胞，以及约20%的NKX6.1+CPEP+葡萄糖响应性类β细胞9。当该更稳定的分化方案与iCRISPR基因组编辑系统结合时，有助于分析在胰腺前体细胞及内分泌细胞分化阶段起关键作用的转录因子。这将使未来的研究能够对大量候选致病基因进行功能验证，并深入探究糖尿病发病机制9。
未来应用或发展方向
我们的iCRISPR系统可能有助于实现更复杂的基因组修饰，例如通过HDR介导的基因靶向，利用编码蛋白标签或荧光报告分子的长片段供体DNA模板创建报告等位基因。12我们已证明，由于该系统实现了较高的CRISPR靶向效率，此过程可在hPSCs中进行，无需进一步的药物筛选。12. 此外，多重基因靶向可用于研究复杂人类疾病背后的遗传相互作用，正如我们最近的研究所示，据我们所知，这是此类工作的首个实例31iCRISPR 还可用于通过在非编码 RNA 或基因调控区域（如启动子和增强子）中创建缺失来研究基因调控机制。为了高效利用 iCRISPR 生成调控突变体，可设计 gRNA 以破坏 DNA 结合蛋白的结合位点，包括但不限于基础转录机制或组织特异性转录因子。此外，还可利用 ssDNA 模板介导的 HDR 来突变特定的蛋白质结合位点。最后，我们预计进一步优化后，iCRISPR 平台可结合高通量遗传分析，用于人多能干细胞（hPSCs）中多能性表型或疾病表型的研究 体外 分化方案。这些由iCRISPR介导的研究可能有助于更快速地鉴定候选的疾病相关基因，并研究其功能相关性。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作部分由美国国立卫生研究院/国家糖尿病、消化与肾脏疾病研究所（NIH/NIDDK R01DK096239）和纽约州干细胞科学计划（NYSTEM C029156）资助。Z.Z. 获斯隆凯特林研究所干细胞生物学中心的纽约州干细胞科学计划博士后奖学金支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 化学成分明确的培养基（E8） | 赛默飞世尔科技 | A1517001 | Essential 8 基础培养基和 Essential 8 添加剂包含在内 |
| 截短型重组人源连环蛋白 | 赛默飞世尔科技 | A14700 | |
| ROCK抑制剂Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | |
| 解离试剂（TrypLE Select 酶） | 赛默飞世尔科技 | 12563029 | 1x，无动物源成分，重组酶 |
| G418硫酸盐 | 赛默飞世尔科技 | 10131035 | 遗传霉素选择性抗生素 |
| 嘌呤霉素二盐酸盐 | Sigma-Aldrich | P8833 | 嘌呤霉素选择性抗生素 |
| DNA聚合酶（Herculase II融合酶） | 安捷伦科技 | 600679 | PCR试剂盒 |
| MEGAshortscript T7 转录试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | AM1354 | |
| MEGAclear 转录纯化试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | AM1908 | |
| 盐酸多西环素 | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| Opti-MEM 培养基 | 赛默飞世尔科技 | 31985062 | 低血清培养基 |
| Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂 | 赛默飞世尔科技 | 13778150 | |
| DNeasy 血液 & 组织试剂盒 | QIAGEN | 69504 | 基因组DNA提取试剂盒 |
| 蛋白酶K | 罗氏 | 3115879001 | |
| MCDB 131 培养基 | 赛默飞世尔科技 | 10372-019 | |
| BLAR 培养基 | 赛默飞世尔科技 | 根据已发表配方定制 等, 2014) | |
| L-谷氨酰胺补充剂（GlutaMAX） | 赛默飞世尔科技 | 35050061 | |
| NaHCO₃3 | 赛默飞世尔科技 | 144-55-8 | |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| BSA | LAMPIRE 生物实验室 | 7500855 | 无脂肪酸 |
| GDF8 | PeproTech | 120-00 | |
| CHIR-99021 | Stemgent | 04-0004 | GSK-3抑制剂 |
| L-抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | A4544 | 维生素C |
| FGF7 | R&D Systems | 251-KG | |
| SANT1 | Tocris Bioscience | 1974 | Hedgehog抑制剂 |
| RA | Sigma-Aldrich | R2625 | 视黄酸 |
| LDN | Stemgent | 04-0019 | BMP抑制剂 |
| IWP-2 | Tocris Bioscience | 3533 | Wnt拮抗剂 |
| ITS-X | 赛默飞世尔科技 | 51500-056 | |
| TPB | EMD Millipore | 565740-1MG | PKC 激活剂 |
| 3,3’三碘甲状腺原氨酸（T3） | Sigma-Aldrich | T6397 | |
| ALK5i II | Enzo Life Sciences | ALX-270-445 | ALK5抑制剂II |
| ZnSO4 | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| 肝素 | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| GSiXX | EMD Millipore | 565789 | γ分泌酶抑制剂XX，NOTCH信号通路抑制剂 |
| N-乙酰半胱氨酸（N-Cys） | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| Trolox | EMD Millipore | 648471 | 维生素E类似物 |
| R428 | Selleck Chemicals | S2841 | AXL受体酪氨酸激酶抑制剂 |
| 24 mm Transwell 嵌插式培养小室 | 康宁生命科学 | 3414 | |
| Gene Pulser Xcell 电穿孔系统 | Bio-Rad | 1652660 | |
| 0.4 cm 电穿孔比色皿 | 伯乐（Bio-Rad） | 1652081 | |
| AAVS1-TALEN-L | Addgene | 59025 | |
| AAVS1-TALEN-R | Addgene | 59026 | |
| AAVS1-Neo-M2rtTA | Addgene | 60843 | |
| AAVS1-Puro-iCas9 | Addgene | 58409 | |
| T7 内切酶 I | NEB | M0302L | |
| 缓冲液2 | NEB | B7002S | NEBuffer 2 |
| 长寡核苷酸 | Eton Bioscience 或 IDT | ||
| SOX17 抗体 | R&D Systems | AF1924 | 1:500 |
| FOXA2 抗体 | 默克密理博 | 07-633 | 1:100 |
| CXCR4-APC 抗体 | R&D Systems | FAB170A | 1:25 |
| PDX1 抗体 | R&D Systems | AF2419 | 1:500 |
| NKX6.1 抗体 | DSHB | F55A12 | 1:500 |
| NKX2.2 抗体 | DSHB | 74.5A5 | 1:100 |
| NEUROD1 抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1084 | 1:100 |
| 胰岛素抗体 | Dako | A0564 | 1:2,000 |
| C肽抗体 | DSHB | GN-ID4-c | 1:2,000 |
| 胰高血糖素抗体 | Sigma-Aldrich | G2654 | 1:1,000 |
参考文献
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