在完成制备后 64铜修饰的单克隆抗体结合转基因小鼠T细胞受体，T细胞被放射性标记 体内，进行细胞活力、功能、标记稳定性及凋亡分析后，过继转移至具有气道迟发型超敏反应的小鼠体内，通过正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（PET/CT）进行无创成像。
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摘要
摘要
本方案阐述了64Cu的制备、单克隆抗体（mAb）的螯合剂偶联与放射性标记，随后进行小鼠淋巴细胞培养以及64Cu-抗体对细胞表面受体的靶向结合。体外评估放射性标记物的性质，并通过PET/CT在气道迟发型超敏反应（DTHR）动物模型中进行非侵入性的体内细胞示踪。
详细展示了单克隆抗体与螯合剂1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸（DOTA）的偶联过程。在放射性标记之前 64Cu，描述了DOTA偶联单克隆抗体的放射性标记。接着，描述了鸡卵清蛋白（cOVA）特异性CD4+ 分泌干扰素（IFN）-γ的辅助性T细胞（cOVA-TH1）及其后续对cOVA-TH1细胞的放射性标记如图所示。多种 体外 技术用于评估以下影响 64细胞的铜放射性标记，例如通过台盼蓝排斥法测定细胞活力、使用Annexin V进行流式细胞术检测凋亡，以及通过干扰素-γ酶联免疫吸附试验（ELISA）评估细胞功能。此外，文中详细描述了细胞对放射性物质的摄取及标记稳定性的测定方法。本方案还介绍了如何在气道迟发型超敏反应（DTHR）动物模型中开展细胞示踪研究，因此包含了在BALB/c小鼠中诱导cOVA诱导的急性气道DTHR的方法。最后，提供了一套完整的PET/CT工作流程，涵盖图像采集、重建与分析。
这 64铜-抗体受体靶向方法通过受体的后续内化作用，与常用的细胞标记PET示踪剂相比，具有更高的特异性和稳定性，细胞毒性更低，外排速率更小。 例如64铜-丙酮醛双(N4-甲基缩硫脲)64Cu-PTSM)。最后，我们的方法实现了非侵入性 体内 通过PET/CT进行细胞追踪，可在48小时内实现最佳的信噪比。该实验方法可推广应用于具有可内化膜结合受体的不同动物模型和细胞类型。
引言
非侵入性细胞追踪是一种多功能工具，可用于在体内监测细胞功能、迁移和归巢。in vivo。近期的细胞追踪研究主要集中在再生医学中的间充质1,2或骨髓来源的干细胞3、炎症中的自体外周白细胞，以及用于癌症过继性细胞治疗的T淋巴细胞3,4。阐明基于细胞治疗的作用位点及其背后的生物学原理具有重要意义。CD8+细胞毒性T淋巴细胞、基因工程改造的嵌合抗原受体（CAR）T细胞或肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）被广泛视为金标准。然而，肿瘤相关抗原特异性的TH1细胞已被证明是一种有效的替代治疗选择4,5,6,7。
作为炎症、器官特异性自身免疫性疾病（例如，类风湿性关节炎或支气管哮喘）以及癌症免疫治疗中备受关注的细胞，TH1细胞的时间分布和归巢模式的表征至关重要。通过PET进行的非侵入性体内成....
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方案
安全注意事项：操作放射性物质时，应将64Cu存放于厚度为2英寸的铅砖后方，并对所有盛装放射性物质的容器使用相应的屏蔽防护。使用适当的工具间接操作未屏蔽的放射源，避免手部直接接触，以最大限度减少放射性物质的暴露。操作时务必佩戴辐射剂量监测徽章和个人防护装备，并定期检查自身及工作区域是否存在污染，一旦发现应立即处理。在离开使用放射性物质的区域前，应丢弃可能被污染的个人防护装备。放射性废物须整体存放于铅屏蔽后，直至放射性64Cu衰变完毕（约10个半衰期 = 127小时），方可进行妥善处置。
1. 64Cu 的制备
注意：放射性同位素 64Cu 是通过 64Ni(p,n)64使用PETtrace回旋加速器通过改进的McCarthy方案进行铜核反应 等18.
- 用于生产64Cu时，将电镀在铂/铱板（90/10）上的64Ni用12.4 MeV质子束以30 µA电流辐照6小时。
- 在专用的聚醚醚酮（PEEK）腔室内将铂/铱靶加热至100 °C，并加入2 mL浓盐酸孵育20分钟，以溶解64Cu/64Ni。 ....
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结果
图1 总结了用 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb 及其实验设计 体外 和 体内 本方案涵盖的研究
图1： 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb 标记过程 & 实验设计。 (A放射性细胞标记的示意图 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb。该 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb 可结合 TH1 细胞表面的 cOVA-TCR.......
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讨论
本方案介绍了一种稳定标记细胞放射性同位素的可靠且简便的方法 体内 通过PET进行追踪。利用该方法，分离并扩增cOVA-TH1细胞 体外 来自供体小鼠的细胞，可用放射性同位素标记 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb 的归巢被追踪至肺部和胸腺周围淋巴结，这些部位是cOVA诱导的急性气道迟发型超敏反应（DTHR）中cOVA呈递的位点。
使用螯合剂对单克隆抗体（mAb）进行修饰时，需要快速高效地操作，并使用不含胺类痕量杂质的超纯溶液。为确保DOTA-NHS活性酯能够有效与mAb的胺基残基结合，所有溶液均经过螯合离子交换树脂处理。与非特异性细胞标记试剂相比，将螯合剂偶联的mAb作为细胞内放射性标记物具有多项优势。首先，mAb具有优异的特异性，可实现对特定细胞群体的靶向标记。mAb本身无细胞毒性，对细胞的存活率或功能无不良影响。其次，细胞内放射性外排显著减少，从而提高了PET图像的信噪比17,24。通过选择具有不同.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Julia Mannheim 博士、Walter Ehrlichmann、Ramona Stumm、Funda Cay、Daniel Bukala、Maren Harant 以及 Natalie Altmeyer 在实验和数据分析过程中提供的支持。本研究得到了维尔纳·西门子基金会、德国研究基金会（通过 SFB685 项目 B6）和 Fortüne（2309-0-0）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| HCl，超纯级 | Merck，德国达姆施塔特 | 1.00318 | 64Cu 制备 |
| 甲醇，超纯级 | Merck，德国达姆施塔特 | 1.06007 | 64Cu 制备 |
| 异丙醇，超纯级 | Merck，德国达姆施塔特 | 1.0104 | 64Cu 制备 |
| Pt/Ir（90/10）板 | Ögussa | 定制 | 64Cu 制备 |
| PEEK 反应室 | WKL | 定制 | 64Cu 制备 |
| 64Ni | Chemotrade | 64Cu 制备 | |
| Polygram SIL G/UV 254 薄层板 | Macherey-Nagel | 805021 | 64Cu 制备 |
| 离子交换柱 | BioRad | AG1-X8 | 64Cu 制备 |
| PETtrace 固体靶系统 | WKL | 定制 | 64Cu 制备 |
| 64Cu 后处理模块 | WKL | 定制 | 64Cu 制备 |
| 放射性活度计 | Capintec | CRC-25R | |
| PETtrace 回旋加速器 | 通用电气医疗系统 | ||
| DOTA-NHS | Macrocyclics | B-280 | DOTA 偶联 |
| 抗 cOVA-TCR 抗体（KJ1-26） | 由杂交瘤细胞培养分离 | DOTA 偶联 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | 71633 | DOTA 偶联 |
| H+ Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | DOTA 偶联 |
| Amicon Ultra-15 滤膜离心管 | Merck Millipore | UFC910008 | DOTA 偶联 |
| Rotipuran 超纯水 | Carl Roth | HN68.3 | DOTA 偶联 |
| 乙酸铵 | Sigma-Aldrich | 32301 | DOTA 偶联 |
| PBS | 蒂宾根大学 | DOTA 偶联 | |
| Micro Bio-spin P-6 层析柱 | Bio-Rad Laboratories | 7326221 | DOTA 偶联 |
| 柠檬酸钠 | Sigma-Aldrich | 71497 | DOTA 偶联 |
| Cyclone Plus 磷光成像仪 | Perkin-Elmer | L2250116 | DOTA 偶联 |
| DMEM | Merck Millipore | 102568 | T 细胞培养基组分 |
| FCS | Merck Millipore | S0115/1004B | T 细胞培养基组分 |
| 丙酮酸钠 | Merck Millipore | L0473 | T 细胞培养基组分 |
| MEM 氨基酸 | Merck Millipore | K0293 | T 细胞培养基组分 |
| HEPES | Merck Millipore | L 1613 | T 细胞培养基组分 |
| 青霉素/链霉素 | Merck Millipore | A2212 | T 细胞培养基组分 |
| 0.05 mM 2-β-巯基乙醇 | Sigma-Aldrich | M3148 | T 细胞培养基组分 |
| DO11.10 小鼠 | 本单位繁育 | TH1 细胞培养 | |
| DPBS | Gibco | 14190144 | TH1 细胞培养 |
| 40 µm 细胞筛 | Corning | 352340 | TH1 细胞培养 |
| ACK 裂解缓冲液 | Lonza | 10-548E | TH1 细胞培养 |
| CD4 微珠，小鼠 | Miltenyi Biotech | 130-097-145 | TH1 细胞培养 |
| QuadroMACS 分离器 | Miltenyi Biotech | 130-090-976 | TH1 细胞培养 |
| LS 柱 | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | TH1 细胞培养 |
| 抗 CD4 抗体（Gk1.5） | 由杂交瘤细胞培养分离 | TH1 细胞培养 | |
| 抗 CD8 抗体（5367.2） | 由杂交瘤细胞培养分离 | TH1 细胞培养 | |
| 抗大鼠抗体（MAR18.5） | 由杂交瘤细胞培养分离 | TH1 细胞培养 | |
| 兔补体 MA | tebu-Bio | CL3221 | TH1 细胞培养 |
| 抗 IL-4 抗体（11B11） | 由杂交瘤细胞培养分离 | TH1 细胞培养 | |
| cOVA 323-339 肽 | EMC-micro-collections | 定制订购 | TH1 细胞培养 |
| CPG1668 寡核苷酸 | Eurofins MWG Operon | 定制订购 | TH1 细胞培养 |
| IL-2 | 诺华 | 65483-116-07 | TH1 细胞培养 |
| 96 孔板 | Greiner | 655180 | TH1 细胞培养 |
| 24 孔板 | Greiner | 662160 | TH1 细胞培养 |
| 细胞培养瓶 | Greiner | 660175 | TH1 细胞培养 |
| 48 孔板 | Greiner | 677 180 | 细胞标记 |
| Gammacell 1000 | Best Theratronics | 通过 咨询 | |
| Gulmay RT225 | Gulmay | 通过 咨询 | |
| 台盼蓝 | Merck Millipore | L6323 | 体外 评估 |
| 小鼠 IFN-γ ELISA | BD Biosciences | 558258 | 体外 评估 |
| PE Annexin V 凋亡检测试剂盒 | BD Biosciences | 559763 | 体外 评估 |
| 5 mL 管 | Sarstedt | 55.476 | 体外 评估 |
| 圆底管 | BD Biosciences | 352008 | 体外 评估 |
| Wizard γ 计数器 | Perkin-Elmer | 2480-0010 | 体外 评估 |
| ELISA 读板仪 MultiscanEX | 赛默飞世尔科技 | 51118177 | 体外 评估 |
| 显微镜 | Leica | 通过 咨询 | 体外 评估 |
| BD LSRII | BD Biosciences | 通过 咨询 | 体外评估 |
| BALB/c 小鼠 | 查尔斯河 | 028 | 体内 细胞迁移 |
| 氢氧化铝凝胶 | Serva Electrophoresis | 12261.01 | 体内 细胞迁移 |
| 赛拉嗪 | Bayer HealthCare | 通过大学医院订购通过 大学医院 | 体内 细胞迁移 |
| 氯胺酮 | Ratiopharm | 通过大学医院订购通过 大学医院 | 体内 细胞迁移 |
| 异氟烷 | CP-Pharma | 通过大学医院订购通过 大学医院 | 体内 细胞迁移 |
| 30 G 针头 | BD Biosciences | 304000 | 体内 细胞迁移 |
| 注射器 | BD Biosciences | 11612491 | 体内 细胞迁移 |
| 10 µL 毛细管 | VWR | 612-2439 | |
| Inveon PET 扫描仪 | 西门子医疗 | 已停产 | 体内 细胞迁移，替代厂商：Bruker，Mediso |
| Inveon SPECT/CT 扫描仪 | 西门子医疗 | 已停产 | 体内 细胞迁移 |
| Inveon 研究工作站 | 西门子医疗 | 图像分析，替代软件：Pmod |
参考文献
- Cerri, S., et al. Intracarotid Infusion of Mesenchymal Stem Cells in an Animal Model of Parkinson's Disease, Focusing on Cell Distribution and Neuroprotective and Behavioral Effects. Stem Cells Trans Med. 4 (9), 1073-1085 (2015).
- Hasenbach, K., et al.
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