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方法文章

发展 绿僵菌 作为一种真菌杀虫剂：从分离到田间表现

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DOI：

10.3791/55272

⸱

2017年7月30日

 ,  , 
1Biochemical Sciences Division, CSIR-National Chemical Laboratory

本文内容

摘要

本文报道了基于知识开发高效真菌杀虫剂所涉及的不同阶段，包括分离、鉴定、筛选和选择最适昆虫病原真菌——金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae），用于防治农业害虫。

摘要

开发商业真菌杀虫剂时，一个主要问题是其杀虫速度相较于化学杀虫剂较慢。因此，分离和筛选具有快速作用且高毒力的昆虫病原真菌是关键步骤。昆虫病原真菌，例如 绿僵菌，白僵菌， 和 诺穆雷亚，通过接触起效，比 苏云金芽孢杆菌 或核型多角体病毒（NPV），该病毒必须被害虫摄入。在本研究中，我们分离出68 绿僵菌 采用土壤稀释与诱饵法从感染昆虫中分离菌株。通过扩增并测序ITS1-5.8S-ITS2和26S rDNA区域对分离菌株进行鉴定。其中毒力最强的菌株为 Metarhizium anisopliae 基于中位致死浓度（LC50）和时间（LT50在针对三龄幼虫的昆虫生物测定中获得的结果 棉铃虫 采用固态发酵法（SSF），以大米为底物，对所选菌株进行孢子的大规模生产，发酵周期为14天。使用0.1%吐温-80从产孢生物量中提取孢子，并制备不同剂型的孢子制剂。对这些制剂开展了田间试验，用于防治 H. armigera 采用随机区组设计在木豆上进行害虫防治试验。油基和水基制剂的防治效果分别为78.0%和70.9%，优于化学杀虫剂的63.4%。

引言

自20世纪40年代在印度引入有机氯农药以来，农药的使用量已增长了数倍1，而农作物害虫每年仍因农业产量损失造成数十亿卢比的经济损失2。合成农药的广泛且非合理使用持续对环境和人类健康构成威胁1。农药的滥用导致土壤中残留物积累，并使害虫的天然天敌减少。此外，它还对害虫种群施加强大的选择压力，促使其遗传结构发生改变，从而导致抗药性的产生1。尽管绿色革命带来了巨大效益，但其高度依赖化肥和农药等投入品；即便如此，害虫仍是农业生产中主要的生物限制因素。据普遍估计，印度每年记录的农作物损失约为120亿美元2，全球则高达2万亿美元3。

当化学杀虫剂在用于控制害虫时产生有害影响时，寻找生态友好、可靠、经济且可持续的替代方法就变得至关重要。生物防治提供了一种合适的替代方案，包括利用寄生生物、捕食性生物以及微生物病原体4。例如，真菌已知可感染多种昆虫害虫，包括鳞翅目、膜翅目、鞘翅目和双翅目昆虫，常引发自然流行病。此外，与其他细菌性和病毒性昆虫控制剂不同，昆虫病原真菌的作用方式为接触性感染5。这类真菌包含100多个属的异质性类群，已在不同昆虫中报道约750个物种。重要的真菌病原体包括：Metarhizium sp.、Beauveria sp.、Nomuraea rileyi、Lecanicillium lecanii 和 Hirsutella sp. 等6。M. anisopliae (Metchnikoff) Sorokin 是生物防治中应用最广泛的第二种昆虫病原真菌，已知可侵染超过200种昆虫7。

本研究介绍了利用M. anisopliae进行基于知识的真菌杀虫剂开发所涉及的不同阶段，包括：1）寻找强毒力昆虫病原真菌的来源（即土壤或感病昆虫），2）昆虫病原真菌的鉴定与筛选，3）在实验室生物测定及田间条件下维持其毒力和有效性的策略，4）感染性繁殖体的低成本制剂开发，5）针对强毒力制剂建立独特的质量控制参数，以及6）生物勘探与附加值提升。

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方案

1. 昆虫病原真菌的分离

  1. 土壤稀释法
    1. 从不同农田采集土壤样品及僵虫（表1）。采用土壤稀释平板法分离土壤样品中的昆虫病原真菌8。
      注：本研究中，样品采自印度马哈拉施特拉邦的浦那（18°31'13''N；73°51'24''E）和布尔达纳（19°58'36''N；76°30'30''E）地区。
    2. 称取每份土壤样品10 g，分别加入90 mL无菌0.1%（w/v）吐温-80溶液中。
    3. 使用磁力搅拌器充分搅拌样品60分钟，以释放附着在土壤颗粒上的孢子。
    4. 搅拌后，取每份样品100–200 µL涂布于选择性培养基上，培养基成分（g/L）如下：蛋白胨10；葡萄糖20；琼脂18；链霉素0.6；四环素0.05；放线菌酮0.05；多菌灵0.1 mL；pH 7.09。将平板置于28 °C培养3–7天。
    5. 挑取单个产孢菌落，在相同培养基上进行转接纯化，获得纯培养物。
  2. 从僵虫中分离
    1. 从田间采集僵虫。
      注：虫体坚硬的死虫通常由昆虫病原真菌感染所致；而细菌或病毒感染导致的死虫虫体较软。
    2. 采集行为异常、运动不协调、抽搐的活虫。
    3. 将采集的活虫饲养至死亡，随后转移至湿润培养盒中，在28 °C、70–80%相对湿度条件下继续培养，以促进可能的真菌感染和产孢。
    4. 从产孢的僵虫体表刮取孢子，接种至上述选择性培养基上，并在同一培养基上连续转接2–3次，获得纯培养物。
  3. 诱饵法
    1. 在含有60 g土壤样品的小瓶（3.85 × 6.0 cm）中加入4头米蛾幼虫（Corcyra cephalonica），将小瓶置于25 ± 2 °C条件下培养14天。
    2. 每天将小瓶倒置一次。14天后，检查土壤中是否存在被真菌感染的米蛾幼虫。从产孢僵虫上刮取孢子，接种至选择性培养基上，分离昆虫病原真菌。
    3. 获得纯培养物后，将菌株转接至马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）斜面，于28 °C、70–80%相对湿度条件下培养7天，促进孢子形成。产孢完成后，将母种保存于8 °C备用。

2. 昆虫病原真菌的鉴定

  1. 通过观察形态特征鉴定昆虫病原真菌，（即， 无性孢子的大小和形状，以及分生孢子梗上孢子的排列方式）；3个主要属的分离物， 绿僵菌, 球孢白僵菌，以及 诺氏菌属，可以被识别。
  2. 用于分子鉴定的 绿僵菌 菌株，使用DNA提取试剂盒从菌丝体生物量中提取基因组DNA；按照制造商的说明进行操作（参见 材料表). 通过0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的质量。
    1. PCR扩增ITS1-5.8S-ITS2和26S rDNA区域。以基因组DNA为模板，使用ITS1上游引物（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS4下游引物（TCCTCCGCTTATTGATATGC）10.
    2. 使用凝胶回收试剂盒对预期大小的扩增片段进行凝胶洗脱和纯化；按照制造商说明书操作（参见 材料表）定量纯化的扩增产物并进行测序。
    3. 使用软件读取并编辑序列，对核苷酸序列在NCBI GenBank数据库中进行BLAST比对，以分析其高度同源性11.
    4. 将鉴定出的昆虫病原菌分离物序列提交至NCBI GenBank数据库以获取登录号。

3. 筛选 绿僵菌 对抗分离株 H. armigera

  1. 昆虫饲养
    1. 通过从田间采集健康的 H. armigera 幼虫和蛹，建立初始种群。
    2. 饲养时，将幼虫单独置于无菌聚丙烯小瓶（3.85 × 6.0 cm，50 mL 容量）中，瓶内放入经 0.5% (v/v) 次氯酸钠消毒 10 分钟的秋葵片段12。
    3. 收集饲养过程中产下的昆虫卵，并用 0.5% (v/v) 次氯酸钠进行表面灭菌。
    4. 将幼虫维持在 25 ± 2 °C 和 65 ± 5% 相对湿度（RH）条件下。
  2. 昆虫生物测定
    注：在昆虫生物测定、孢子生产及田间表现研究中，除非另有说明，均使用从感染 Metarhizium 的 H. armigera 幼虫中分离得到的菌株的首次转接培养物。
    1. 进行昆虫生物测定时，使用 H. armigera 的三龄幼虫。
    2. 将一组 30 头幼虫设三个重复，分别浸入 10 mL 的 Metarhizium 分离物孢子悬浮液中（1 × 107 孢子/mL，除非另有说明；活力 > 90%）5 秒。
    3. 处理后，将每头幼虫单独转移至无菌小瓶中以避免自相残食。每个小瓶中加入湿润的 Whatman 1 号滤纸和一块消毒过的秋葵作为饲料。每隔一天更换一次滤纸和饲料。
    4. 将幼虫置于 25 ± 2 °C、65 ± 5% RH 及 16:8 光暗周期条件下培养 14 天，或直至其死亡。
    5. 将死亡幼虫转移至含有湿润棉签的无菌培养皿中，置于 28 °C 和 70–80% RH 条件下培养 3–7 天，以促进菌丝和孢子在尸体表面形成。
    6. 对照组处理：将一组 30 头幼虫设三个重复，用含 0.1% (w/v) Tween-80 的无菌蒸馏水处理。
    7. 所有实验均使用新鲜配制的孢子悬浮液，设三个重复。收集并合并三次实验的死亡率数据，计算平均值。使用 Abbott 公式13计算校正死亡率。
    8. 实验采用随机完全区组设计（RCBD），每个处理包含一组 30 头幼虫，设三个重复。根据对 H. armigera 的死亡率，筛选出表现最佳的 Metarhizium 分离物，用于进一步商业化生产的评估。
    9. 选择对 H. armigera 三龄幼虫致死率 >90% 的分离物。
      注：本研究中选出了 12 个分离物。
    10. 测定这些分离物的 LT50，并选择杀虫速度最快（所需时间最短）的分离物。
      注：从 12 个高效分离物中进一步筛选出 5 个。
    11. 使用四种不同浓度的孢子悬浮液（即 1 × 103、1 × 105、1 × 107 和 1 × 109 孢子/mL），测定所选分离物的 LC50 值。
    12. 测定 Metarhizium 分离物对 H. armigera 三龄幼虫的 LC50，以提高识别高死亡率分离物间毒力差异的可能性，若仅使用单一剂量，则此类差异可能被掩盖。

4. 用于田间表现研究的Metarhizium菌株孢子的制备

  1. 通过固态发酵（SSF）生产绿僵菌（Metarhizium）孢子
    1. 进行固态发酵（SSF）时，将 2 × 107 个绿僵菌（Metarhizium）分离株的孢子接种于 200 mL YPG 培养基（0.3% 酵母提取物、0.5% 蛋白胨和 1.0% 葡萄糖）中，制备接种物。将三角瓶置于 28 °C、180 rpm 摇床中培养 48 小时。
    2. 为大规模生产孢子，采用固态发酵（SSF），以大米作为培养基质，除非另有说明。
    3. 进行固态发酵（SSF）时，将 2 kg 大米装入灭菌袋（型号/14，带一个 0.5 µm 微孔滤膜，容量 2 kg，尺寸 64 × 36 cm），向袋中加入 1,000 mL 蒸馏水，浸泡过夜14。将装有浸湿大米的袋子在 121 °C 下高压灭菌 45 分钟15。
    4. 用培养 48 小时的菌丝体接种物（接种量 10%，即每 2 kg 大米使用 200 mL）接种灭菌袋，在 28 °C、70–80% 相对湿度（RH）条件下培养 14 天。
    5. 采用 0.1% Tween-80 溶液进行液体提取以收获孢子。具体操作为：将袋内内容物加入含 0.1% Tween-80 的溶液中（每 1 kg 大米使用 3 L），充分混匀，通过离心法将孢子与液体分离，随后在 37 °C 下干燥 2 天。
    6. 或者，将含有孢子及部分菌丝的大米袋在 37 °C 下干燥 2 天，以降低水分含量（<20%）。使用真菌收获机或振动筛分机收集孢子。
  2. 孢子活力研究
    1. 采用不同方法测定收获孢子的活力百分比15。制备孢子悬浮液，溶剂为 0.1%（w/v）Tween-80，并将孢子浓度调整至 1 × 103 个孢子/mL。
    2. 取 0.1 mL 孢子悬浮液，三份重复，均匀涂布于 PDA 平板上，在 28 °C、70–80% 相对湿度（RH）条件下培养 72 小时。
    3. 人工计数独立菌落，计算相应样品的总活菌数。
  3. 孢子沉降速率
    1. 为实现均匀施用剂量，需获得均一的孢子悬浮液；参照已有方法16测定不同绿僵菌（Metarhizium）分离株的孢子沉降速率。检测孢子在 0.2 M 硫酸铵和 0.1% Tween-80 中的沉降速率。
    2. 将孢子悬浮液的浓度调整至约 7 × 107 个孢子/mL，使初始吸光度在 540 nm 处达到 0.6。将比色皿静置 6 小时，使孢子自然沉降。
    3. 持续记录 6 小时内的吸光度变化。以百分比表示沉降速率，并计算 50% 孢子沉降所需时间（ST50）。使用新鲜配制的孢子悬浮液重复实验三次。

5. 所选材料田间性能研究 M. anisopliae 从分离到控制 H. armigera 在木豆中

  1. 可湿性粉剂配方 M. anisopliae M 34412 孢子
    1. 将孢子与滑石粉混合，配制2.5–5%可湿性粉剂制剂。
    2. 调整最终活菌数（TVC）至 1 x 1012 每千克制剂中的孢子数
  2. 田间性能研究 M. anisopliae M 34412 孢子
    1. 针对所选材料在田间表现的研究 M. anisopliae 分离以进行控制 H. armigera 在木豆中研究虫害发生情况，采用具有四个重复的随机区组设计（RCBD）。
      注：此处实验在马哈特玛·普勒农业大学（MPKV），拉胡里（19.3927° N，74.6488° E）进行。
    2. 使用两种不同的喷雾制剂，一种为孢子的油性制剂（5 x 1012 孢子/3升柴油：葵花籽油，7:3）以及含Tween-80（0.1%）的水剂配方。使用超低容量（ULV）喷雾器喷施油剂配方（70分钟；3升/公顷），使用背负式喷雾器喷施水剂配方（5 × 1012 孢子，500 L/ha。
      注意：此处记录了喷洒前1天以及每次喷洒后3天和7天时5株随机选择植株上的幼虫种群数量。总种群数量经平方根转换（√(n + 1)）后用于统计分析。
      1. 根据木豆作物的农业实践，在产卵后10至15天进行第一次喷洒，之后每隔14天再喷洒两次。喷洒时间应选在印度标准时间16:00至18:00之间。监测风向，必要时使用布帘以防止孢子漂移到邻近试验地块。
    3. 作为对照，使用手压式背负喷雾器喷洒化学杀虫剂。
    4. 通过采集田间样本确定接种物的存留情况 H. armigera 喷洒后0、3、5、7和14天的幼虫
    5. 将这些幼虫持续观察14天，死亡后转移至含有湿润滤纸的塑料小瓶中。在25 ± 2 °C和70 ± 10%相对湿度条件下培养，以观察真菌感染情况。
    6. 根据喷洒后从田间采集的幼虫死亡率数据，确定接种物在幼虫种群中的持效性。
    7. 根据田间试验的防治效果百分率进行评价17豆荚损伤百分率和产量百分率18.
      注：此处的参数数据，如温度、湿度、风速（km/h）、日照时数（h）、降水量（mm）、降雨天数和蒸发量（mm），是在一所农业大学（Mahatma Phule Krushi Vidyapeeth，Rahuri，19.3927° N，74.6488° E）进行试验期间记录的。
  3. 农民参与式项目
    1. 选择进行示范试验的农户数量。向农户提供木豆种子（BSMR-736）及肥料。
      注：本研究共涉及20名农民。村庄：Deolali Pravara（19.473° N，74.6° E）。
    2. 使用与步骤5.2中相同的喷雾制剂和喷雾次数。

6. 对非靶标生物的影响

  1. 观察杀真菌杀虫剂喷雾对木豆叶片的任何影响。
  2. 在每次处理后的1天，分别从未经处理的样地和经过处理的样地中采集土壤中的节肢动物以及栖息在叶片上的昆虫 M. anisopliae.
  3. 用药剂处理后24小时内，用陷阱法采集土壤中的节肢动物，并于处理后的次日上午，用扫网法采集栖息在叶片上的昆虫。即， 处理后约15-18小时）。
  4. 将它们分别置于直径3.5 cm、高4.0 cm的圆柱形塑料盒中。每天检查昆虫的感染情况，并提供适当的食物喂养。
  5. 记录以下项目的存在情况 M. anisopliae（如有可能）分离真菌。

7. 质控参数的确定

  1. 通过在PDA培养基上于28 °C条件下测定孢子萌发率来检查孢子活力。
  2. 测定菌株在YPG和几丁质培养基中产生的角质层降解酶活性，如几丁质酶、几丁质脱乙酰酶、壳聚糖酶、蛋白酶和脂肪酶，方法如前所述15。
  3. 在实验室生物测定中确定对H. armigera的致死率15。
  4. 使用分子标记，如几丁质酶（Chit 1、2 和 4）和蛋白酶（Pr1A）基因的PCR-RFLP图谱，作为M. anisopliae的毒力特征。
    1. 使用DNA提取试剂盒从菌丝体生物量中提取基因组DNA15。以基因组DNA为模板，采用引物对Chit1F/Chit1R（CTCTGCAGGCCACTCTCGGT/AGCCATCTGCTTCCTCATAT）和Chit2F/Chit2R（GACAAGCACCCGGAGCGC/GCCTTGCTTGACACATTGGTAA）扩增Chit1和Chit2基因片段。对于Chit4，使用引物对Chit4F/Chit4R（ATCCGGCAGCACGGCTAC/CTTGGATC CGTCCCAGTTG）。
    2. 扩增Pr1A基因时，使用METPR2和METPR5引物对（AGGTAGGCAGCCAGACCGGC/TGCCACTATTGGCCGGCGCG）。
    3. 使用BsaJI、BstUI和ScrFI对Chit1基因进行限制性酶切19；使用AluI、HpyCH4IV和HpyCH4V对Chit2基因进行酶切；使用BstUI、HaeIII和MboI对Chit4基因进行酶切。对Pr1A 基因的酶切则使用RsaI、DdeI和MspI20。
    4. 通过电泳在1.5%琼脂糖凝胶上观察各基因在高毒力菌株（>90%致死率）中的限制性片段长度多态性（RFLP）图谱；该图谱可作为筛选M. anisopliae毒力菌株的分子标记。

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结果

在研究过程中，不同的菌株 绿僵菌，白僵菌，以及 球孢虫草属 通过多种分离方法进行分离（数据未显示）6,14 作为 绿僵菌 菌株在控制方面效果更佳 H. armigera一种豆类作物的严重害虫6,14，进一步的分离旨在分离 绿僵菌 来自不同农田和昆虫的菌株（表1。总计68 绿僵菌 通过培养特征、形态特征以及ITS 1-5.8S-ITS 4测序对获得的分离株进行鉴定。根据 >90%死亡率 H. armigera 在实验室生物测定中，12 绿僵菌 分离物进一步检测了孢子产生能力、存活率、LC50，LT50和 ST50. 表 2 描...

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讨论

19世纪80年代，首次尝试利用Metarhizium防治鳃金龟Anisoplia austriaca以及甜菜象甲Cleonis punctiventris21。在该方案中，一个先决条件是从土壤或感病昆虫中分离出具有强毒力的菌株。事实上，其他参数如LC50、LT50和ST50也显著影响产品的成本效益22,23。为了优化孢子的生产，需在孢子数量、存活率和毒力之间维持一种精细的平衡24。

由于农业属于高产量、低成本的产业，孢子的质量认知度、终端用户的可接受性以及货架期是主要关注点。宿主特异性有助于避免对非靶标生物产生影响14。避免在人工培养基上反复继代培养，并偶尔通过昆虫宿主传代，可维持绿僵菌（Metar...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢印度新德里生物技术部与瑞士伯尔尼发展与合作署共同支持的印瑞生物技术合作项目（ISCB）中各位合作者的贡献。感谢参与真菌杀虫剂研发工作的项目学生及工作人员，包括 Vandana Ghormade、Pallavi Nahar、Priya Yadav、Shuklangi Kulkarni、Manisha Kapoor、Santosh Chavan、Ravindra Vidhate、Shamala Mane 和 Abhijeet Lande。EKP 感谢印度大学拨款委员会提供的研究奖学金，SGT 感谢印度科学与工业研究理事会（CSIR）提供的研究奖学金。MVD 感谢印度新德里工业与科学研究理事会通过名誉科学家计划提供的支持。作者感谢印度新德里生物技术部在 ISCB 和 SBIRI 项目下提供的经费支持。我们感谢审稿人所提出的宝贵意见。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂Hi-MediaRM666试剂
硫酸铵 Thomas Baker11645试剂
DNA分析仪 Applied BiosystemABI prism 3730  仪器
DNA提取试剂盒Qiagen69104试剂
多菌灵Sigma45466试剂
凝胶回收试剂盒Qiagen28604试剂
葡萄糖Hi-MediaGRM077试剂
Knapsac 喷雾器KaypeeHY-16L (1004)仪器
蛋白胨Hi-MediaRM006-500G试剂
聚丙烯小瓶 LaxbroSV-50塑料器皿
马铃薯葡萄糖琼脂（PDA） Hi-MediaM096-500G试剂
吐温-80SRL28940试剂
超低容量喷雾器MatabiINSECDISK仪器
Unicorn袋 UnicornUP-140024-SMBSSF用可高压灭菌袋
酵母提取物Hi-MediaRM027-500G试剂
Chromas 2.1软件

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