一种用于估计永久性脑缺血中风发作时间的磁共振成像方案

摘要

本文描述了一种利用定量磁共振成像（qMRI）参数在大鼠脑卒中模型中估算脑卒中发病时间的实验方案。该方法采用扩散磁共振成像来界定急性期脑卒中病灶，并结合定量T₁和T₂（qT₁和qT₂）弛豫时间对脑卒中发生时间进行推断。

摘要

磁共振成像（MRI）通过检测脑组织水分子扩散系数的降低，提供了一种敏感且特异的急性缺血性脑卒中影像学检测工具。在缺血性脑卒中的大鼠模型中，缺血病灶区（以低扩散为特征）与对侧非缺血半球之间的定量T₁和T₂ MRI弛豫时间（qT₁和qT₂）差异随卒中发生后的时间延长而逐渐增大。MRI弛豫时间差异的时间依赖性可通过线性函数进行经验性描述，从而为卒中发生时间提供简单估算。此外，缺血病灶内异常qT₁和qT₂的体积随时间呈线性增长，为卒中时间判断提供了另一种互补方法。本文介绍了一种基于量化扩散系数的（半）自动化计算机程序，用于在大鼠缺血模型中界定急性缺血性卒中组织。该程序还可测定qT₁和qT₂弛豫时间的半球间差异，以及病灶内异常qT₁和qT₂体素的位置与体积。基于qT₁和qT₂ MRI数据对发病时间估算的不确定性在卒中发生后的前5小时内为±25分钟至±47分钟。最精确的发病时间估算可通过量化异常qT₁与qT₂病灶体积的重叠部分（称为“V^overlap”，±25分钟）实现，或仅通过量化qT₂弛豫时间的半球间差异（±28分钟）获得。总体而言，源自qT₂的参数性能优于qT₁参数。当前MRI方案已在永久性局灶性脑缺血模型的超急性期阶段进行了验证，可能不适用于短暂性局灶性脑缺血情况。

引言

由于脑组织高度依赖氧化磷酸化来合成ATP，且能量储备有限，因此对缺血特别敏感。缺血会导致细胞内和细胞外空间发生细微的、随时间变化的离子改变，进而引起脑内水分池的重新分布、兴奋性毒性神经递质的释放，最终触发破坏性过程¹。在局灶性缺血中，如果未能在一定时间窗内恢复血流，组织损伤将从初始核心区域向外扩展²。目前，卒中发病时间是临床决定缺血性卒中药物治疗（包括使用溶栓药物实现再通）的关键标准之一³。因此，许多患者由于发病时间不明确而自动被排除在溶栓治疗之外，常见原因包括卒中发生在睡眠期间（“醒后卒中”）、缺乏目击者或对症状无意识^4,5。因此，亟需一种能够确定卒中发病时间的方法，以便将这类患者纳入溶栓治疗的考虑范围。

磁共振成像（MRI）探测活体内的水分子。in vivo 水分子的动态在急性缺血性能量衰竭时受到严重干扰⁶。最显著的是，由于能量衰竭，水分子在平移（热）运动中所遵循的扩散过程在缺血早期即受到抑制⁷。这继而导致神经细胞发生缺氧性去极化⁸。扩散加权磁共振成像（DWI）已成为急性脑卒中的金标准诊断影像技术⁹。DWI信号在缺血发生后迅速增强，从而可识别缺血组织，但在缺血性脑卒中最初数小时内不表现出时间依赖性¹⁰。同样，水分子扩散的定量指标，如表观扩散系数（ADC）或扩散张量的迹（D_av），在缺血组织中也迅速降低，但在动物脑卒中模型¹⁰和患者中¹¹，这些指标与脑卒中发作后的时间无明显关联。

定量磁共振成像（qMRI）弛豫参数 qT₁、qT₂ 和 qT_1ρ 受水分子中氢原子的旋转运动及其交换过程的调控，在脑组织发生缺血性能量衰竭后，这些参数在脑实质中表现出复杂的时间依赖性变化⁶。此类随时间变化的特征使得研究人员能够在患者¹²以及缺血动物模型^13,14,15中估算卒中发生时间。在大鼠局灶性卒中模型中，qT_1ρ 在缺血发生后几乎立即升高，并在至少6小时内呈线性持续上升^13,14。qT₁ 弛豫时间在缺血脑组织中也以时间依赖的方式增加，其变化可用两个时间常数描述：初始的快速相，随后是持续数小时的缓慢相^8,16。由于这种双相性增加，qT₁ 在卒中时间推断中的应用可能比 qT_1ρ MRI 更为复杂¹⁵。qT₂ 弛豫时间在大鼠局灶性卒中中也呈现双相性变化，即在最初一小时内出现短暂缩短，随后随时间呈线性增加¹³。初始的缩短可由两个并行发生的因素解释：（i）脱氧血红蛋白积聚所导致的所谓“负性血氧水平依赖效应”；（ii）细胞外水向细胞内空间转移^17,18。qT₂ 随时间的增加很可能是由于细胞毒性水肿和/或血管源性水肿，以及随后细胞内大分子结构的破坏所致¹⁸。qT_1ρ 和 qT₂ 数据均可在临床前模型中准确估算卒中发生时间¹⁴。在临床实践中，qT₂¹² 以及 T₂ 加权信号强度^19,20 也已被用于卒中发生时间的推断。

除了定量弛豫时间在半球间的差异外，缺血区域内弛豫时间升高的空间分布也可能作为卒中发病时间的替代指标¹⁴。在卒中大鼠模型中，qT_1ρ、qT₂ 和 qT₁ 弛豫时间升高的区域最初小于由扩散成像定义的缺血病灶，但随时间逐渐扩大^14,15,21。因此，将弛豫时间升高区域的空间分布量化为缺血病灶大小的百分比，也可用于估算卒中发病时间^14,15。本文描述了利用定量磁共振成像（qMRI）参数在大鼠卒中模型中确定卒中发病时间的实验方案。

方案

动物实验遵循欧洲共同体理事会指令86/609/EEC指南，并经芬兰库奥皮奥东芬兰大学动物护理与使用委员会批准。

1. 动物模型

1. 使用面罩通过 N₂/O₂ 气流（70%/30%）以异氟烷麻醉体重为 300 - 400 g 的雄性 Wistar 大鼠，麻醉持续至手术及 MRI 实验结束。在通风橱内诱导麻醉，并将异氟烷浓度维持在 1.5% 至 2.4% 之间。
   1. 在 MRI 过程中，通过置于躯干下方的气动垫监测呼吸频率，以评估麻醉深度。对夹趾反射无反应被视为外科麻醉深度足够的标志。使用连接至磁体孔道的异氟烷废气清除装置。
2. 实施永久性大脑中动脉闭塞（MCAO）以诱导局灶性缺血性脑卒中。采用血管内线栓法进行 MCAO，并依照 Longa et al.²² 所述方法进行操作。
   1. 将闭塞用线栓（硅化 PTFE 处理的单丝尼龙丝，直径 0.22 mm）保留在原位，直至 MRI 实验结束。
3. 使用血气分析仪检测动脉血气和 pH 值。
   1. 在 MRI 过程中，使用置于躯干下方的气动垫监测呼吸频率，并使用直肠温度监测系统监测直肠温度。通过躯干下方的水浴加热垫将核心体温维持在接近 37 °C 的水平。
   2. MCAO 后立即将大鼠固定于磁体孔道中心的托架上，并使用大鼠头部固定装置固定头部。在将大鼠送入磁体孔道前，经腹腔注射 2 mL 生理盐水。

2. 磁共振成像

1. 使用配备主动去耦线性体积发射线圈和正交接收线圈对的控制台，连接至9.4T/31 cm（带12 cm梯度插入件）水平磁体，采集MRI数据。
2. 在MCAO术后最多扫描每只大鼠5小时。在每小时时间点（MCAO术后60、120、180、240分钟），采集12个一致采样的冠状面切片，包括扩散张量迹（2.2.1）、Carr-Purcell-Meiboom-Gill T₂（2.2.2）和快速低角度激发T₁（2.2.3）图像（切片间隙0.5 mm，切片厚度=1 mm，视野=2.56 cm × 2.56 cm）。
   1. 获取扩散张量迹图像（D_av = 1/3 trace [D]），沿每个轴施加三个双极梯度，并采用三个b值（0、400和1400 s/mm²），其中Δ = 15 ms，∂ = 5 ms，回波时间（TE）= 36 ms，重复时间（TR）= 4000 ms，采集时间= 7.36 min。
   2. 获取用于T₂定量的Carr-Purcell-Meiboom-Gill T₂序列，包含12个回波，回波间隔= 10 ms，TR = 2000 ms，采集时间= 4.20 min。
   3. 获取用于T₁的快速低角度激发（FLASH）序列，其中从反转脉冲到第一个FLASH序列的时间（T₁₀）为7.58 ms，以10次反转为一组，每次增加600 ms，直至5407.58 ms，TR = 5.5 ms，反转脉冲间歇时间（T_relax）= 10 s，采集时间= 8.20 min。

3. 图像处理

1. 弛豫度和ADC图的计算：计算qT₂，qT₁ 并使用布里斯托大学网站提供的Matlab函数[DOI:10.5523/bris.1bjytiabmtwqx2kodgbzkwso0k]生成ADC图，该函数的输入为MRI数据所在位置的文件路径。
   1. 对于 T₂ 数据，在图像重建之前于k空间应用汉明滤波（或在图像域通过卷积实现，结果等效但计算效率较低）。计算qT₂ 通过取每个时间序列的对数，并在体素基础上采用线性最小二乘法求解来生成图谱（也可对 T 进行双指数拟合）₂ 衰减，但体素层面的F检验表明，图像中某些体素无法用额外参数加以解释。
   2. 对于 T₁ 数据，在图像重建之前，于k空间应用汉明滤波。执行T₁ 根据参考文献中所述方法进行拟合 ²³为了解决由于使用幅值图像导致的符号未知问题，可在拟合过程中排除最低强度点，或对其进行估计，两种方法均可获得相似结果。
   3. 对于扩散加权数据，通过在图像域内进行卷积应用汉明滤波（由于k空间轨迹为分段式，此方法更为直接）。采用以下方法拟合ADC图：¹³.
2. 缺血组织的鉴定
   1. 在对侧 D 上识别缺血组织_av 图像（1/D）_av) 因为这能为病灶识别提供清晰的对比度。为生成缺血性感兴趣体积（VOI），将缺血组织定义为全脑1/D值中位数以上一个中位绝对偏差的体素。_av 分布。为了确定非缺血半球中的同源区域，将缺血侧的感兴趣体积（VOI）沿垂直轴进行镜像反射。手动调整非缺血侧的感兴趣体积（VOI），以避免包含含有脑脊液的体素。
   2. 为了确定 qT 的关系₁ 和 qT₂ 随着MCAO后时间的推移，针对每只大鼠及每个时间点，将缺血侧和非缺血侧的感兴趣体积（VOI）加载至qT₁ 和 qT₂ 图谱。提取平均弛豫时间，并计算qT期间的百分比差异₁ 和 qT₂ 半球间差异（ΔT）₁ 和 ΔT₂）使用以下公式：
      
      其中 T_x 是所选参数，qT₁ 或 qT₂. 指缺血感兴趣区域（VOI）的平均弛豫时间 非缺血区域VOI中的平均弛豫时间。应使用非缺血区域VOI，使每只大鼠均作为自身对照。
   3. 使用以下标准来识别 qT 值升高的体素₁ 和 qT₂：缺血感兴趣区域（VOI）内弛豫时间超过qT中位弛豫时间的任何体素₁ 或 qT₂ 非缺血性感兴趣区域（VOI）内的分布超过半高全宽（HWMH）的一半以上。这些标准意味着弛豫时间必须处于95%^th 百分位或更高者被归类为“高”。使用非缺血性感兴趣容积（VOI）的中位弛豫时间，可使每只大鼠自身作为对照。
   4. 为了描绘扩散减少区域内弛豫时间变化的空间分布，识别并用颜色编码具有升高的 qT 的体素₁ 或 qT₂ 以及 qT 值升高的体素₁ 和 qT₂ 称为“qT”₁ 和 qT₂ 重叠
   5. 根据qT确定病灶大小₁ 和 qT₂，计算参数 f（由 Knight 提出） 等 ¹⁸) 来自每只大鼠在每个时间点获取的 MRI 数据。f₁ 和 f₂ 代表具有高 qT 值的体素数量₁ 或 qT₂ （分别）占缺血性感兴趣区域（VOI）大小的百分比。
      1. 使用以下公式计算 f₁ 和 f₂:
         
         何处 指弛豫时间（qT₁ 或 qT₂), 指缺血感兴趣区域（VOI）内“高”弛豫时间体素的数量， 是缺血感兴趣区域（VOI）中“低”弛豫时间体素的数量，且 ，缺血感兴趣区域（VOI）内体素的总数。用于识别 qT 升高体素的标准₁ 和 qT₂ 在第 3.2.3 节中进行了说明。“低”体素是指弛豫时间小于中位数 qT 的体素₁ 或 qT₂ 非缺血性感兴趣区域（VOI）的半高全宽（HWHM）值。减去 可反映由缺血或其他病理状况引起的弛豫时间缩短 ¹⁷. 
      2. 确定 qT 的程度₁ 和 qT₂ 通过计算重叠的升高qT区域的体积来评估‘重叠’程度₁ 和 qT₂ 占全脑体积的百分比，此处称为“V”^重叠。使用以下公式：
         
         其中， 指缺血性感兴趣体积（VOI）内同时具有“高”qT值的体素数量₁ 和“高”qT₂ 和 表示大鼠全脑中体素的总数。通过在 qT 上手动围绕整个大脑创建感兴趣体积（VOI），确定大鼠脑中体素的数量。₂ 弛豫度图谱

4. 使用氯化三苯基四氮唑（TTC）验证缺血性病灶

1. 断头后立即小心地从颅骨中取出大鼠脑组织，并在大鼠断头后10分钟内完成此操作。
2. 将脑组织置于冷藏的0.01 M磷酸盐缓冲液（PBS）中保存，然后使用大鼠脑切片模具将脑组织切成连续的1 mm厚冠状切片。
3. 切片后，按照²⁴的建议，将每片脑组织置于含有TTC的20 mL PBS中，在37 °C避光孵育30分钟。虽然1%的TTC浓度可以接受，但使用0.5%浓度可获得更佳的对比度。
   1. 用铝箔覆盖切片容器以保持避光环境。
4. 孵育结束后，用移液器移除TTC溶液，并用PBS换液三次清洗切片。
5. 立即使用标准光学显微镜和数码相机对切片进行拍照。

5. 统计分析

1. 使用 Matlab 和统计软件进行统计分析。
2. 确定 MR 参数与时间的关系
   1. 对合并的大鼠数据进行 Pearson 相关性分析，以确定 ΔT₁、ΔT_2,、f₁ 和 f₂ 以及V^Overlap 与 MCAO 后时间的关系。
   2. 对于显示显著线性关系的参数（p <0.05），进行线性最小二乘回归分析，以确定是否可通过量化感兴趣参数来预测卒中发作时间。使用均方根误差（RMSE）评估发作时间估计的准确性。
3. 病灶大小的量化
   1. 为根据不同的定量 MRI 参数比较病灶大小，对缺血 VOI 中的平均体素数以及高 qT₁ 和 qT₂ 的平均体素数进行单因素重复测量方差分析（ANOVA）及 Fisher 最小显著差异事后检验。当显著性水平 p <0.05 时认为差异具有统计学意义。若 Mauchly 球形检验显示不满足球形假设，则依据 Greenhouse-Geisser 估计值对自由度和显著性值进行校正。

结果

大鼠的血气分析结果如下：SO₂ 95.8 ± 3.2%，P_aCO₂ 51.6 ± 2.9 mmHg，pH 7.30 ± 0.04。

在MCAO后4个时间点，代表性大鼠中央切片的典型D_av、qT₂和qT₁图像显示在图1a的前三个面板中。图1其他面板中的图像显示了自动检测到的缺血病灶（红色），以及缺血病灶内qT₁升高、qT₂升高和V^overlap区域（绿色）。在MCAO后2小时内，缺血病灶内高qT₁区域显著大于高qT₂区域（p <0.01），但随时间推移逐渐趋同（图1）。在前两小时内，基于D_av定义的缺血病灶也大于高qT₁区域（p <0.05）和高qT₂区域（p <0.05）。

定量磁共振成像（qMRI）参数的时间依赖性如图2所示。所有qMRI参数均为脑卒中发生后时间（ΔT1：R² = 0.71，ΔT₂：R² = 0.75，f₁：R² = 0.53，f₂：R² = 0.82，V^overlap：R² = 0.87）的显著预测因子。根据各参数的均方根误差（RMSE），脑卒中发生时间估计的不确定性分别为：ΔT₁ ± 37 分钟，ΔT₂ ± 28 分钟，f₁ ± 47 分钟，f₂ ± 34 分钟，V^overlap ± 25 分钟。因此，V^overlap 对脑卒中发生时间的估计最为准确。

MCAO术后约6小时对脑组织样本进行TTC染色，证实缺血性损伤主要发生在灰质，且不可逆（图1d）。

图1：一例大鼠缺血性卒中引起的定量MRI参数变化。（a）显示了在4小时缺血期间的定量MRI图像示例。前四列分别为D_av图谱、qT₂图谱、qT₁图谱和T₂加权图像。其余各列展示了以不同方式呈现的自动分割病灶的D_av图谱。第5列中以红色显示自动检测到的D_av病灶。第6列中D_av病灶以红色显示，qT₂值较高的体素以绿色显示。第7列中D_av病灶以红色显示，qT₁值较高的体素以绿色显示。第8列中D_av病灶以红色显示，同时qT₁和qT₂均升高的体素（V^overlap）以绿色显示。（b）显示了MCAO后不同时间点D_av病灶内qT₂的分布情况，以及零时点非病灶区域的qT₂分布。（c）显示了相应的qT₁分布情况，右侧图例同时适用于（b）和（c）两个子图。（d）显示了动物在MCAO后6小时处死后获得的TTC染色脑切片图像。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：MCAO 后时间与反映缺血时序相关 qMRI 参数之间的关系。 （a）显示 f₁，（b）为 f₂，（c）为 V^overlap，（d）为 ΔT₁ ，（e）为 ΔT₂。每项参数的最佳拟合曲线（红色实线）和均方根误差（RMSE）条（黑色实线）已标出。虚线代表接受 MCAO 处理的 5 只大鼠各自的个体数据。 请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

目前用于估计大鼠卒中发作时间的方案采用定量扩散和弛豫时间MRI数据，而非相应加权MR对比图像的信号强度¹⁹。最近的研究表明，图像强度在估计卒中发作时间方面表现较差^14,25。在“扩散阳性”卒中病灶中，我们的MRI方案利用qT₁和qT₂ MRI数据可将卒中发作时间估计的准确度控制在约半小时以内。总体趋势显示，qT₂数据的表现优于qT₁数据。通过升高qT₁与qT₂区域的重叠体积（V^overlap）可获得最佳的发作时间判定准确性。

图像在 图1 表明，尽管表观扩散系数降低较为均匀，但存在异常qT的区域₁ 和 qT₂ 在缺血病灶内呈异质性分布。该发现与既往观察结果一致，可能源于这些定量磁共振成像参数对缺血所致病理生理变化的不同敏感性。 ⁶这表明定量磁共振成像参数可能反映组织状态，并支持弥散加权成像高估缺血性损伤的观点 ²⁶事实上，近期的临床前证据表明，在弥散成像定义的病灶内，缺血性损伤具有异质性 ²⁷因此，扩散、qT 的组合₁ 和 qT₂ 可能提供有关卒中发病时间和组织状态的信息，这两点在临床上对于发病时间未知患者的治疗决策具有重要价值。

V^overlap 和 f₂ 对卒中发病时间的估计最为准确。量化弛豫时间的优势在于，与信号强度不同，弛豫时间不受磁场不均匀性和质子密度等技术因素引起的固有变异的影响⁶，包括缺血病灶内预期的磁场变化¹⁸。qT₁ 和 f₁ 在发病时间估计中的不确定性降低，可能归因于 qT₁ 对缺血的上述双相响应，这导致了 qT₁ 随时间变化的斜率较为平缓^8,15,16。所示 MRI 数据（图 2）与先前研究结果一致^13,14，即缺血脑区与对侧非缺血脑区之间弛豫时间差异的时间进程可由线性函数充分描述。然而，必须指出的是，缺血所引起的潜在血流动力学变化并非线性^1,18。

当前用于卒中时间评估的MRI方案 采用 Longa 等人的方法建立永久性缺血大鼠模型进行演示 ²²根据我们的经验，Longa等人的手术方法在10-20%的大鼠中无法成功诱导大脑中动脉闭塞（MCAO），然而由于采用表观扩散系数（ADC）来验证缺血的存在，实验可提前终止。MCAO诱导失败通常源于栓塞线不理想。另一个导致实验失败的因素是，MCAO是一种较为剧烈的手术操作，在长时间的磁共振成像（MRI）扫描过程中可能导致高达20%的大鼠死亡。

卒中发作时间方案仅适用于永久性缺血。在大鼠局灶性缺血伴再灌注的情况下，随着D_av 的恢复，D_av与qT₁或qT₂之间的关系将发生解离，但qT₁和qT₂ 是否解离则取决于再灌注前缺血的持续时间^8,28。此外，由于个体间在影响微循环的因素（如年龄和合并症（例如，糖尿病、高血压、心脏病））方面存在差异，卒中患者缺血性损伤的演变过程可能更具变异性。这些因素不可避免地会影响人类卒中中f₁、f₂和V^overlap的时间依赖性，因此需要在临床环境中进行研究。

综上所述，定量磁共振成像（qMRI）参数可提供卒中发病时间的估计值。其中，V^overlap 和 f₂ 提供的估计最为准确，并且可能对组织状态具有提示意义。因此，对于发病时间未知的患者，qMRI 在辅助临床治疗决策方面可能具有重要价值。需要注意的是，大鼠脑组织中灰质与白质的比例远高于人类，且这两类脑组织中的流体动力学特性可能存在差异¹⁸。尽管如此，仍有必要进一步研究 f₂、V^overlap 和 qT₂ 在急性期卒中患者中的时间依赖性变化。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
		磁场强度	工作频率
MRI 扫描仪	Agilent, Santa Clara, CA, USA	9.4T	400.13 MHz
线性体积发射射频线圈	RAPID Biomedical, Rimpar, Germany	-	400.13MHz
主动去耦接收线圈	RAPID Biomedical, Rimpar, Germany	-	400.13MHz
大鼠头部固定器	RAPID Biomedical, Rimpar, Germany
i-Stat 便携式血气分析仪	i-Stat Co, East Windsor, NJ, USA
气动枕式呼吸频率监测仪	SA Instruments Inc, Stony Brook, NY, USA
啮齿类动物直肠温度监测装置	SA Instruments Inc, Stony Brook, NY, USA
名称	公司
化学试剂
异氟烷：Attane Vet 1000mg/g	Piramal Healthcare UK Ltd, Northumberland, UK
2,3,5-三苯基氯化四氮唑 = TTC	Sigma-Aldrich, Gillinham, Dorset, UK