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方法文章

小鼠淋巴细胞标记 64铜-抗体受体靶向 在体实验 细胞迁移的PET/CT成像

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DOI：

10.3791/55270

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2017年4月29日

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1Werner Siemens Imaging Center, Department of Preclinical Imaging and Radiopharmacy, Eberhard Karls University Tübingen, 2Department of Dermatology, Eberhard Karls University Tübingen

本文内容

摘要

在完成制备后 64铜修饰的单克隆抗体结合转基因小鼠T细胞受体，T细胞被放射性标记 体内，进行细胞活力、功能、标记稳定性及凋亡分析后，过继转移至具有气道迟发型超敏反应的小鼠体内，通过正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（PET/CT）进行无创成像。

摘要

本方案阐述了64Cu的制备、单克隆抗体（mAb）的螯合剂偶联与放射性标记，随后进行小鼠淋巴细胞培养以及64Cu-抗体对细胞表面受体的靶向结合。体外评估放射性标记物的性质，并通过PET/CT在气道迟发型超敏反应（DTHR）动物模型中进行非侵入性的体内细胞示踪。

详细展示了单克隆抗体与螯合剂1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸（DOTA）的偶联过程。在放射性标记之前 64Cu，描述了DOTA偶联单克隆抗体的放射性标记。接着，描述了鸡卵清蛋白（cOVA）特异性CD4+ 分泌干扰素（IFN）-γ的辅助性T细胞（cOVA-TH1）及其后续对cOVA-TH1细胞的放射性标记如图所示。多种 体外 技术用于评估以下影响 64细胞的铜放射性标记，例如通过台盼蓝排斥法测定细胞活力、使用Annexin V进行流式细胞术检测凋亡，以及通过干扰素-γ酶联免疫吸附试验（ELISA）评估细胞功能。此外，文中详细描述了细胞对放射性物质的摄取及标记稳定性的测定方法。本方案还介绍了如何在气道迟发型超敏反应（DTHR）动物模型中开展细胞示踪研究，因此包含了在BALB/c小鼠中诱导cOVA诱导的急性气道DTHR的方法。最后，提供了一套完整的PET/CT工作流程，涵盖图像采集、重建与分析。

这 64铜-抗体受体靶向方法通过受体的后续内化作用，与常用的细胞标记PET示踪剂相比，具有更高的特异性和稳定性，细胞毒性更低，外排速率更小。 例如64铜-丙酮醛双(N4-甲基缩硫脲)64Cu-PTSM)。最后，我们的方法实现了非侵入性 体内 通过PET/CT进行细胞追踪，可在48小时内实现最佳的信噪比。该实验方法可推广应用于具有可内化膜结合受体的不同动物模型和细胞类型。

引言

非侵入性细胞追踪是一种多功能工具，可用于在体内监测细胞功能、迁移和归巢。in vivo。近期的细胞追踪研究主要集中在再生医学中的间充质1,2或骨髓来源的干细胞3、炎症中的自体外周白细胞，以及用于癌症过继性细胞治疗的T淋巴细胞3,4。阐明基于细胞治疗的作用位点及其背后的生物学原理具有重要意义。CD8+细胞毒性T淋巴细胞、基因工程改造的嵌合抗原受体（CAR）T细胞或肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）被广泛视为金标准。然而，肿瘤相关抗原特异性的TH1细胞已被证明是一种有效的替代治疗选择4,5,6,7。

作为炎症、器官特异性自身免疫性疾病（例如，类风湿性关节炎或支气管哮喘）以及癌症免疫治疗中备受关注的细胞，TH1细胞的时间分布和归巢模式的表征至关重要。通过PET进行的非侵入性体内成像是一种定量且高度敏感的方法8，可用于研究细胞迁移模式、体内归巢过程，以及T细胞在炎症、过敏、感染或肿瘤排斥反应中的作用部位和应答情况9,10,11。

临床上， 111铟-草酰胺肟（In-oxine）用于白细胞闪烁显像，以鉴别炎症与感染12，而2-脱氧-2-(18F)氟代-D-葡萄糖（18F-FDG 常用于PET细胞示踪研究3,13然而，这种PET示踪剂的一个主要缺点是放射性核素的半衰期较短 18在过继性细胞转移后较晚时间点成像时，由于脂肪酸在109.7分钟时的信号衰减以及细胞内稳定性较低，限制了成像效果。对于长期 体内 尽管在细胞中不稳定，但可通过PET进行细胞示踪研究 64Cu-PTSM 常用于非特异性标记细胞14,15 对T细胞活力和功能的不利影响降至最低16.

本方案描述了一种利用T细胞受体（TCR）特异性放射性标记单克隆抗体（mAb）进一步降低对细胞活力和功能不利影响的方法。首先，介绍了放射性同位素64Cu的制备过程、将单克隆抗体KJ1-26与螯合剂DOTA偶联，以及随后的64Cu放射性标记步骤。其次，详细描述了来自DO11.10供体小鼠的cOVA-TH1细胞的分离与扩增，以及使用负载64Cu的DOTA偶联单抗KJ1-26（64Cu-DOTA-KJ1-26）对细胞进行放射性标记的过程。文中还展示了通过剂量校准仪测定放射性摄取值、通过γ计数测定放射性外排情况，以及利用台盼蓝排斥法评估64Cu放射性标记对细胞活力的影响、通过IFN-γ ELISA评估细胞功能性的方法。为实现非侵入性的体内细胞示踪，进一步描述了构建cOVA诱导的急性气道迟发型超敏反应（DTHR）小鼠模型、过继性细胞转移后采用PET/CT进行成像的操作流程。

此外，这种标记方法可应用于不同的疾病模型、具有不同TCR的小鼠T细胞，或具有膜结合受体或持续膜穿梭相关的表达标志物的其他目标细胞17。

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方案

安全注意事项：操作放射性物质时，应将64Cu存放于厚度为2英寸的铅砖后方，并对所有盛装放射性物质的容器使用相应的屏蔽防护。使用适当的工具间接操作未屏蔽的放射源，避免手部直接接触，以最大限度减少放射性物质的暴露。操作时务必佩戴辐射剂量监测徽章和个人防护装备，并定期检查自身及工作区域是否存在污染，一旦发现应立即处理。在离开使用放射性物质的区域前，应丢弃可能被污染的个人防护装备。放射性废物须整体存放于铅屏蔽后，直至放射性64Cu衰变完毕（约10个半衰期 = 127小时），方可进行妥善处置。

1. 64Cu 的制备

注意：放射性同位素 64Cu 是通过 64Ni(p,n)64使用PETtrace回旋加速器通过改进的McCarthy方案进行铜核反应 等18.

  1. 用于生产64Cu时，将电镀在铂/铱板（90/10）上的64Ni用12.4 MeV质子束以30 µA电流辐照6小时。
  2. 在专用的聚醚醚酮（PEEK）腔室内将铂/铱靶加热至100 °C，并加入2 mL浓盐酸孵育20分钟，以溶解64Cu/64Ni。
  3. 再加入1 mL浓盐酸，孵育10分钟。
  4. 用氩气流蒸发盐酸，并将腔室冷却至室温。
  5. 用3 mL含4% 0.2 M HCl和96%甲醇（v/v）的溶液冲洗腔室，并将该溶液转移至已用甲醇中含4% 0.2 M HCl预处理至少15分钟的离子交换柱中。流出液可用于回收64Ni。
  6. 用甲醇中含4% 0.2 M HCl的溶液洗涤柱中保留的64Cu。
  7. 用70% 1.3 M HCl/30%异丙醇（v/v）将64Cu洗脱至收集小瓶中，在氩气流下蒸发溶液，并让小瓶冷却至室温。
  8. 将64Cu溶于140–210 µL的0.1 M HCl中。

2. 抗体与DOTA的偶联及随后的64Cu放射性标记

注意：螯合剂 DOTA 将通过 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯化学法与单克隆抗体（mAb）的功能性氨基连接，随后使用 64Cu19 对偶联产物进行放射性标记。

  1. 将KJ1-26-mAb的浓度调整至8 mg/mL，并对1 mL单克隆抗体溶液进行透析，透析缓冲液为0.1 M Na2HPO4 pH 7.5 条件下，使用截留分子量为 30 kDa 的离心过滤装置，并加入 1.2 g/L 螯合离子交换树脂进行处理。随后用 14 mL 缓冲液进行 3 次洗涤。最后一次洗涤后，再次将溶液浓缩至 1 mL。通过 OD 测定抗体浓度280 nm 测量。
  2. 使用超纯水或PCR级水在使用前立即配制浓度为10 mg/mL的DOTA-NHS溶液。打开瓶盖前让试剂瓶恢复至室温，以避免冷凝水产生，并用塑料刮勺小心取出DOTA-NHS。将216 µL该DOTA-NHS溶液加入8 mg透析后的KJ1-26-mAb溶液中，充分混匀后，在4 °C下于旋转混合仪中孵育24小时。
  3. 使用截留分子量为30 kDa的离心过滤装置，将DOTA-KJ1-26-mAb对经1.2 g/L螯合离子交换树脂处理的0.25 M醋酸铵缓冲液（pH 7.0）进行透析过滤。进行7次洗涤步骤。将单克隆抗体浓缩至终体积1 mL，并再次通过光密度法测定蛋白质浓度280 nm 测量。
  4. 在放射性标记之前，将 DOTA-KJ1-26-mAb 的缓冲液置换为 PBS 通过 使用凝胶过滤柱进行尺寸排阻色谱。此步骤还可去除潜在的小分子杂质。
  5. 制备100 MBq 64CuCl2 用10 mM HCl溶解，并用10倍浓度磷酸盐缓冲液（10x PBS）调节pH至6-7。加入200 µg DOTA-KJ1-26-mAb，于37 °C孵育60分钟。
  6. 为质量控制，使用 0.1 M 柠檬酸钠（pH 5）作为流动相进行薄层色谱分析，并通过放射自显影进行检测。至少应有 90% 的放射活性与抗体结合，因而出现在起始点位置。未结合的放射活性会被基于柠檬酸盐的流动相螯合并沿溶剂前沿拖尾。作为参考，可使用 64CuCl2 建议。

3. 鸡卵清蛋白特异性 TH1（cOVA-TH1）细胞的分离与扩增

注意：TH1 细胞的培养方法依据先前已发表的研究16,17。

  1. 从 DO11.10 小鼠中分离脾脏和腹腔外淋巴结（LNs）。
    1. 根据联邦法规处死小鼠。用 70% 乙醇对动物进行消毒，并用胶带固定，以便取出脾脏和淋巴结。做正中切口，并通过向两侧牵拉将皮肤与腹膜分离。
    2. 定位颈淋巴结、腋窝淋巴结、臂淋巴结和腹股沟淋巴结。用钝头镊子将其取出，并置于含 1% 胎牛血清（FCS）/PBS 缓冲液的容器中。
    3. 打开腹膜并找到脾脏。将脾脏从胰腺和结缔组织中分离出来，放入 1% FCS/PBS 缓冲液中。如需进一步指导，请参见参考文献20,21。
  2. 使用注射器活塞将脾脏和淋巴结通过 40 µm 滤膜研磨至 50 mL 螺口管中。用 10 mL 1% FCS/PBS 缓冲液冲洗滤膜。
  3. 以 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。随后加入氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液（每只供体动物 1.5 mL），室温孵育 5 分钟以裂解红细胞。每只供体动物加入 8.5 mL 1% FCS/PBS 缓冲液。
  4. 以 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。用 10 mL 1% FCS/PBS 缓冲液洗涤细胞，以 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
  5. 进行磁性细胞分选时，将细胞重悬于 1% FCS/PBS 缓冲液中，并加入 CD4+ 微珠。缓冲液体积和 CD4+ 微珠用量请参照生产商说明书。
  6. 4 °C 孵育 20 分钟。然后加入 1% FCS/PBS 缓冲液至总体积达 50 mL，以 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
  7. 按照生产商方案，使用商用磁性分离柱和相应磁力架继续进行 CD4+ T 细胞的分离。将洗脱得到的 CD4+ T 细胞用含 10% 热灭活 FCS、2.5% 青霉素/链霉素、1% HEPES 缓冲液、1% MEM 氨基酸、1% 丙酮酸钠和 0.2% 2-巯基乙醇的杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）调整至浓度为 106 个细胞/mL，并在 4 °C 下保存。
  8. 用 50 mL 螺口管收集流穿液以制备受体呈递细胞（APCs）。将流穿液以 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
  9. 加入 10 µg/mL 抗 CD4 抗体（克隆号：Gk1.5）、10 µg/mL 抗 CD8 抗体（克隆号：5367.2）、10 µg/mL 小鼠抗大鼠单克隆抗体（MAR18.5）以及 1.5 mL 兔补体。37 °C 孵育 45 分钟。
  10. 以 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，加入 3 mL 培养基。使用 γ 射线或 X 射线源对 APCs 进行总剂量为 30 Gy 的照射。之后将 APCs 调整至浓度为 5 × 106 个细胞/mL。
  11. 在 96 孔板中每孔加入 100 µL CD4+ T 细胞和 100 µL APCs，并加入 10 µg/mL cOVA 323-339 肽段、10 µg/mL 抗 IL-4 单克隆抗体、0.3 µM CPG1668 寡核苷酸和 5 U/mL IL-2。
  12. 每隔两天添加 50 U/mL IL-2。3–4 天后，将细胞从 96 孔板转移至 24 孔板。将 96 孔板中的 3–5 个孔的细胞合并至 24 孔板的一个孔中。加入含 100 U/mL IL-2 的培养基，按 1:1 比例稀释。
  13. 再培养 2–3 天后，将细胞从 48 孔板转移至 175 cm2 细胞培养瓶（每瓶对应一个 48 孔板）。按 1:1 比例补充培养基。每隔两天添加 50 U/mL IL-2。
  14. 根据细胞密度进行传代，并每隔两天添加 50 U/mL IL-2。以此方式继续培养细胞约 10 天。

4. cOVA-TH1 细胞的放射性标记

注意：将 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb 应用于培养的 cOVA-TH1 细胞，以实现细胞内放射性标记。

  1. 用于cOVA-TH1细胞放射性标记时，吸取37 MBq的放射性标记物 64使用无死体积的注射器，通过活度计测量 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb。加入 1 mL 生理盐水，配制成 37 MBq/mL 的溶液。
  2. 将cOVA-TH1细胞重悬于培养基中，浓度为2 × 106 细胞/mL，并将0.5 mL细胞悬液加入48孔板的每个孔中。
  3. 加入20 µL新鲜配制的37 MBq/mL溶液 64将Cu-DOTA-KJ1-26-mAb溶液加入48孔板的每孔中。标记的最终比例为每10个细胞0.7 MBq6 520 µL 体积中的细胞。在 37 °C、7.5% CO 条件下孵育2 30 分钟
  4. 孵育后，轻轻重悬每孔中的细胞，并将细胞悬液从48孔板转移至50 mL螺口管中。为尽量减少细胞损失，用预热的培养基冲洗每个孔。
  5. 将cOVA-TH1细胞悬液在400 × g离心5分钟，弃上清，用10 mL预热的PBS重悬细胞。取部分细胞悬液用于细胞计数。重复洗涤步骤。
  6. 用台盼蓝染色法对cOVA-TH1细胞进行适当稀释后计数活细胞。
  7. 将细胞浓度调整至 5 x 107 细胞/mL，用于腹腔内（i.p.）注射 107 200 µL PBS 中的细胞
  8. 重复步骤 4.3–4.5，用逐渐增加的放射性活度对 cOVA-TH1 细胞进行放射性标记， 例如，每10个1.4 MBq或2.1 MBq6 细胞
    1. 以每 10 个细胞 1.4 MBq 的剂量对细胞进行放射性标记6 细胞，使用 40 µL 的 37 MBq/mL 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb 溶液，取 60 µL 用于与 2.1 MBq（每 10）进行放射性标记6 细胞。分别使用 0.7 MBq、1.4 MBq 和 2.1 MBq 执行步骤 4.3–4.7 64Cu-PTSM，但为进行比较研究，将标记时间延长至3小时17.
    2. 进入第5步以确定最佳活性量。

5. 体外 评估放射性标记对cOVA-TH1细胞的影响

注意：通过台盼蓝排斥法检测 TH1 细胞的活力，IFN-γ ELISA 检测其功能，PE-Annexin V 染色检测细胞凋亡的诱导，以表征放射性标记对 TH1 细胞的影响16,17。下文还描述了细胞内放射性摄取和外排的测定方法。作为对照，也可使用 64Cu-PTSM 标记的 cOVA-TH1 细胞。

  1. 台盼蓝排斥法对细胞活力的影响
    1. 调整至少 18 x 106 cOVA-TH1 细胞用 0.7 MBq/10 标记放射性同位素6 细胞，1.4 MBq/106 细胞和 2.1 MBq/106 细胞分别稀释至浓度为 2 x 106 细胞/mL，并对每种活性剂量执行步骤 5.1.2–5.1.7。使用非放射性标记的 KJ1-26-mAb 标记的 cOVA-TH1 细胞和未标记的 cOVA-TH1 细胞作为对照。
    2. 将1 mL细胞溶液移液至24孔板的9个孔中。
    3. 在初次放射性标记后3小时，将3个孔中的内容物分别收集到3个15 mL螺口离心管中。
    4. 用预热的培养基冲洗现已空置的孔，以尽量减少细胞损失，并将培养基加入至步骤 5.1.3 中对应的 15 mL 螺口管中。
    5. 将15 mL离心管在400 × g下离心5分钟，并将所得细胞沉淀重悬于1 mL预热的培养基中。
    6. 分别对每个15 mL离心管中的细胞用台盼蓝计数活细胞和死细胞，并计算活细胞百分比。
    7. 在转染后24小时和48小时重复步骤5.1.3–5.1.6 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb 放射性标记
  2. 通过IFN-γ ELISA测定对功能的影响
    注意：为了评估……的影响 64使用商品化试剂盒进行IFN-γ ELISA，以检测Cu-DOTA-KJ126-mAb放射性标记对IFN-γ产生的影响作为功能性的指标，并参见参考文献17获取更多细节。
    1. 分散 105 96孔板中每孔100 µL培养基含活细胞，接种后3小时 64使用0.7 MBq、1.4 MBq或2.1 MBq的Cu-DOTA-KJ1-26对cOVA-TH1细胞进行放射性标记。使用未标记的、非放射性的KJ1-26-mAb标记的或 64以Cu-PTSM标记的cOVA-TH1细胞作为对照。
    2. 刺激 IFN-γ 在 10 中的产生5 64用 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb 标记的 cOVA-TH1 细胞置于 100 µL 培养基中，含 10 µg/mL cOVA 肽、5 U/mL IL-2 及 5×105 在37 °C、7.5% CO₂条件下，将APC置于100 µL培养基中孵育24小时2其他对照组可设置为未添加cOVA肽的其他条件。
    3. 根据制造商说明书，采用ELISA分析上清液。
    4. 在标记程序后的24 h和48 h重复步骤5.2.2至5.2.3。
  3. 通过PE-Annexin V染色结合流式细胞术检测细胞凋亡的诱导
    注意：为了评估细胞凋亡的诱导作用 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb 放射性标记，使用市售的流式细胞术试剂盒，并按照生产商说明书制备细胞样本，随后用 Annexin V 染色以检测细胞膜上磷脂酰丝氨酸的暴露情况。
    1. 在3、24和48小时后 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb 对 cOVA-TH1 细胞的放射性标记，至少设三个重复染色样本，每样本不少于 106 64根据制造商说明书，使用Annexin V试剂盒对Cu-DOTA-KJ1-26-mAb标记的cOVA-TH1细胞进行染色，并在接下来的一小时内完成分析。使用非放射性KJ1-26-mAb标记的 64Cu-PTSM标记的和未标记的cOVA-TH1细胞作为对照。更多细节请参见参考文献17。
  4. 摄取与外排
    注意：摄取 64使用剂量校准仪测量细胞内 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb 的摄入量，并在放射性标记后 0、5、24 和 48 小时通过 γ 计数测定法检测放射性物质的外排情况。
    1. 准备10个用于γ计数的试管 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb标记的cOVA-TH1细胞、相应的上清液及洗涤步骤。
    2. 转移 106 64将放射性标记后的Cu-DOTA-KJ1-26-mAb标记的cOVA-TH1细胞以每管1 mL培养基加入十个γ计数管中。在放射性标记后的5、24和48小时三个时间点，每个时间点至少保留10个7 6437 °C、7.5% CO₂ 培养箱中，在24孔细胞培养板的培养基内培养经 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb 标记的 cOVA-TH1 细胞2.
    3. 以400 × g离心γ计数管5分钟，将上清液转移至10个新的γ计数管中。
    4. 用1 mL培养基洗涤细胞一次，以去除未结合部分 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb 并将上清液收集至十个新的 γ 计数管中。
    5. 向cOVA-TH1细胞中加入1 mL新鲜培养基，并在剂量校准仪中测定初始摄取值。试管也可置于37 °C、7.5% CO₂的培养箱中保存2.
    6. 在5、24和48小时后重复步骤5.4.2至5.4.5，并根据制造商说明书使用γ计数器测量所有试管。为校正放射性衰变并进行定量分析，需使用含有已知放射性剂量的标准品。

6. OVA诱导的急性气道迟发型超敏反应

注意：将在cOVA诱导的气道迟发型超敏反应（airway-DTHR）动物模型中，对过继转移并放射性标记的cOVA-TH1细胞向炎症部位迁移的动力学行为和归巢模式进行可视化观察与定量分析16,17。

  1. 通过腹腔注射（i.p.）将 150 µL 氢氧化铝凝胶与 50 µL cOVA 溶液（10 µg 溶于 50 µL PBS 中）的混合物注入 8 周龄 BALB/c 小鼠体内，以进行免疫。
  2. 免疫后两周，通过腹腔注射（i.p.）给予 100 mg/kg 氯胺酮和 5 mg/kg 赛拉嗪对小鼠进行麻醉。将实验小鼠仰卧放置，缓慢将 100 µg cOVA 溶于 50 µL PBS 中的溶液滴入动物鼻腔。动物将逐滴吸入该溶液。
  3. 24 小时后重复一次。如需更强的气道迟发型超敏反应（DTHR）诱导效果，可在 48 小时后再次重复。
  4. 为分析过继转移的 cOVA-TH1 细胞的特异性迁移，可使用火鸡或雉鸡 OVA 作为对照诱导气道 DTHR。因此，使用相应的 OVA 蛋白重复步骤 6.1–6.3。

7. 在体 内 使用PET/CT进行成像

注意：体内成像显示，经64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb标记的cOVA-TH1细胞在cOVA-DTHR疾病小鼠及其对照同窝小鼠中的归巢具有特异性，并可观察到cOVA-TH1细胞的迁移动态。因此，在过继性细胞转移后3、24和48小时，依次获取静态PET扫描和解剖学CT扫描。

  1. 放射性标记后立即调节 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb标记的cOVA-TH1细胞至5 × 107 细胞/毫升用于 i.p. 注射107 200 µL 中的细胞
  2. 使用1 mL注射器和30号针头，吸取200 µL的溶液 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb标记的cOVA-TH1细胞悬液并注射细胞 腹腔注射 到第4天时，将cOVA-DTHR患病动物th 和 5th 乳头。为确定注射的总放射活性量，需在注射前后使用剂量校准仪测量注射器。
  3. 在预期摄取时间前10分钟，将小鼠置于温控麻醉箱中，使用1.5%异氟烷与100%氧气（流速：0.7 L/min）进行麻醉。
  4. 同时，为了在图像分析过程中便于PET与CT图像的共同配准，固定含有玻璃毛细管 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb 溶液或游离态 64CuCl2 小鼠笼床下方的溶液
    1. 因此，配制浓度为0.37 MBq/mL的溶液，并用该溶液填充体积为10 µL的玻璃毛细管。由于细胞来源的放射性信号本身较弱，切勿使用高放射性活度，以确保标记物不会干扰小鼠体内细胞来源的信号。
  5. 当小鼠达到手术耐受状态（以 hind limb 趾部回缩反射消失为标志）后，将其转移至配备合适管路系统的 PET 与 CT 兼容小型动物床中，以维持麻醉状态。
  6. 使用棉签和手术胶带将小鼠固定在小动物固定床上。涂抹眼膏以防止眼睛干燥。
  7. 将小鼠床转移至PET扫描仪中，以肺部为中心调整视野位置，并在350–650 keV能量窗范围内采集20分钟静态PET扫描图像。
  8. 将小鼠垫转移至CT扫描仪中。通过定位像，将视野中心对准肺部。在360°旋转过程中，通过360次投影采集一张平面CT图像 "步进与拍摄" 模式设置为曝光时间350 ms，二分之一像素合并因子为4。

8. 图像分析

  1. 采用统计迭代有序子集最大期望（OSEM）二维算法对PET列表模式数据进行重建，并将CT扫描数据融合为体素尺寸为75 µm的三维图像。
  2. 在合适的图像分析软件中进行图像配准例如 使用Inveon Research Workplace或Pmod时，采用自动配准工具。若自动配准失败，则以小鼠床下方的玻璃毛细管为参考，在轴向、冠状面和矢状面视图中对重建的PET和CT图像进行空间配准。
  3. 使用放射性衰变定律和放射性核素的半衰期对 PET 图像进行放射性衰变校正 64在12.7小时的Cu条件下。进行图像归一化时，选择一幅图像（A）作为参考，使用相应的图像分析软件调整图像显示的强度。
    1. 利用刚设定的参考图像（A）的放射性活度（A）及其他图像的放射性活度（X），使用以下公式对其他图像进行归一化：（注入活度（X）/注入活度（A））× 强度值（A）。
  4. 在肺部及胸腺周围淋巴结的标准化PET信号上勾画三维感兴趣区域（VOI）。
  5. 确定每厘米的注射剂量百分比3 %ID/cm3) 使用以下公式计算：（VOI 内平均放射活性 / 小鼠整体放射活性）× 100。有关图像分析的进一步指导，请参见参考文献22,23.

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结果

图1 总结了用cOVA-TH1细胞标记的 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb 及实验设计 体外 和 体内 本方案涵盖的研究。

放射性标记流程图：从CD4+ T细胞分离到PET/CT分析用于受体研究
图1： 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb 标记过程 & 实验设计 (A放射性细胞标记的示意图 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb。该 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb 与 TH1 细胞表面...

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讨论

本方案介绍了一种稳定标记细胞放射性同位素的可靠且简便的方法 体内 通过PET进行追踪。利用该方法，分离并扩增cOVA-TH1细胞 体外 来自供体小鼠的细胞，可用放射性同位素标记 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb 的归巢被追踪至肺部和胸腺周围淋巴结，这些部位是cOVA诱导的急性气道迟发型超敏反应（DTHR）中cOVA呈递的位点。

使用螯合剂对单克隆抗体（mAb）进行修饰时，需要快速高效地操作，并使用不含胺类痕量杂质的超纯溶液。为确保DOTA-NHS活性酯能够有效与mAb的胺基残基结合，所有溶液均经过螯合离子交换树脂处理。与非特异性细胞标记试剂相比，将螯合剂偶联的mAb作为细胞内放射性标记物具有多项优势。首先，mAb具有优异的特异性，可实现对特定细胞群体的靶向标记。mAb本身无细胞毒性，对细胞的存活率或功能无不良影响。其次，细胞内放射性外排显著减少，从而提高了PET图像的信噪比17,24。通过选择具有不同...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Julia Mannheim 博士、Walter Ehrlichmann、Ramona Stumm、Funda Cay、Daniel Bukala、Maren Harant 以及 Natalie Altmeyer 在实验和数据分析过程中提供的支持。本研究得到了维尔纳·西门子基金会、德国研究基金会（通过 SFB685 项目 B6）和 Fortüne（2309-0-0）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
HCl，超纯级Merck，德国达姆施塔特1.0031864Cu 制备
甲醇，超纯级Merck，德国达姆施塔特1.0600764Cu 制备
异丙醇，超纯级Merck，德国达姆施塔特1.010464Cu 制备
Pt/Ir（90/10）板Ögussa定制64Cu 制备
PEEK 反应室WKL定制64Cu 制备
64NiChemotrade64Cu 制备
Polygram SIL G/UV 254 薄层板Macherey-Nagel80502164Cu 制备
离子交换柱BioRadAG1-X864Cu 制备
PETtrace 固体靶系统WKL定制64Cu 制备
64Cu 后处理模块WKL定制64Cu 制备
放射性活度计CapintecCRC-25R
PETtrace 回旋加速器通用电气医疗系统
DOTA-NHSMacrocyclicsB-280DOTA 偶联
抗 cOVA-TCR 抗体（KJ1-26）由杂交瘤细胞培养分离DOTA 偶联
Na2HPO4Sigma-Aldrich71633DOTA 偶联
H+ Chelex 100Sigma-AldrichC7901DOTA 偶联
Amicon Ultra-15 滤膜离心管Merck MilliporeUFC910008DOTA 偶联
Rotipuran 超纯水Carl RothHN68.3DOTA 偶联
乙酸铵Sigma-Aldrich32301DOTA 偶联
PBS蒂宾根大学DOTA 偶联
Micro Bio-spin P-6 层析柱Bio-Rad Laboratories7326221DOTA 偶联
柠檬酸钠Sigma-Aldrich71497DOTA 偶联
Cyclone Plus 磷光成像仪 Perkin-ElmerL2250116DOTA 偶联
DMEMMerck Millipore102568T 细胞培养基组分 
FCSMerck MilliporeS0115/1004BT 细胞培养基组分 
丙酮酸钠Merck MilliporeL0473T 细胞培养基组分 
MEM 氨基酸Merck MilliporeK0293T 细胞培养基组分 
HEPES Merck MilliporeL 1613T 细胞培养基组分 
 青霉素/链霉素Merck MilliporeA2212T 细胞培养基组分 
0.05 mM 2-β-巯基乙醇Sigma-AldrichM3148T 细胞培养基组分 
DO11.10 小鼠本单位繁育TH1 细胞培养
DPBSGibco14190144TH1 细胞培养
40 µm 细胞筛 Corning352340TH1 细胞培养
ACK 裂解缓冲液Lonza10-548ETH1 细胞培养
CD4 微珠，小鼠Miltenyi Biotech130-097-145TH1 细胞培养
QuadroMACS 分离器Miltenyi Biotech130-090-976TH1 细胞培养
LS 柱Miltenyi Biotech130-042-401TH1 细胞培养
抗 CD4 抗体（Gk1.5）由杂交瘤细胞培养分离TH1 细胞培养
抗 CD8 抗体（5367.2）由杂交瘤细胞培养分离TH1 细胞培养
抗大鼠抗体（MAR18.5）由杂交瘤细胞培养分离TH1 细胞培养
兔补体 MAtebu-BioCL3221TH1 细胞培养
抗 IL-4 抗体（11B11）由杂交瘤细胞培养分离TH1 细胞培养
cOVA 323-339 肽 EMC-micro-collections定制订购TH1 细胞培养
CPG1668 寡核苷酸Eurofins MWG Operon定制订购TH1 细胞培养
IL-2诺华65483-116-07TH1 细胞培养
96 孔板Greiner 655180TH1 细胞培养
24 孔板Greiner 662160TH1 细胞培养
细胞培养瓶Greiner 660175TH1 细胞培养
48 孔板Greiner 677 180细胞标记
Gammacell 1000Best Theratronics通过 咨询 
Gulmay RT225Gulmay通过 咨询 
台盼蓝Merck MilliporeL6323体外 评估
小鼠 IFN-γ ELISABD Biosciences558258体外 评估
PE Annexin V 凋亡检测试剂盒 BD Biosciences559763体外 评估
5 mL 管Sarstedt55.476体外 评估
圆底管 BD Biosciences352008体外 评估
Wizard γ 计数器Perkin-Elmer2480-0010体外 评估
ELISA 读板仪 MultiscanEX赛默飞世尔科技51118177体外 评估
显微镜Leica通过 咨询 体外 评估
BD LSRII BD Biosciences通过 咨询 体外评估
BALB/c 小鼠查尔斯河028体内 细胞迁移
氢氧化铝凝胶Serva Electrophoresis12261.01体内 细胞迁移
赛拉嗪Bayer HealthCare通过大学医院订购通过 大学医院体内 细胞迁移
氯胺酮Ratiopharm通过大学医院订购通过 大学医院体内 细胞迁移
异氟烷CP-Pharma通过大学医院订购通过 大学医院体内 细胞迁移
30 G 针头BD Biosciences304000体内 细胞迁移
注射器BD Biosciences11612491体内 细胞迁移
10 µL 毛细管VWR612-2439
Inveon PET 扫描仪西门子医疗已停产体内 细胞迁移，替代厂商：Bruker，Mediso 
Inveon SPECT/CT 扫描仪西门子医疗已停产体内 细胞迁移
Inveon 研究工作站西门子医疗图像分析，替代软件：Pmod

参考文献

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铜-64抗体细胞迁移PET/CTDOTA螯合剂偶联CD4阳性T细胞分离放射性抗体摄取活体细胞示踪PET/CT图像采集迟发型超敏反应模型淋巴细胞归巢模式
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